全 文 ：doi10. 16473 / j. cnki. xblykx1972. 2015. 04. 011
香格里拉 5 种杓兰属植物菌根真菌的多样性分析
*
缪福俊1，2，蒋宏1，2，丁雅迪3，华梅1，2，陈剑1，2，原晓龙1，2，赵欣宇3，杨宇明1，2，王娟1，2
(1. 云南省林业科学院，云南 昆明 650201;2. 国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育重点实验室 /
云南省森林植物培育与开发利用重点实验室，云南 昆明 650201;3. 西南林业大学，云南 昆明 650224)
摘要:首次采用微生物免培养技术，对香格里拉地区的黄花杓兰、离萼杓兰、西藏杓兰等 5 种濒危杓兰属植物
的菌根真菌进行了 rDNA ITS区段巢式 PCＲ扩增，以了解杓兰属植物菌根真菌菌群多样性及其结构组成。结果表
明:杓兰属植物菌根真菌群落表现出较高的丰富多样性，共获得 388 个单克隆，涉及 8 个属的真菌 (胶膜菌属、
瘤菌根菌属、丝核菌属、念珠菌根菌属、毛壳菌属、角担菌属、层孔菌属和伏革菌属) ，还有一类归属未定的真
菌;胶膜菌属 (美胞胶膜菌)和丝核菌属 (立枯丝核菌)在多种杓兰属植物菌根中存在且占有较高的频率，高
达 20 %，可能是典型的兰科植物菌根真菌。以上结果为菌肥的研制和杓兰属植物的栽培与保育工作提供科学依
据。
关键词:杓兰;菌根真菌;rDNA ITS;胶膜菌属;微生物免培养
中图分类号:S 718. 81 文献标识码:A 文章编号:1672 － 8246 (2015)04 － 0058 － 05
Mycorrhizal Fungal Diversity of 5 Species of Cypripedium
Plants in Shangri-La County
MIAO Fu-jun1，2，JIANG Hong1，2，DING Ya-di3，HUA Mei1，2，CHEN Jian1，2，
YUAN Xiao-long1，2，ZHAO Xin-yu3，YANG Yu-ming1，2，WANG juan1，2
(1. Yunnan Academy of Forestry，Kunming Yunnan 650201，P. Ｒ. China;2. Key Laboratory for Conservation of Ｒare，Endangered ＆
Endemic Forest Plants，State Forestry Administration，Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploitation of Forest Plants，
Kunming Yunnan 650201，P. Ｒ. China;3. Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，P. Ｒ. China)
Abstract:We studied the composition and diversity of fungal communities associated with five endangered Cypripe-
dium species (C. flavum P. F. Hunt et Summerh，C. plectrochilum Franch，C. tibeticum King et Ｒolfe and so on)
found in Shangri-La． The rDNA ITS sequences of mycorrhizal fungi were amplified by using culture-independant
method (nested-PCＲ)for the first time． The results showed that the high-level fungi diversity exists in the mycor-
rhizal fungi systems of Cypripedium plants. We obtained 388 ITS-taxa clones． The mycorrhizal fungi belonged to 8
genera (Tulasnella，Epulorhiza，Ｒhizoctonia，Moniliopsis，Chaetomium，Ceratobasidium，Fomes and Cortici-
um)and an unidentified fungal species． The two fungal genera Tulasnella (Tulasnella calospora)and Ｒhizoctoni-
a (Ｒhizoctonia solani) ，which are typical orchid mycorrhizal fungi，made up 20 % of the total mycorrhzal fungi．
