全 文 ：第 44 卷 第 2 期
2 0 0 8年 2 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol.44 , No.2
Feb., 2 0 0 8
我国部分兰属植物菌根真菌 rDNA ITS 序列分析＊
李潞滨1　胡　陶1　唐　征2　庄彩云1　刘振静1　杨　凯2　彭镇华1
(1.中国林业科学研究院林业研究所　国家林业局林木培育重点实验室　北京 100091;
2.北京农学院农业应用新技术北京市重点实验室　北京 102206)
关键词:　兰属植物;菌根真菌;rDNA ITS 分析;瘤菌根菌;胶膜菌属
中图分类号:S718.81　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-7488(2008)02-0160-05
收稿日期:2007-04-25。
基金项目 :`948 项目(2004-4-26),`948 项目(2005-4-37),北京市属市管高校人才强教计划资助项目。
＊杨凯为通讯作者。
rDNA ITS Analysis of Mycorrhizal Fungi in Cymbidium Plants
Li Lubin1 　Hu Tao1　Tang Zheng2　Zhuang Caiyun1　Liu Zhenjing1　Yang Kai2　Peng Zhenhua1
(1.Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation of SAF　Research Institute of Forestry , CAF　Beijing 100091;
2.Key Laboratory of Agricultural New Technology and Application in Beijing , Beijing Agricultural College　Beijing 102206)
Abstract:　rDNA internal transcribed spacer analysis (rDNA ITS)was used to study diversity of 12 representative mycorrhizal
Rhizoctonia strains , which were isolated from Chinese orchids (Cymbidium)distributed in different sites and belonged to
different ecologic types.The Blast results indicated that all these strains belonged to Epulorhiza or Tulasnella , which was fully
consistent with identification as Epulorhiza with morphological method.Additionally , based on rDNA ITS sequence cluster
analysis , dendrogram of Cymbidium mycorrhizal strains showed that the distributed environments and orchids species were two
crucial factors that affected the specificity-relation between Chinese orchids (Cymbidium)symbiotic mycorrhizae and hosts.
Key words:　Cymbidium;mycorrhizal-fungi;rDNA internal transcribed spacer analysis;Epulorhiza ;Tulasnella
兰科(Orchidaceae)植物俗称兰花 ,全世界约有 700属 20 000多种及大量变种 ,依其所属生态类型可分为
地生兰 、附生兰和腐生兰 3类 ,作为一种重要的观赏花卉和药用植物资源 ,在花卉和天然药物产业上有着巨
大的经济价值和利用潜力(罗毅波等 , 2003)。兰科菌根真菌(orchid mycorrhizae)对于兰科植物具有重要意
义 ,即兰科植物在自然生长状态下必须依赖与真菌建立共生关系才能完成正常生命活动(吴应祥 , 1993),自
Link首次发现兰科植物根内有内生真菌以来(Ressiek et al.,1847),对兰科菌根真菌及其与兰科植物间关系
的研究也不断开展(Hadley et al.,1972;Currah et al., 1987;Currah et al., 1992;Zelmer et al., 1995;范黎
等 , 2000;Taylor et al., 2004;颜容等 , 2006)。
由于形态学方法在已被普遍认同的兰科共生丝核菌属真菌的进一步细化分属鉴定中具有较大的局限
性 ,近年国外越来越多地将多种分子标记技术运用于兰科菌根真菌鉴定的研究(Kristiansen et al., 2001;
McKendrick et al.,2002;Selosse et al.,2002;Otero et al.,2002;Bougoure et al.,2005;Tham et al., 2001;Pope
et al., 2001;Ming et al., 2003;Pereira et al., 2005a;2005b;Andersen et al., 1992;Sen et al., 1998;
McCormick et al., 2004),诸多此方面的工作表明了在兰科植物菌根真菌研究中广泛采用分子生物学技术手
段的可行性和必然趋势。然而对于我国特有的 、广泛分布的地生型兰属(Cymbidium)植物 ,却鲜见运用分子
生物学技术手段对与其共生的菌根真菌进行系统发生学比较研究的报导(李潞滨 , 1998)。本研究利用 rDNA
ITS技术对分离自 4种不同地理分布和生态型中国兰属植物的12株共生瘤菌根菌(Epulorhiza)进行了遗传多
样性分析研究 ,将 rDNA ITS 分析结果和形态学分类结果进行了比较 ,并在 ITS序列分析基础上对中国兰属植
物与菌根真菌间的专一性进行了初步探讨。
1　材料与方法
1.1　供试菌株材料　ITS分析的菌株材料为中国兰属植物12个共生菌根真菌菌株 ,由中国林业科学研究院
林业研究所国家林业局林木培育实验室分离自 4种兰属植物即春兰(Cymbidium goeringii)、蕙兰(C.fabery)、
墨兰(C.sinense)、多花兰(C.floribundum), 经形态学初步鉴定为属于广义兰科共生丝核菌(Orchid
Rhizoctonia)的瘤菌根菌(表 1)。
表 1　ITS分析供试兰属植物及菌根真菌
Tab.1　Statistics of Cymbidium mycorrhizae for ITS analysis
编号
No.
