全 文 ：RAPD技术在狼尾草属牧草上的应用①
陈志彤1)② 黄毅斌1)③ 应朝阳1) 潘伟彬1,2)
(1福建省农科院农业生态研究所/福建省山地草业工程技术研究中心 福建福州 350013;
2闽西职业技术学院资源工程系 福建龙岩 364021)
摘 要 应用 RAPD技术对来自福建、江苏、海南等 17个狼尾草属(PennisetumRichard)牧草进行分析。筛选出 5
个能有效体现多态性和重复性的随机引物,并利用 NTSYSpc软件,用类平均法(UPMGA)建立了 17份狼尾草属牧
草的遗传关系聚类图。结果显示:在相似系数 0.68处,17份种质分Ⅰ、Ⅱ两个大簇,第Ⅰ簇 11个品种,第Ⅱ
簇 6个品种。其中 4对狼尾草品系可能存在同种异名的现象。RAPD分析结果与形态学分类基本一致,能很好地
用于狼尾草属牧草种质资源的分析。
关键词 RAPD;狼尾草 ;牧草
分类号 S543
ApplicationofRAPDtoPennisetum,aForageResource
CHENZhitong1) HUANGYibin1) YINGZhaoyang1) PANWeibin1,2)
(1AgriculturalEcologyResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences/FujianEngineering
andTechnologyResearchCenterforHilyPrataculture,Fuzhou,Fujian350013;
2ResourceEngineeringDepartment,MinxiVocationalandTechnicalColege,Longyan,Fujian364021)
Abstract Geneticdiversityof17accessionsofaforageresourcePennisetumfromFujian,Jiangsuand
HainanwereanalyzedbyRAPDtechnique.Selectedwere5randomprimerswhichcouldshowgood
polymorphism andrepeats.UPMGA from NTSYSpcsoftwarewasusedtoestablishamolecular
dendrogramfor17accessionsofPennisetum.Theresultsshowedthatwhenthecoeficientwas0.68,the
17accessionsweredividedintotwogroups:GroupI(including11accessions)andGroupI(including6
accessions).ItisconcludedthatfourpairsofPennisetummaybethesameaccessionwithdiferentname.
TheRAPDproducedmostlythesameresultasthemorphologyclassification.RAPDcanbethususedas
agoodtechniqueforstudyingthegeneticdiversityofPennisetum.
Keywords RAPD;Pennisetum;forage
① 福建省自然基金项目(No.B0510029),热带作物种质资源标准化整理、整合及共享试点(No.2005DKA21000-5-33)。
收稿日期:2008-05-05
责任编辑/曾莉娟 编辑部 E-mail:rdnk@chinajournal.net.cn或 rdnk@163.com
② 陈志彤(1979～),男,硕士,助理研究员。主要从事牧草育种及分子生物学研究。E-mail:crczt@163.com。
③ 通讯作者。黄毅斌(1964～),男,研究员,博士,从事南方草业与生态农业研究。
Vol.28,No.4
2008年 8月 热 带 农 业 科 学
CHINESEJOURNALOFTROPICALAGRICULTURE
第 28卷第 4期
Aug.2008
狼尾草属(PennisetumLC.Richard)牧草是热带
亚热带和温带地区的重要牧草,它是一年生或多年
生禾本科牧草,全世界约有 80种,多数原产于非
洲[1]。我国人工栽培利用的种主要有多年生的象草
(P.purpureumSchumacher)、一年生的美洲狼尾草
[P.americarum(Linnaeus)Leeke＝P.glaucum(Lin-