The results above will provide scientific basis for further conservation work of Cypripedium species and Cypripedium
fertilizer development．
Key words:Cypripedium;mycorrhizal fungi;rDNA ITS;Tulasnella;culture-independant
第 44 卷 第 4 期
2015 年 8 月
西 部 林 业 科 学
Journal of West China Forestry Science
Vol. 44 No. 4
Aug. 2015
* 收稿日期:2015 － 03 － 31
基金项目:云南省应用基础研究计划青年项目 (2014FD070) ，国家林业公益性行业科研专项项目 (201204110) ，云南省应用基础研
究重点项目 (2013FA054) ，云南省社会事业发展专项 (2010CA010) ，云南省中青年学术技术带头人后备人才培养项目
(2010CI016) ，云南藏区典型区域生态安全防控技术研究及应用示范项目，云南省教委湿地生态学创新团队项目。
第一作者简介:缪福俊 (1986 －) ，男，研究实习员，主要从事根际微生物研究。E-mail:miaofujun@ yeah. net
通讯作者简介:王娟 (1966 －) ，女，教授，主要从事植物分子生物学与植物菌根研究。E-mail:schima@ 163. com
杓兰属 (Cypripedium)植物隶属杓兰亚科，
是兰科 (Orchidaceae)植物中的一个保育研究热
点类群［1 ～ 2］。因其具有较高的观赏价值和药用价
值，加之人类对杓兰野生环境的日益破坏，使得杓
兰属植物种群数量急剧下降，已处于濒危状态，亟
待保护［3 ～ 5］。目前，在杓兰属植物保育工作中，因
多数自花不育导致自然结实率较低，种子微小且难
萌发，多采取分株繁殖和组织培养方式进行种苗扩
繁，其幼苗生长缓慢、死亡率高等，极大地限制了
杓兰濒危植物的保育工作［6 ～ 7］。
研究表明，在自然条件下兰科植物必须与真菌
建立共生关系，其种子萌发、幼苗生长发育及成年
植株营养的获取才得以实现［7］。菌根可能是一个
重要因素［8］。针对兰科植物菌根多样性的研究报
道较多，但主要集中在兰科植物菌根形态观察和纯
培养分离方面。如 Oliveira 等对巴西 4 种兰花的菌
根真菌进行菌群多样性研究发现，其菌根真菌主要
为腊壳菌属 (Sebacina) ，高达 81. 61 %［9］。王芝娜
等对 6种兰花菌根纯培养获得 30 株真菌，为镰刀菌
属 (Fusarium)、毛壳菌属 (Chaetomium)、柱孢霉
菌属 (Cylindrocarpon)和 瘤 根 菌 属 (Epulorhi-
za)［10］。王瑞苓等通过对黄花杓兰 (Cypripedium fla-
vum P. F. Hunt et Summerh)植株根的生长周期切片
观察，发现菌根真菌与黄花杓兰是互惠互利的共生
关系［11］。臧穆等在黄花杓兰的根皮层细胞内发现了
不同阶段的小型菌核，表明杓兰和真菌是协同的关
系［12］。侯天文等研究发现菌根真菌多样性是随杓
兰生长季节变化的，其变化规律与营养需求规律一
致［13］。高倩等发现菌根真菌的 4 个阶段 (新近入
侵、开始被消解、消解后的残余和消解后的物质)
在杓兰属植物的周年生长周期中周而复始地进
行［14］。赵欣宇等研究发现与云南杓兰和紫点杓兰
共生的菌根真菌具有较强的专一性［15］。上述研究
主要集中在形态解剖及描述方面，而对杓兰属植物
菌根真菌菌群多样性研究少见报道。
本研究在前期调查中发现，杓兰属植物在滇西
北高海拔区域分布较多，这为研究杓兰属植物菌根
真菌提供极好的基础。本研究以香格里拉地区的 5
种濒危杓兰属植物菌根为研究材料，提取菌根总
DNA，首次采用微生物免培养技术巢式 PCＲ 直接
扩增菌根真菌 rDNA ITS 区段，并对 5 种杓兰属植
物的菌根真菌多样性进行分析，为今后充分保护杓
兰属濒危物种，并利用兰科植物特有的菌根资源以
及促进其迁地保护成功具有重要的科学意义。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
采样地点位于云南省香格丽拉县，共采集到黄
花杓兰 (C. flavum P. F. Hunt et Summerh)、离萼杓
兰 (C. plectrochilum Franch )、 云 南 杓 兰
(C. yunnanense Franch)、西藏杓兰 (C. tibeticum
King et Ｒolfe)和紫点杓兰 (C. guttatum Sw. )5 种
杓兰属植物，其经纬度和海拔见表 1。对每种选样
植株随机选取 20 株进行取样，在每株杓兰的根尖
处选取 10 个毛根段 (1 cm) ，混匀后置于装有
CTAB缓冲液离心管中，置于 4℃避光低温环境储
存。
表 1 滇西北杓兰属植物采样地点及海拔
Tab. 1 Sample collection of Cypripedium plants in Northwest Yunnan