兰花
Orchids
产地
Producing area
生态型
Ecotype
分离菌株
Mycorrhizal fungus
ITS序列
GenBank accession
1 惠兰 C.fabery 河南确山Queshan , Henan 地生兰 Terrestrial orchid 豫惠CH02X2-1 EF393625
2 惠兰 C.fabery 河南确山Queshan , Henan 地生兰 Terrestrial orchid 豫惠CH02X2-2 EF393626
3 春兰 C.goeringii 河南确山Queshan , Henan 地生兰 Terrestrial orchid 豫春CG03 EF127682
4 春兰 C.goeringii 湖北罗田 Luot ian , Hubei 地生兰 Terrestrial orchid 湖 1 CG08-1 EF393627
5 春兰 C.goeringii 湖北罗田 Luot ian ,Hubei 地生兰 Terrestrial orchid 湖 1 CG08-2 EF393628
6 春兰 C.goeringii 四川江津 Jiangjin, Sichuan 地生兰 Terrestrial orchid 春新 25CG15X3 EF393631
7 墨兰 C.sinense 四川江津 Jiangjin, Sichuan 地生兰 Terrestrial orchid 墨 3 CS06-1 EF393624
8 墨兰 C.sinense 四川江津 Jiangjin, Sichuan 地生兰 Terrestrial orchid 墨 3 CS06-2 EF393623
9 墨兰 C.sinense 四川江津 Jiangjin, Sichuan 地生兰 Terrestrial orchid 墨 3 CS09 EF393622
10 多花兰 C.floribundum 四川江津 Jiangjin, Sichuan 附生兰 Adnascent orchid 神CF07 EF393621
11 多花兰 C.floribundum 云南腾冲Tengchong , Yunnan 附生兰 Adnascent orchid C6 CH06X1-1　 EF393629
12 多花兰 C.floribundum 云南腾冲Tengchong , Yunnan 附生兰 Adnascent orchid C6 CH06X1-2 EF393630
1.2　菌株 DNA提取　用PDA培养基培养分离得到的菌根真菌 ,28 ℃培养 4 d ,用接种针刮取一个培养皿培
养的菌根真菌约 0.2 g ,加入 1 mL DNA提取缓冲液(100 mmol·L-1 Tris ,pH 8.5;100 mmol·L-1 NaCl;50 mmol·
L
-1
EDTA;2%SDS),充分研磨 , 65 ℃水浴 30 min;加入等体积苯酚∶氯仿(1∶1)轻轻混匀 5 min;每分钟
10 000转离心 10 min ,取上清液于一新离心管中;加入 70%体积的异丙醇沉淀 DNA ,DNA 用 70%乙醇冲洗 2
次;将DNA溶解在500mL TE缓冲液中 ,加入2μL RNA酶 , 37 ℃30 min;加入等体积苯酚∶氯仿(1∶1)轻轻混
匀;每分钟 10 000转离心 10 min ,取上清液于一新离心管中;加入等体积氯仿 ,轻轻混匀;每分钟 10 000转
离心 10 min ,取上清液于一新离心管中;加入 70%体积的无水乙醇沉淀 DNA , DNA 用 70%乙醇冲洗 2次;
DNA溶解在 1×TE 缓冲液中 ,4 ℃备用(庄彩云等 ,2007)。
1.3　菌株 rDNA ITS 区段的PCR扩增 、产物纯化及测序　兰花菌根真菌 rDNA ITS区段 PCR扩增和测序引物
为 ITS-P1(5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G), ITS-P2(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC)(Gardes et
al.,1993)。
PCR反应体系的组成为:100 mmol·L-1 Tris-HCl , 50 mmol·L-1 KCl ,1 U Taq DNA聚合酶 ,2.5 mmol·L-1
MgCl2 ,2.5 mmol·L-1 dNTPs ,4μmol·L-1引物 ,100 ng DNA模板 。