naeus)R.Brown]及其杂交种杂交狼尾草(美洲狼尾
草×象草)和热研4号王草(象草×美洲狼尾草)。杂交狼
尾草兼有象草的高产和美洲狼尾草的品质优、适口
性好等优点,并且适应性强、生长迅速、寿命长,
营养丰富,深受广大养殖场主的欢迎,是福建省乃
至热带、亚热带地区重要的刈割型优良牧草。
RAPD作为一种成熟的分子标记技术,在品种
鉴定、分类研究、系谱分析、遗传图谱构建、突变
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2008年 8月 第 28卷第 4期热带农业科学
编号 品 系 名 称 拉 丁 名 样品来源 资源类型
S1 杂交狼尾草 P.americanum×P.purpureum 江苏省农科院 选育品种
S2 象草(北峰) 暂无 福州北峰 地方品种
S3 细茎杂交狼尾草 暂无 福州北峰 地方品种
S4 紫象草 P.purpureum 江苏省农科院 选育品种
S5 矮象草 P.purpureumcv.MOTT 江苏省农科院 选育品种
S6 红象草 暂无 海南 选育品种
S7 象草(N51) P.purpureum 江苏省农科院 选育品种
S8 象草(N85) P.purpureum 江苏省农科院 选育品种
S9 台农1号 暂无 福州北峰 地方品种
S10 台农2号 暂无 福州北峰 地方品种
S11 南牧1号 暂无 福州北峰 地方品种
S12 桂牧1号 P.purpureum×P.americanum 海南 选育品种
S13 台湾甜草 暂无 海南 选育品种
S14 皇竹草 暂无 福建省农科院甘蔗所 地方品种
S15 牧草蔗 暂无 福建省农科院甘蔗所 地方品种
S16 闽牧6号 暂无 福建省农科院生态所 地方品种
S17 巨菌草 暂无 福建农林大学 地方品种
表1 17个狼尾草属牧草品系
体检测、基因定位等遗传、育种领域得到了广泛应
用。但 RAPD技术在牧草研究中的应用起步较晚,
目前主要应用于温带牧草如苜蓿[2]、羊草[Leymus
chinensis(Trinius) Tzvelev][3]、黑 麦 草 (Lolium
perenneLinnaeus)[4]、无芒雀麦草(Bromusinermis
Leysser)、冰 草 [Agropyroncristatum (Linnaeus)
Gaertner][5]等种质资源的遗传多样性分析、亲缘关
系分析、品种及杂种纯度鉴定等。近年来,RAPD
技术应用于狼尾草属牧草的研究也已展开[6,7],为
狼尾草属牧草的遗传多样性分析提供很好的基础,
但针对福建省当地混杂的狼尾草种质资源的分子标
记研究还未见报道。对福建当地狼尾草属牧草以及
省内外引进的狼尾草进行了品比试验及分子标记研
究,以期从不同水平上阐明福建当地狼尾草属牧草
的遗传背景,既可以丰富当地草种资源,又可以避
免盲目引种,从而更好地服务于狼尾草牧草育种工
作,指导青饲料生产,促进草地畜牧业的发展。
1 材料与方法
1.1 植物材料
供试的 17个狼尾草属牧草品系采自江苏省农
科院、海南、福建等地,其中福建品种占大多数,
基本包括了福建省所有狼尾草属牧草品系(表1)。
1.2 DNA的提取
采用改进的CTAB法。取新鲜狼尾草叶片数片,
用液氮研磨,取约0.1g粉状叶片于离心管中,加
入 700μL65℃预热的 CTAB提取缓冲液(100mmol/L
Tris-HCl,20mmol/LEDTA,1.4mol/LNaCl,2%CTAB,临用前
加入 2%β-巯基乙醇),轻轻混匀,加入 1/10体积的
65℃预热饱和酚,轻轻混匀;加入等体积氯仿,混
匀,65℃水浴 30min,并不时轻轻摇动;离心 15
min(12kr/min),取水相;加 0.8倍体积的预冷异丙
醇,-20℃沉淀 DNA30min;离心 10min(12kr/min);
收集沉淀;用 70%乙醇洗涤 DNA沉淀,干燥;加
入 100μL无菌水溶解 DNA;加入 1μL5mg/mL
RNaseA,37℃保温30min;补水300μL,加等倍体
积氯仿∶异戊醇(24∶1),离心,取上清;加 2倍体
积冷冻无水乙醇及 1/10体积 3mol/L醋酸钠,混
匀,-20℃沉淀 DNA过夜;离心 10min(10kr/min),
收集沉淀;用 70%乙醇洗涤 DNA沉淀,干燥,加
入40μLTE缓冲液溶解DNA。
1.3 RAPD引物的筛选
试验所用的引物由上海生工生物工程技术服务
有限公司合成。随机筛选了100个引物。引物筛选
采用混合DNA法,即将不同品种狼尾草DNA混在一
起,以混合DNA作为模板进行引物初筛,选取条带
清晰且多的引物作进一步筛选。
1.4 PCR反应体系
