全 文 ：2011 年 2 月
2011，33(1) :020 － 024
中国油料作物学报
Chinese journal of oil crop sciences
甘蓝型油菜与诸葛菜属间杂交 F12
群体的品质及遗传分析
徐传远1，李再云2 *
(1．河北理工大学化工与生物技术学院，河北 唐山 063009;
2．华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，湖北 武汉 430070)
摘要:以甘蓝型油菜(AACC，2n = 38)品种 Oro与诸葛菜(OO，2n = 24)属间杂交 F4 世代中出现的五倍体单株
(AACCO，2n = 50)为起始材料连续自交选育、鉴定，直至获得 F12群体。各 F12株系间表现一定的形态差异，但株系
内植株形态特征一致。细胞学观察表明 85． 3%的 F12单株具有与甘蓝型油菜相同的染色体数目，花粉母细胞
(PMCs)减数分裂中正常配对和分离;其余植株的染色体数目分别为 37、39 和 40;红紫色植株在减数分裂中有落后
染色体，四分体时期会出现微核。基因组原位杂交(Genomic in situ hybridization，GISH)分析未检测出整条的诸葛菜
染色体;但 AFLP分析表明存在渗入的诸葛菜 DNA片段。F12植株的脂肪酸组成及硫苷含量表现较大的变异，有的
植株油酸含量高于 Oro而硫苷降低。
关键词:甘蓝型油菜;诸葛菜;基因渗入;属间杂种
中图分类号:Q321 + ． 3;S565． 4 文献标识码:A 文章编号:1007 － 9084(2011)01 － 0020 － 05
Seed quality and genetic analysis of F12 progenies from intergeneric hybrids
between Brassica napus and Orychophragmus violaceus
XU Chuan － yuan1，LI Zai － yun2*
(1． College of Chemical Engineering and Biological Technology，Hebei Polytechnic
University，Tangshan 063009，China;2． National Key Laboratory of Crop Genetic
Improvement，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China)
Abstract:In F4 progenies from intergeneric hybrids between Brassica napus (AACC，2n = 38)cv． Oro and
Orychophragmus violaceus (OO，2n = 24) ，a pentaploid plant (AACCO，2n = 50)was found and selfed consecu-
tively to F12 generation． Every F12 line showed distinct phenotype，but plants from the same line had uniform mor-
phology． Cytological investigations revealed that 85． 3% of the F12 plants had the same chromosome numbers (2n =
38)as B． napus，which were paired as 19 bivalents and segregated equally as 19∶ 19 during the meiosis of pollen
mother cells (PMCs)． The remaining plants had 2n = 37，39 or 40，respectively． Micronucleus and laggard chro-
mosome appeared PMCs in plants with purple leaves and stems which were traits from O． violaceus． GISH analyses
showed no intact O． violaceus chromosomes in F12 plants，while AFLP indicated DNA fragments from O． violaceus．
Obvious variations in contents of fatty acids and glucosinolates，such as high oleic acid and low glucosinolates，were
found in the seeds of F12 plants．