寄主植物 采集地点 经度(E) 纬度(N) 海拔 /m
黄花杓兰 C. flavum P. F. Hunt et Summerh 石卡雪山 99°1635″ 27°5911″ 3 499
离萼杓兰 C. plectrochilum Franch 纳帕村 99°3751″ 27°5140″ 3 349
云南杓兰 C. yunnanense Franch 吉能村 99°3921″ 27°4757″ 3 299
西藏杓兰 C. tibeticum King et Ｒolfe 天生桥 99°4912″ 27°4813″ 3 376
紫点杓兰 C. guttatum Sw. 纳帕村 99°3751″ 27°5140″ 3 349
1. 2 方法
1. 2. 1 样品总 DNA的提取
采用 DNA 试剂盒 (北京天根生化科技公司)
提取各样品中的总 DNA。每种杓兰有 20 个样品，
5 种杓兰总计 100 个样品。
1. 2. 2 真菌 ITS区段扩增
采用 Nested PCＲ 方法扩增，第一轮 PCＲ 扩增
引物为 NSI1 和 NLB4 (NSI1:5’-GATTGAATG-
GCTTAGTGAG-3’，NLB4:5’-GGATTCTCACCCTC-
TATGA-3’)。反应体系和反应条件按 PrimeSTAＲ
95第 4 期 缪福俊等:香格里拉 5 种杓兰属植物菌根真菌的多样性分析
Max DNA Premix试剂盒说明操作。反应体系为:1
μL 模板 DNA、1 μL NSI1、1 μL NLB4、9. 5 μL
ddH2O、12. 5 μL PrimeSTAＲ Max DNA Premix (2
×)。反应条件为 98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 10 s，
30 次循环。
第二轮 PCＲ 扩增引物为 NSI1-F 和 ITS4
(NSI1-F: 5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’，
ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。反应
体系和反应条件按 PrimeSTAＲ Max DNA Premix 试
剂盒说明操作。反应体系为:1 μL 第一轮 Nested
PCＲ产物做模板 DNA、1 μL NSI1-F、1 μL ITS4、
9. 5 μL ddH2O、12. 5 μL PrimeSTAＲ Max DNA Premix
(2 ×)。反应条件为 98℃ 10 s，55℃ 5 s，72℃ 10
s，30 次循环。
将能够扩增出目标条带的阳性 ITS-PCＲ 产物，
分别用限制性内切酶 Hinf1 和 Alu1 进行酶切分析。
反应体系为:3 μL PCＲ 产物、1 μL 内切酶缓冲液
(10 ×)、1μL内切酶、5 μL ddH2O。37℃水浴 4 h。
经电泳检测，比较各个单克隆酶切条带的多态性，
分析 ＲFLP (限制性片段长度多态性 restriction frag-
ment length polymorphism)带型。将代表不同的
ＲFLP带型的单克隆样品挑出，连接载体 pEASY-
Blunt转入 Trans1-T1 感受态细胞中，挑取阳性克
隆，用菌液 PCＲ 法 (M13F、M13Ｒ 引物)鉴定重
组子，确认包含重组子的克隆，送上海生工公司用
M13F、M13Ｒ 引物测序。测序结果用 DNAman 去
除载体后使用在线软件 NCBI Blast进行比对分析。
1. 2. 3 数据分析
集中性测度:λ = Σ［Ni(Ni － 1)/N(N － 1) ］;
多样性测度:D = 1 － Σ［Ni(Ni － 1)/N(N － 1) ］，
公式中 N为样方中物种总体个数，Ni 为第 i 种个
体数［16］。
2 结果与分析
2. 1 杓兰属植物菌根真菌 ITS序列分析
从 5 种杓兰属植物的菌根中直接提取的总
DNA，通过 nested-PCＲ 扩增及克隆建立了 5 种菌
根真菌克隆库，通过 NCBI 比对，总共得到了 388
个单克隆属菌根真菌 (见表 2)。其中，从黄花杓
兰的菌根中得到 93 个单克隆，从离萼杓兰的菌根
中得到 80 个单克隆，从云南杓兰的菌根中得到 56
个单克隆，从西藏杓兰的毛根中得到 88 个单克隆，
从紫点杓兰的毛根中得到 71 个单克隆。根据真菌
类型共完成 16 条 rDNA ITS 序列测序，其 Gen-
BANK登录号见表 2。
表 2 杓兰属植物菌根真菌 rDNA ITS序列克隆数量
Tab. 2 The clone numbers of rDNA ITS sequences of mycorrhizal fungi from Cypripedium plants
寄主
植物
克隆
数
多样性
测度
ＲFLP
类型
GenBank
登录号
属名
GenBank中
最相近菌株
相似度
/%
克隆
数
频率
/%
黄花
杓兰
93 0. 511
HE-11 KM277615 瘤菌根菌
属
Epulorhiza sp.