PCR反应循环参数为:预变性 96 ℃, 2 min;变性 94 ℃, 40 s;退火 60 ℃,40 s;延伸 72 ℃,45 s;进行 35
个反应循环;延伸 72 ℃,5 min。
PCR产物经 PCR产物试剂盒纯化后与 pMD-18T(TaKaRa)载体连接 ,转化大肠杆菌DH-5α,选取阳性克
隆由上海生工公司测序。
1.4　ITS序列排序及系统分析　ITS1和 ITS2序列的起止范围参照 GenBank中已有兰科植物菌根真菌的 ITS
范围确定。用DNAMAN软件对所获 ITS 序列进行系统分析 ,用最适全局排序选项进行成对同源性比对;
Observed Divergency 法构建系统树 。
2　结果
2.1　rDNA ITS区段的 PCR扩增及测序结果　　用引物 ITS-P1和 ITS-P2扩增 12个中国兰属植物菌根真
菌菌株的 rDNA ITS 区段 ,获得约 630 bp产物(图 1为部分菌株的 rDNA ITS 区段 PCR产物电泳结果)。12个
菌株的 rDNA ITS区段PCR产物测序后获得 ITS 区段的全序列 , ITS区域长度为 628 ～ 642 bp , ITS1长度为 170
～ 186 bp ,变异位点共 68个 , ITS2长度 272 ～ 285 bp ,变异位点 64个 。
2.2　rDNA ITS 序列的 Blast比对结果　将分离所得 12个中国兰属植物菌根真菌菌株的 rDNA ITS 序列在
GenBank中进行了同源比对 ,所得结果见表 2。
2.3　rDNA ITS序列聚类结果　12个中国兰属植物菌根真菌菌株的 rDNA ITS 序列聚类结果见图 2。
161　第 2期 李潞滨等:我国部分兰属植物菌根真菌 rDNA ITS 序列分析
图 1　菌株的 rDNA ITS区段 PCR产物电泳结果
Fig.1　Electrophoresis result of st rains rDNA
ITS section PCR production
表 2　兰属植物菌根真菌 rDNA ITS序列 Blast比对结果①
Tab.2　Blast results of Cymbidium mycorrhizae fungi rDNA ITS sequence
菌株编号
Strains No.
GB中相似克隆
Semblable clone in GB
GB中相似克隆对应菌名
Fungus of semblable clone in GB
相似度
Identities
豫惠 CH02X2-1 AY373266 Tulasnella sp.101 IDs=599 615(97%),Gaps=1 615(0%)
豫惠 CH02X2-2 AY373266 Tulasnella sp.101 IDs=601 616(97%),Gaps=2 616(0%)
豫春 CG03 AY643804 Tulasnella calospora IDs=574 597(96%),Gaps=9 597(1%)
湖 1 CG08-1 AJ313448 Epulorhiza sp. IDs=613 617(99%),Gaps=0 617(0%)
湖 1 CG08-2 AJ313448 Epulorhiza sp. IDs=616 620(99%),Gaps=0 620(0%)
春新 25CG15X3 AY373298 Tulasnella calospora IDs=611 622(98%),Gaps=2 622(0%)
墨 3 CS06-1 AJ313451 Epulorhiza sp. IDs=618 633(97%),Gaps=0 633(0%)
墨 3 CS06-2 AJ313451 Epulorhiza sp. IDs=620 633(97%),Gaps=0 633(0%)
墨 3 CS09 AJ313451 Epulorhiza sp.Ea3a IDs=615 630(97%),Gaps=1 630(0%)
神CF07 AY643804 Tulasnella calospora IDs=585 591(98%),Gaps=1 591(0%)
C6CH06X1-2 AJ313446 Epulorhiza sp. IDs=637 640(99%),Gaps=0 640(0%)
C6CH06X1-1 AJ313446 Epulorhiza sp. IDs=638 640(99%),Gaps=0 640(0%)
　　①GB:GenBank;IDs:相似度 Identities.