Key words:Brassica napus;Orychophragmus violaceus;Genetic introgression;Intergeneric hybrid
收稿日期:2010-09-25
基金项目:国家重点实验室专项经费;唐山市科技局项目(09120202c)
作者简介:徐传远(1978 －) ，男，山东长清人，讲师，博士，研究方向油菜分子细胞遗传，E － mail:chuanyuanxu@ gmail． com
* 通讯作者:李再云，教授，博士生导师，E － mail:lizaiyun@ mail． hzau． edu． cn
远缘杂交可以利用近缘野生种对栽培种进行遗 传改良，将野生种的优良性状引入栽培种，从而增强
作物的抗逆性、提高品质、增加产量 ［1 ～ 3］。诸葛菜
(Orychophragmus violaceus L． O． E． Schulz，2n = 24) ，
又名二月兰，十字花科诸葛菜属，在我国有广泛分
布［4］，一般用作野菜或观赏植物。它具有油分品质
优良和农艺性状好的特点，为低亚麻酸、低芥酸的天
然野生种质［5］，是油菜脂肪酸改良育种的优良种
源［6］。目前已经获得了多个甘蓝型油菜(Brassica
napus，2n = 38)与诸葛菜的属间杂种，但主要研究
均集中在有性杂种的获得及杂种的形态及细胞学鉴
定方面［7 ～ 10］。Li 等进行了甘蓝型油菜品种 Oro 与
诸葛菜的属间杂交，获得了混倍体的杂种，并认为存
在体细胞染色体组分离的现象［7］。经连续自交选
育及细胞学检查，在 F4 群体中发现了一株染色体数
目为 50 的五倍体植株(AACCO)［11］。通过对该五
倍体植株进行连续地自交选育，获得了形态基本稳
定的 F12群体。本文通过对 F12群体各个株系进行种
子油分分析、普通细胞学观察以及 GISH、AFLP 分
析，以了解远缘杂交高世代材料的基因组变化情况，
并创建有育种及遗传研究价值的材料。
1 材料和方法
1． 1 植物材料
以 Li等［7］获得的甘蓝型油菜与诸葛菜属间杂
种的 F4 群体中出现的五倍体植株(AACCO，2n =
50)为起始材料［11］，进行连续多代自交选育，直至获
得形态基本稳定的 F12群体。本研究以该 F12群体为
供试材料。
1． 2 花粉可染性和普通细胞学观察
在天气晴好的上午选取正在开花植株自交袋内
开始散粉 1h之内的花朵。每个单株取三朵花，每朵
花取两个花药。将花药捣碎于载玻片上，以 1%醋
酸洋红染色后盖片，于光学显微镜下观察。大而圆
且能着色的为可育花粉，小而瘪且不能着色(或着色
较浅)的为不育花粉。普通细胞学观察，采集幼嫩子
房、花蕾并以李再云等［12，13］的方法进行处理观察。
1． 3 基因组原位杂交(GISH)及 AFLP分析
原位杂交的制片主要依照 Zhong 等［14］的方法
进行，而原位杂交的程序主要依据 Leitch 等［15］的方
法进行。AFLP 分析主要依照 Vos 等［16］的程序进
行。最终的扩增产物按照 Bassam 等［17］的方法进行
分离和染色，展示多态性。
1． 4 脂肪酸组成及硫苷含量测定
单株收获 F12植株的种子，取适量种子在气相色
谱仪(HP 6890，Germany)上进行脂肪酸组成测定，
在近红外分析仪上(Vector 22 /N，Bruker，Germany)
进行种子硫苷含量的测定。
2 结果与分析
2． 1 植株形态和花粉可染性
F12群体在形态上已经表现出一定的稳定性，各
个株系内的植株在株高和叶型等方面已经基本一
致，主要形态偏向甘蓝型油菜品种 Oro。各个株系
之间在叶、花及果的形态上有所分离，主要表现在叶
片的长短、叶柄部叶裂的有无以及叶片绒毛的有无，
花朵的大小，以及角果的长短、粗细等。各个株系间
的植株叶片也有绿色深浅的区别。有些株系的植株
幼叶为红紫色，呈现出典型的红芯;而有的株系在成
株后，茎秆表面、果柄及角果表面呈现明显的红紫
色。该性状明显来自于诸葛菜，因为诸葛菜开紫色
花，花青素含量较高。但在有些株系内各个单株有
时也表现出叶片蜡粉的有无以及植株表面红紫色颜
色深浅的差异，表明株系内仍有一定的分离。
作为起始材料的 F4 世代的五倍体植株，其花粉
可染率为 75． 6%。而 F12群体各个株系植株的花粉
可染率均在 90． 0%以上，大多数植株的花粉可染率
为 100． 0%。虽然部分株系植株的花粉可染率相对
较低，但其自交结实率未受显著影响，花粉量足够完
成授粉所需。而部分花粉可染率为 100． 0%的株系
植株，通过自交只能获得少量的种子。
2． 2 脂肪酸组成及硫苷含量
Oro 为甘蓝型油菜低芥酸品种，其芥酸含量为
3． 96%，而杂种后代 F12群体各单株的芥酸含量的变
异幅度则很大，从 0． 00%到 52． 86%。同时，油酸的
变幅也很大，出现了油酸含量显著高于 Oro 的单株。
除芥酸和油酸含量外，F12单株的其它脂肪酸平均含
量均与杂交母本 Oro 十分接近。但 F12群体的平均