AJ313445. 1 619 /637(97) 54 58. 1
HT-12 KM277616 胶膜菌属
Tulasnella calospora
AY643804. 3 580 /591(98) 35 37. 6
HU-13 KM277617 归属未定
Unidentified fungi
DQ790793. 1 505 /515(98) 4 4. 3
离萼
杓兰
80 0. 738
LT-21 KM277618 胶膜菌属
Tulasnella calospora
FJ613266. 1 614 /621(99) 30 37. 5
LS-22 KM277619 归属未定
Unidentified fungi
GQ219927. 1 654 /673(97) 25 31. 3
LＲ-23 KM277620 丝核菌属
Ｒhizoctonia sp.
AF478451. 1 626 /646(97) 17 21. 2
LM-24 KM277621 念珠菌根
菌属
Moniliopsis anomala
AF345557. 1 583 /597(98) 8 10
云南
杓兰
56 0. 528
YU-31 KM277622 归属未定
Unidentified fungi
DQ790793. 1 504 /516(98) 29 51. 8
YT-32 KM277623 胶膜菌属
Tulasnella calospor
FJ613266. 1 618 /622(99) 20 35. 7
YC-33 KM277624 毛壳菌属
Chaetomium sp.
KC283189. 1 522 /538(97) 7 12. 5
06 西 部 林 业 科 学 2015 年
续表 2
寄主
植物
克隆
数
多样性
测度
ＲFLP
类型
GenBank
登录号
属名
GenBank中
最相近菌株
相似度
/%
克隆
数
频率
/%
西藏
杓兰
88 0. 580
XＲ-42 KM277626 丝核菌属
Ｒhizoctonia sp.
AF478451. 1 641 /645(99) 55 62. 5
XC-41 KM277625 角担菌属
Ceratobasidium sp.
JQ768036. 1 657 /678(97) 18 20. 5
XU-43 KM277627 归属未定
Unidentified fungi
DQ790793. 1 505 /515(98) 15 17
紫点
杓兰
71 0. 495
ZF-51 KM277628 层孔菌属
Fomes fomentarius
EU273503. 1 648 /661(98) 43 60. 6
ZＲ-53 KM277630 丝核菌属
Ｒhizoctonia sp.
AF478451. 1 633 /645(98) 25 35. 2
ZC-52 KM277629 伏革菌属
Corticium salmonicolor
EU435011. 1 707 /721(98) 3 4. 2
黄花杓兰菌根真菌涉及 3 个真菌属，分别属于
胶膜菌属 (Tulasnella)、瘤菌根菌属和归属未定真
菌 Unidentified fungi。其中，瘤菌根菌属占大多数，
频率为 58. 1 %，同源性为 97 %，其次是胶膜菌
属;离萼杓兰菌根真菌涉及 4 个真菌属，分别属于
胶膜菌属、丝核菌属 (Ｒhizoctonia)、念珠菌根菌
属 (Moniliopsis)和归属未定真菌。其中，胶膜菌
属占大多数，频率为 37. 5 %，与美胞胶膜菌 (Tu-
lasnella calospora)的同源性高达 99 %，可初步确
定为美胞胶膜菌;云南杓兰菌根真菌涉及 3 个真菌
属，分别属于归属未定真菌、胶膜菌属和毛壳菌
属。其中归属未定占大多数，频率为 51. 8 %;西
藏杓兰菌根真菌涉及 3 个真菌属，分别属于丝核菌
属、角担菌属 (Ceratobasidium)和归属未定真菌。
其中，丝核菌属占大多数，频率为 62. 5 %，与立
枯丝核菌 (Ｒhizoctonia solani)的同源性高达 99 %，