图 2　兰属植物菌根真菌 rDNA ITS 序列聚类图
Fig.2　Dendrogram of Cymbidium mycorrhizae
fungi based on rDNA ITS sequence cluster analysis
3　分析与讨论
3.1　rDNA ITS 序列的 Blast比对结果讨论　对分获菌株的
rDNA ITS序列在 GenBank中进行 Blast同源性比对 ,结果显
示本次研究中的 12个兰属植物菌根真菌菌株与新加坡的
Ming 等(2003)、美国的 Bougoure 等(2005)和 McCormick 等
(2004)已报道的分离自兰属植物的瘤菌根菌属或胶膜菌属
(Tulasnella)真菌之间的同源相似度达 96%～ 99%(表 2),
ITS序列分析与已有的相关研究结果相吻合。
对于被广泛认同的可与兰科共生的属于无性态半知菌
范畴的广义丝核菌属菌根真菌 , Moore(1989)、Currah 等
(1992)和Andersen (1996)等以真菌桶孔隔膜超微结构特征
等形态学鉴定标准已对其进行了细化分属 ,其中无性态的
瘤菌根菌属真菌与有性态的胶膜菌属真菌被确认为同一真
菌2种不同的存在形式。
本次所获 12个菌株与 GenBank 中已报道的瘤菌根菌
属或胶膜菌属真菌之间有着高度的同源性(96%～ 99%),
Blast比对与形态学鉴定所获结论是一致的 ,以分子生物学
162 林 业 科 学 44 卷　
和形态学 2种手段展开鉴定研究的结果得到了充分的相互印证。以菌丝体桶孔隔膜超微结构特征等为依据
形态学方法结合菌株 rDNA ITS序列分析的分子生物学技术手段 ,可以大大提高开展兰科菌根真菌鉴定研究
的科学性和准确性。
3.2　rDNA ITS序列聚类结果讨论　12个菌株的 rDNA ITS区段 PCR产物的测序表明 ,中国兰属植物菌根真
菌之间的 rDNA ITS1 、ITS2区段序列具有高度同源性的同时 ,也存在着较丰富的长度多态性信息 ,可以有效地
通过兰属植物菌根真菌之间的 rDNA ITS区段序列差异来鉴别兰属植物菌根真菌。
从本研究 12个菌株的 rDNA ITS序列聚类分析结果可见(图 2),从产于四川江津的墨兰分离出的菌株墨
3 CS06-1 、墨 3 CS06-2和墨 3 CS09聚在一起(EF393622 、EF393623 、EF393624序列间只有 4个碱基出现差
异)再与同一产地春兰分离的菌株春新 25CG15X3聚在一起;从采集自云南腾冲的附生多花兰中分离的菌株
C6 CH06X1-1 、C6 CH06X1-2聚在一起(EF393629 、EF393630序列间只有 1个碱基出现差异);从采集自湖北
罗田地生春兰分离出的菌株湖1 CG08-1和湖1 CG08-2聚在一起 ,(EF393627 、EF393628序列间有 4个碱基
出现差异);从采集自河南确山的蕙兰中分离菌株间豫惠CH02X2-1和豫惠 CH02X2-2聚在一起 ,序列间有
12个碱基出现差异(EF393625 , EF393626),这 2菌株聚在一起后再与分离自同一采集地的春兰菌株豫春
CG03聚在一起;这些菌株的聚类关系均与兰花寄主的地理分布和所属种相关 ,只有从产自四川江津的附生
多花兰中分离的神CF07菌株与寄主地理分布 、所属种的关系不一致。从不同产地兰花菌根真菌 rDNA ITS
序列多样性上分析 ,多样性呈现从南方到北方逐渐增大的趋势 ,说明兰花产地环境的复杂程度直接影响兰花
菌根真菌的多样性。
这些结果说明兰花地理分布 、所属种是影响中国兰属植物菌根真菌与兰花间专一性关系的关键性因素。
参 考 文 献
范　黎 ,郭顺星 ,肖培根.2000.密花石斛等六种兰科植物菌根的显微结构研究.植物学通报 , 17(1):73-79.
李潞滨.1998.中国兰菌根研究.北京林业大学博士学位论文 , 12-21.
罗毅波 ,贾建生 ,王春玲 ,等.2003.中国兰科植物保育的现状和展望.生物多样性 , 11(1):70-77.
吴应祥.1993.中国兰花.2版.北京:中国林业出版社 , 65-76.
颜　容 ,刘红霞 ,蔡怀兆页 ,等.2006.独花兰菌根的初步研究.北京林业大学学报 , 28(2):112-117.
庄彩云 , 李潞滨 , 胡　陶 ,等.2007.适用于 rDNA ITS分析的兰属植物菌根真菌培养及DNA提取方法.北京农学院学报 ,22(3):4-6.
Andersen T F.1992.A Check-list of Rhizoctonia epithes.Mycotaxon , 51:437-457.
Andersen T F.1996.A comparat ive taxonomic study of Rhizoctonia sensu lato employing morphological , ultrastructural and molecular methods.Mycol Res , 100
(9):1117-1128.
Bougoure J J , Bougoure D S.2005.ITS-RFLP and sequence analysis of endophytes from Acianthus , Caladenia and Pterostylis (Orchidaceae)in southeastern
Queensland.Mycol Res , 109(Pt 4):452-60.