芥酸含量明显高于 Oro，而平均油酸含量则相反(表
1)。同样，F12群体的硫苷含量也发生了歧化，从
表 1 甘蓝型油菜 Oro与诸葛菜杂种 F12脂肪酸组成及硫苷含量
Table 1 Fatty acid compositions and glucosinolate content of F12 from B． napus cv Oro ×O． violaceus
材料
Material
棕榈酸
C16∶ 0 /%
硬脂酸
C18∶ 0 /%
油酸
C18∶ 1 /%
亚油酸
C18∶ 2 /%
亚麻酸
C18∶ 3 /%
廿碳酸
C20∶ 1 /%
芥酸
C22∶ 1 /%
硫苷
Glucosinolate /(μmol /g)
F12(116 plants)
4． 40 ± 1． 13
(3． 13 ～ 9． 33)
1． 91 ± 0． 84
(0． 80 ～ 6． 38)
45． 75 ± 18． 81
(12． 20 ～ 70． 28)
19． 09 ± 4． 24
(12． 36 ～ 34． 96)
7． 20 ± 1． 45
(4． 28 ～ 9． 83)
7． 29 ± 5． 91
(0． 00 ～ 18． 27)
14． 34 ± 16． 52
(0． 00 ～ 52． 86)
66． 34 ± 38． 65
(0． 00 ～ 129． 39)
B． napus cv Oro 4． 20 2． 14 60． 62 18． 51 5． 71 4． 85 3． 96 53． 40
诸葛菜 O． violaceus 15． 31 8． 09 15． 98 46． 67 5． 12 4． 36 0． 86 50． 94
12徐传远等:甘蓝型油菜与诸葛菜属间杂交 F12群体的品质及遗传分析
0． 00μmol /g到 129． 39μmol /g，但平均硫苷含量均较
Oro和诸葛菜为高。可能是诸葛菜基因组片段整合
进 Oro的基因组，从而使脂肪酸及硫苷的合成发生
了变化，但其中高芥酸、低油酸或高硫苷的植株具有
相对较高的适应性，从而在杂交后代群体中出现较
多的相应植株。
表 2 F12群体用 10 条引物进行的 AFLP带型分析
Table 2 AFLP analysis of F12 population using 10 primers
材料 Materials
带数 Bands number
来自 Oro
From Oro
来自诸葛菜
From O． violaceus
Oro与诸葛菜共有
Shared by both
相较 Oro缺失
Absent from Oro
新带
New
总数
Total
B． napus cv Oro
诸葛菜 O． violaceus
149
－
－
163 25
－
－
－
－ 337
F12 117 ～ 129 10 ～ 18 18 ～ 22 17 ～ 19 7 ～ 15 159 ～ 174
注:a:具有 19 个二价体的终变期花粉母细胞;b:呈现 19∶ 19 分离的后期 I 的花粉母细胞;c:2n = 38 的后期 I 花粉母细胞，箭头示 1 个
落后染色体;d:2n = 38 的后期 I花粉母细胞，箭头示染色体桥;e，f:2n = 38 的 2 个多分孢子，箭头示微核;g ～ i:均为 2n = 38 的细胞;
g:诸葛菜探针信号均位于体细胞染色体的随体、端粒和着丝粒部位;h，i:来自同一单株的花粉母细胞;h:终变期花粉母细胞，
箭头示约半条染色体上存在较强的诸葛菜探针信号;i:后期 I 花粉母细胞，并不存在特别明显的诸葛菜探针信号;标尺:10μm
Note:a:One diakinesis PMC (pollen mother cell)with 19II． b:One AI PMC with 19∶ 19 segregation;c:One AI PMC
(2n = 38)with one laggard (arrowed) ;d:One AI PMC (2n = 38)with a chromosome bridge (arrowed) ;e，f:Tetrads (2n = 38)
with micronuclei (arrowed) ;g ～ i:Cells with 2n = 38;g:One root － tip cell with strong signals of the O． violaceus probe at satellites，
terminal and centromeric parts of several chromosomes;h:One diakinesis PMC with strong signals of the O． violaceus
probe at half a chromosome;i:One AI PMC with no obvious signals of the O． violaceus probe． Bar:10μm