可初步确定为立枯丝核菌;紫点杓兰菌根真菌涉及
3 个真菌属，分别属于层孔菌属 (Fomes)、丝核菌
属和伏革菌属 (Corticium)。层孔菌属占大多数，
频率为 60. 6 %，同源性为 98 %，其次是丝核菌
属。
2. 2 杓兰属植物菌根真菌类型分析
从表 3 可见，5 种杓兰属植物菌根真菌共涉及
8 个菌属，在兰科植物菌根中已有报道，还有一类
归属未定真菌，所占频率为 18. 8 %。说明杓兰属
植物菌根系统中存在丰富多样的真菌群落。丝核菌
属在杓兰属植物菌根真菌系统中占有较高的比例，
高达 25. 0 %，且在离萼杓兰、西藏杓兰和紫点杓
兰中均出现;其次，胶膜菌属在黄花杓兰、离萼杓
兰和云南杓兰菌根中均出现，频率高达 21. 9 %，
表明胶膜菌属和丝核菌属可能是兰科植物所特有的
菌根真菌，能同时存在于多种杓兰属植物菌根系统
中。频率低于 10 %的菌属，如伏革菌属、毛壳菌
属等可能对杓兰属植物有着一定的寄主专一性。
表 3 杓兰属植物菌根不同属真菌的比例
Tab. 3 The number ratio from different of mycorrhizal fungi
from Cypripedium plants
序号 真菌类型 克隆数 频率 /%
1 丝核菌属 Ｒhizoctonia 97 25. 0
2 胶膜菌属 Tulasnella 85 21. 9
3 角担菌属 Ceratobasidium 18 14. 2
4 瘤菌根菌属 Epulorhiza 54 13. 9
5 归属未定 Unidentified 63 18. 8
6 层孔菌属 Fomes 43 11. 1
7 念珠菌根菌属 Moniliopsis 8 2. 1
8 毛壳菌属 Chaetomium 7 1. 8
9 伏革菌属 Corticium 3 0. 7
3 结论与讨论
本研究首次采用免培养技术对杓兰属植物的菌
根真菌多样性进行研究，省去菌根真菌纯培养分离
过程，直接对菌根进行总 DNA 的提取，并用真菌
ITS区两对引物 NSI1 /NLB4 和 NSI1-F /ITS4 直接从
总 DNA中扩增获得菌根真菌的 ITS 区段。从 5 种
不同的杓兰属植物菌根中克隆得到 388 个真菌 ITS-
taxa，杓兰属菌根真菌生态系统中存在丰富多样的
真菌类型，分别属于担子菌门的 7 个属、1 类归属
未定真菌和子囊菌门的 1 个属。此方法能较好地反
映杓兰属植物菌根真菌多样性水平，能快速地获得
菌根真菌生态系统中的真菌群落类型。
16第 4 期 缪福俊等:香格里拉 5 种杓兰属植物菌根真菌的多样性分析
目前已报道的兰科菌根真菌主要有担子菌亚门
的 13 个属〔胶膜菌属、腊壳耳属、角担菌属、层
孔菌属、蜜环菌属 (Armillaria)、伏革菌属等〕、
半知菌亚门的 14 个属 〔丝核菌属、瘤菌根菌属、
角菌根菌属 (Ceratorhiza)、念珠菌根菌属、青霉
菌属 (Penicillium)等〕和子囊菌亚门的 2 个属
〔毛壳菌属和微囊菌属 (Microascus)〕［9，17］。从本研
究中获得的 10 类菌根真菌类型在杓兰属植物菌根
系统中为首次报道，可能还存在有其他未知的真菌
种类。ＲFLP技术方法存在明显的不足，数据区分
度还不够灵敏，从酶切带型上来看序列分属于不同
ＲFLP 类型的 KM277617、KM277622、KM277627
和 KM277623、KM277618，基于 ITS序列结果分析
它们应该分别属于同一种真菌类群。再加上本研究
所采用的引物为真菌通用引物，可能存在局限性，
覆盖范围较小，不能全面地反映出杓兰属植物菌根
真菌的种类。
胶膜菌属在杓兰属植物菌根真菌生态系统中都
占有较大的比例。这与已有的研究结果一致，王丽
琨在对兰科菌根真菌进行研究发现，胶膜菌属美孢
胶膜菌能显著促进兰科植物 〔石斛 (Dendrobium
candidum)和地宝兰 (Geodorum eulophioides)〕的
种子萌发，并进一步通过 CaCl2 － PEG 介导的原生