Currah R S , Sherburne R.1992.Septal ult rastructure of some fungal endophytes f rom boreal orchid mycorrhizas.Mycological Research , 96:583-587.
Currah R S , Zelmer C D ,Sight L , et al.1987.New records and new taxa of fungi f rom the mycorrhizae of terrestrial orchids of Alberta.Can J Bot , 65:2473-
2482.
Tham F Y , Zhang X S.2001.Abstracts for the 3rd International Conference on Mycorrhiza(ICOM III), Adelaide , 247-258.
Gardes M , Bruns T D.1993.ITS primer with enhanced specif icity for basidiomycetes:Application to the identification of mycorzhizae and rusts.Mol Ecol , 2:113
-118.
Hadley G ,Williamson B.1972.Features of mycorrhizal infection in some Malayan orchids.New Phytol , 71:1111-1118.
Kristiansen K A , Taylor D L.2001.Identification of mycorrhizal fungi from single pelotons of Dactylorhizamajalis(Orchidaceae)using single-strand conformation
polymorphism and mitochondrial ribosomal large subunit DNA sequences.Mol Ecol , 10(8):2089-2093.
McCormick M K ,Whigham D F.2004.Mycorrhizal diversity in photosynthetic terrestrial orchids.New Phytologist , 163(2):425-438.
McKendrick S L , Leake J R , Taylor D L.2002.Symbiotic germination and development of the myco-heterotrophic orchid Neottia nidus-avis in nature and i ts
requirement for locally distributed Sebacina spp.New Phytologist , 154(1):233-247.
Ming M A , Teck Koon TAN.2003.Identification and molecular phylogeny of Epulorhiza isolates f rom tropical orchids.Mycol Res , 107(9):1041-1049.
Moore R T.1987.The genera of Rhizoctonia-like fungi:Ascorhitonia , Ceratorhiza gen.nov., Epulorhiza gen.nov., Moniliopsis , and Rhizoctonia.Mycotaxon ,
29:91-99.
Mordue J E M ,Currah R S , Bridge P D.1989.An intergrated approach to rhizoctonia taxonomy:culture , biochemical and numerical techniques.Mycol Res , 92
(1):78-90.
Otero J T ,Ackerman J D.2002.Diversity and host specif icity of endophytic Rhizoctonia-like fungi f rom tropical orchids.American Journal of Botany ,89(11):
1852-1858.
163　第 2期 李潞滨等:我国部分兰属植物菌根真菌 rDNA ITS 序列分析
Pereira O L , Kasuya M C M.2005a.In vitro symbiotic seed germination of Oncidium flexuosum (Orchidaceae)by rhizoctonia-like mycorrhizal fungi.Revista
Brasilei ra de Ciencia Do Solo , 29(2):199-206.
Pereira O L , Kasuya M CM.2005b.Isolation and identifi cation of Rhizoctonia-like mycorrhizal fungi associated with three species of neot ropical epiphytic orchids
in Brazil.Revista Brasi leira De Ciencia do Solo , 29(2):191-197.
Pope E J ,Carter D A.2001.Phylogenetic placement and host specifi city of mycorrhizal isolates belonging to AG-6 andAG-12 in the Rhizoctonia solani species
complex.Mycologia , 93(4):712-719.
Ressiek S.1847. ber endophyten der pf lanzenzelle.Naturwiss , 1:31-46.
Selosse M A ,WeissM.2002.Communities and populations of Sebacinoid basidiomycetes associated with the achlorophyllous orchid Neottia nidus-avis(L.)LCM
Rich.and neighbouring tree ectomycorrhizae.Molecular Ecology , 11(9):1831-1844.
Sen R ,Hietala A M , Zelmer C D.1998.Growth promoting rhizoctonia root endophytes of Scots pine and their affinity to isolates of Ceratorhiza goodyerae-repentis
from the mycorrhizas of orchids.Abstracts of the 2nd International Conference on Mycorrhizae No.478 ,P.156 ,5-10th July , Uppsala , Sweden(poster), 526
-569.
Taylor D L , Bruns T D.2004.Evidence for mycorrhizal races in a cheating orchid.Proc Biol Sci , 271(1534):35-43.
Zelmer C D ,Currah R S.1995.Ceratorhiza pernacatena and Epulorhiza calendulina spp nov:Mycorrhizal fungi of terrestrial orchids.Canadian Journal of Botany ,
73(12):1981-1985.
(责任编辑　朱乾坤)
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