图 1 F12群体植株的减数分裂及 GISH分析
Fig． 1 Meiosis and GISH analysis of F12 population
22 中国油料作物学报 2011，33(1)
注:箭头指向诸葛菜特异带型。M:marker;P1:甘蓝型油菜 Oro;P2:诸葛菜
Note:Fragments specific for O． violaceus are indicated by black arrows;M:marker;P1:Oro;P2:O． violaceus
图 2 F12群体植株的 AFLP分析
Fig． 2 AFLP analysis of F12 population
2． 3 普通细胞学观察及 GISH分析
F12群体植株中未发现混倍体，每个被观察的单
株细胞均具有单一的染色体数目。在 197 株被测单
株中，168 株(占 85． 3%)的染色体数为 38，5 株为
37，20 株为 39，4 株为 40。染色体数为 38 的植株在
花粉母细胞(PMCs)终变期多形成 19 个二价体(图
1a) ，在少数情况下观察到单价体;在后期 I 多为 19
∶ 19 分离(图 1b) ，偶尔发现落后染色体(图 1c)或
染色体桥(图 1d) ;在 10 株单株的四分体时期 PMCs
中发现存在少量的五分孢子(图 1e)或六分孢子(图
1f)。染色体数目为 37 的植株的 PMCs 在终变期形
成 18 个二价体和 1 个单价体，在后期Ⅰ以 18∶ 19 的
方式分离。染色体数为 39 的植株的 PMCs 在终变
期形成 19 个二价体和一个单价体，后期Ⅰ以 19∶ 20
的方式分离。染色体数为 40 的植株的 PMCs 在终
变期多形成 20 个二价体，后期Ⅰ多以 20∶ 20 的方式
分离。在一些绿秆株系中出现个别的红紫色茎秆的
植株，染色体观察发现这些单株具有相对较高的细
胞学不稳定性，其 PMCs 后期 I 多发现落后染色体
或染色体桥，在四分体时期常形成多分孢子。
对具有部分诸葛菜性状的植株进行 GISH 分
析，明确其是否含有诸葛菜的染色体。结果表明，在
2n = 38 的各个株系中，诸葛菜的探针信号主要分布
于各被测单株体细胞基因组染色体的端部(端粒)
和随体(图 1g) ;在减数分裂终变期，有时会发现在
半个或 1 个染色体上存在明显的诸葛菜探针信号
(图 1h) ，但在相应单株的减数分裂后期 I 和有丝分
裂中期细胞中，却并不存在明显的信号(图 1i)。在
减数分裂后期 I的落后染色体上也没有发现明显的
诸葛菜探针信号。在 2n ＞ 38 的各个株系中，诸葛菜
的探针分布情况与 2n = 38 的株系类似。
2． 4 AFLP分析
通过 10 对随机选择的 AFLP 引物，获得的条带
数较为丰富。甘蓝型油菜与诸葛菜的共有条带数较
少(表 2) ，说明二者的亲缘关系较远。F12群体单株
中只存在少量的来自诸葛菜的特异 DNA 片段(图
2) ，并发现少量的缺失条带以及新条带(杂交双亲
所不具有的条带)。由 AFLP 图谱来看，F12群体各
个单株在遗传组成上大致与杂交母本 Oro 相似，这
与形态学以及细胞学的观察相一致。通过对比发
现，具有较多诸葛菜性状的单株，其具有的诸葛菜特
异片段较多。细胞遗传较稳定的单株具有的诸葛菜
特异片段较少。但染色体数目与细胞学稳定性并无
太大的关系，所以 2n = 38 的单株具有的诸葛菜特异
片段数目相差较大。且目前并不能将 AFLP 分析中
这些特异条带的增缺及变化与植株叶型、表面颜色
及脂肪酸组成的变化相联系。
3 讨论
为了判断远缘杂交后代的育性恢复程度，本文
选择成熟花粉的醋酸洋红可染性作为依据，结果表
明花粉的可染性并不与各个单株的自交结实能力绝
对一致。究其原因，可能是以花粉可染性来表示花
粉的育性有一定的局限性，或者是植株为自交不亲
和类型，也可能是存在雌性不育现象。
在 GISH分析中，往往发现终变期细胞中存在
一条或半条具有较强诸葛菜探针信号的染色体，而
在该植株后期 I细胞或体细胞中却不存在如此明显
的信号。推测可能是甘蓝型油菜的终变期细胞染色
体解螺旋程度较高，探针容易结合，从而在与诸葛菜
染色体同源性较高的区域形成假阳性信号。而后期
I的落后染色体上不存在明显的诸葛菜探针信号，
也说明在远缘杂交后代细胞学观察时，发现落后染色
体时并不证明该染色体组中存在异源染色体。
GISH及 AFLP 分析表明，在 F12植株基因组中
并不存在整条的诸葛菜染色体，而是发生了明显的
遗传渗入现象。一些诸葛菜染色体的小片段整合入
甘蓝型油菜的基因组中，从而改变了相关基因的组
32徐传远等:甘蓝型油菜与诸葛菜属间杂交 F12群体的品质及遗传分析
成或表达，改变了生物合成与代谢过程，使部分植株
的形态、脂肪酸及硫苷含量等均发生变化，从而可以
在 F12群体中筛选出零芥酸和零硫苷的遗传育种新
材料。
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