质体转化技术证明该菌属为兰科植物典型的菌根真
菌［1 8］。另外，丝核菌属也在 3 种杓兰属植物的菌
根中均有发现，这在一定程度上说明胶膜菌属和丝
核菌属在杓兰属植物菌根系统中为特有的真菌，一
种真菌同时存在于多种杓兰属植物菌根系统中。在
每种杓兰植物的菌根系统中均涉及 3 种类型以上的
真菌，说明不同种的真菌能促进同一种杓兰植物生
长发育。这很可能是因为这些真菌皆能提供杓兰属
植物萌发生长所需要的营养物质，它们之间存在营
养专一性，相关的研究也表明，真菌与寄主植物间
存在着一定的营养专一性［11，14］。杓兰属植物与菌
根真菌的营养专一性机理尚待今后作进一步研究。
参考文献:
［1］陈心启，吉占和，罗毅波．中国野生兰科植物彩色图
鉴［M］．北京:科学出版社，1999．
［2］赵国英，徐宝萍，董然．杓兰属植物研究现状［J］．北
方园艺，2013(8) :185-188．
［3］蒋明，李温平，周晶，等． 10 种杓兰属植物 rDNA ITS
序列的克隆与分析［J］． 浙江大学学报(理学版) ，2012，39
(6) :659-695．
［4］于永福．中国兰花状况调查［J］．森林与人类，2004
(5) :26-27．
［5］Cribb P． The genus Cypripedium［M］． Portland:Tim-
ber Press，1997．
［6］郑桂灵，李鹏，台永东，等． 杓兰属植物的开花和结
实动态［J］．生态学报，2010，30(12) :3182-3187．
［7］Dearnaley JDW． Further advances in orchid mycorrhi-
zal research［J］． Mycorrhiza，2007，17(6) :475-486．
［8］Liu HL，Luo YB，Liu H． Studies of mycorrhizal fungi of
Chinese orchids and their role in orchid conservation in China-a
review［J］． Botanical Ｒeview，2010(76) :241-262．
［9］Oliveira SF，Bocayuva MF，Veloso TG，et al． Endophyt-
ic and mycorrhizal fungi associated with roots of endangered n-
ative orchids from the Atlantic Forest，Brazil［J］． Mycorrhiza，
2014，24(1) :55-64．
［10］王芝娜，李杰，张银杰． 中国兰属植物菌根真菌的
rDNA ITS分析［J］．西北农林科技大学学报(自然科学版) ，
2013，41(4) :191-196．
［11］王瑞苓，胡虹，李树云． 黄花杓兰与菌根真菌共生
关系研究［J］．云南植物研究，2004，26(4) :445-450．
［12］臧穆，王瑞苓，胡虹． 黄花杓兰根内的小型菌核
［J］．云南植物研究，2004，26(5) :495-496．
［13］侯天文，金辉，刘红霞，等．四川黄龙沟优势兰科植
物菌根真菌多样性及其季节变化［J］． 生态学报，2010，30
(13) :3424-3442．
［14］高倩，李树云，胡虹． 四种杓兰的菌根结构及其周
年动态［J］．广西植物，2009，29(2) :187-191．
［15］赵欣宇，缪福俊，李璐，等．云南杓兰和紫点杓兰菌
根真菌的 rDNA ITS 序列及共生专一性分析［J］．西部林业科
学，2014，43(3) :57-61．
［16］杨持．生态学实验与学习［M］．北京:高等教育出
版社，2005．
［17］黄运峰，杨小波．兰科菌根研究综述［J］．热带亚热
带植物学报，2008，16(3) :283-288．
［18］王丽琨． 美孢胶膜菌原生质体制备与 CaCl2-PEG
转化初步试验［D］．北京:北京林业大学，2013:39-45．
26 西 部 林 业 科 学 2015 年