在 EppendorfMaster-
cyclergradientPCR仪上扩
增,扩增程序为94℃ 2min,
37℃ 30s,72℃ 50s,2个
循环;94℃ 45s,37℃ 30
s,72℃ 50s,40个循环;
最后 72℃延伸 5min。PCR
反应体系总体积为 25μL,
其中包含:DNA模板 1μL;
dNTP(2mmol/L)2.5μL;10×
buffer 2.5μL; 引 物 (5
pmol/μL)2μL;MgCl22μL;
Taq酶 0.2μL(5U/μL),用蒸
馏水加足25μL。
1.5 电泳成像
用含 EB的 15g/L琼脂
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陈志彤 等 RAPD技术在狼尾草属牧草上的应用
图1 S30的 RAPD分析电泳图
图2 S38的 RAPD分析电泳图
图3 S48的 RAPD分析电泳图
图4 S119的 RAPD分析电泳图
图5 S257的 RAPD分析电泳图
图6 17种狼尾草属牧草的 RAPD聚类分析系统树状图
糖凝胶电泳检测 DNA,琼脂糖 Agarose购自百泰克
生物技术有限公司,电泳仪电源为安玛西亚
EPS301。在 UVPGDS-8000凝胶成像系统上观察并
贮存图像。
2 结果与分析
2.1 引物筛选结果
采用混合 DNA法,对 100个随机引物进行初
筛,从中筛选出 60个条带较多且清晰的引物,继
而用这60个引物对17个供试材料进行扩增,最后
筛选出扩增多态性、条带清晰的引物5个,编号分
别为S30、S38、S48、S119、S257(图1～5)。
2.2 聚类分析图
通过这 5个引物对供试样品扩增共检测出 32
个位点,其中 25个位点是多态的。根据这 5个引
物对所有供试材料扩增的多态性结果(有带记为1,无
带记为 0),采用 NTSYSpc2.10e软件,并以 UPGMA
对矩阵图进行SAHN聚类分析,建立了17份牧草的
遗传关系聚类图(图6)。
聚类图结果显示,在遗传距离 0.68处,17个
品种(品系)可分为Ⅰ、Ⅱ两个大簇。第Ⅰ簇 11个品
种(品系),主要是象草和杂交狼尾草以及由此选育
出来的品种(品系),包括杂交狼尾草、象草(51)、象
草(85)、象草(北峰)、矮象草、牧草蔗、南牧 1号、
桂牧1号、闽牧6号以及台农1号和2号;第Ⅱ簇
6个品种(品系),包括细茎杂交狼尾草、台湾甜草、
紫象草和红象草以及皇竹草和巨菌草。在遗传距离
0.70处,簇Ⅰ又可分为2个亚簇,其中Ⅰa有9个
品种(品系),包括象草、矮象草、杂交狼尾草、台农
系列以及牧草蔗和闽牧 6号;Ⅰb有 2个品种(品
系),就是南牧 1号和桂牧 1号。第Ⅱ簇还是 6个
品种(品系)。聚类图还说明,17种狼尾草属牧草的
相似系数较大,都在0.66以上,说明17种狼尾草
属牧草遗传距离较近,且 S2和 S8、S5和 S7、S9
和 S10、S14和 S17两两间遗传距离非常近,相似
系数都在 0.97以上,有可能是同一种牧草不同的
名称。
3 讨论
通过 RAPD技术对狼尾草属牧草分析发现,筛
选出的随机引物可以较好地反应狼尾草属牧草的多
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2008年 8月 第 28卷第 4期热带农业科学
态性,并且重复性较好,其试验结果与狼尾草的形
态学特征基本一致,如紫象草与红象草叶片均为红
色,其遗传距离在 RAPD聚类结果也较为接近。从
试验中还发现有4对狼尾草的遗传距离较近,在形
态学特征上相差不大,因此认为有可能是同一种牧
草的不同名称;由福建省农科院选育的闽牧6号在
植株叶形上区别于其它狼尾草品系,从 RAPD遗传
图谱上也能很清楚地区别于其它品系,因此确定为
狼尾草新品系。
RAPD作为一种快速灵敏的分子标记,已广泛
应用于多种植物的种内和种间遗传多样性以及种性
鉴定等方面,并表现出了很强的多态性。生物的遗
传多样性是生物多样性研究的核心,反映了物种的
遗传背景,育种潜力和利用价值,对优良种质的保
护和发掘利用具有重要意义。然而,由于 RAPD技
术所用的随机引物较短,退火温度较低,因此重复
性不好一直是 RAPD技术的一大缺陷,为克服此缺
陷,需要对反应体系进行优化,本试验反应体系筛
选出的几对引物可以很好地体现狼尾草属牧草的多
态性并具有较好的重复性,适合于分析狼尾草属牧
草的遗传多样性,为更好地指导狼尾草育种工作提
供理论基础。
参考文献
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