全 文 ：郑艳冰，丛永柱，吴 琼，等． 10 种金发藓科植物 ＲAPD分子系统学研究［J］． 江苏农业科学，2014，42(11):58 － 60．
doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2014． 11． 016
10 种金发藓科植物 ＲAPD分子系统学研究
郑艳冰1，丛永柱1，吴 琼1，沙 伟2
(1．黑龙江黑河学院，黑龙江黑河 164399;2．黑龙江齐齐哈尔大学，黑龙江齐齐哈尔 161006)
摘要:利用改良 CTAB法提取 10 种金发藓科(Polytrichales)植物基因组 DNA，利用 ＲAPD和分子标记技术对其进
行遗传多样性研究。结果表明，在供试材料中筛选到具有多态性的 ＲAPD引物 12 个，这些 ＲAPD引物共扩增出 68 条
带，多态性带 42 条，多态性条带比率(PPB)为 61． 76%;采用 UPGMA聚类分析，供试材料分为 2 大类群，细叶拟金发藓
单独聚为 1 类，其余 9 种植物聚为 1 类。ＲAPD和分子标记技术可用于金发藓科植物系统学研究。
关键词:金发藓科;ＲAPD;系统学;遗传多样性
中图分类号:Q75 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2014)11 － 0058 － 03
收稿日期:2014 － 02 － 14
基金项目:黑龙江省教育厅科技项目(编号:12531437)。
作者简介:郑艳冰(1976—)，女，黑龙江黑河人，硕士，副教授，主要从
事植物遗传学研究。Tel:(0456)6842168;E － mail:yanbing-
zheng1234@ 163． com。
金发藓科(Polytrichales)为金发藓目中唯一的 1 个科，全
世界共有 19 个属，其中，Eopolytrichum 为 1 个化石属［1］。
Schofield保守估计认为金发藓目大约有 370 种［2］，但新近判
断认为，该目实际上的种数不超过 200 种［3］。对金发藓科一
些属种的分类地位，不同学者有不同的认识［4 － 8］。吴鹏程等
将穗发藓属的主要种类及拟仙鹤藓属和新金发藓属归并入小
金发藓属;将金发藓属中孢蒴口部盖膜呈肉质的种划入拟金
发藓属［9］。Zouhair等利用随机扩增引物对金发藓属 6 种植
物进行 ＲAPD 分析，共获得 166 条多态性 DNA 片段，根据
ＲAPD分子标记结果，将 6 种植物分为 2 大类群，即金发藓、
拟金发藓和 P． c． var． perigoniale为 1类，桧叶金发藓、毛尖金发
藓和 P． strictum为 1类，第 1大类中金发藓与拟大金发藓之间
的亲缘关系更近一些［10］。金发藓科的许多植物在经典分类学
上分类地位不清，且一些分子标记的试验结果与经典分类学结
论相悖，这为金发藓科系统学研究提供了更广阔的空间。本研
究采用 ＲAPD分析方法，对金发藓科 10 种藓类植物进行遗传
聚类分析，以期为更好地研究藓类植物的分类地位奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
供试材料为自然风干的标本及 2012 年采集的新鲜标本，
材料种名、采集地等信息见表 1。
表 1 供试材料信息
编号 种名 采集地 标本凭证号
1 细叶拟金发藓 Polytrichastrum longisetum (Sw． ex Brid．)G． Sm． 丰林保护区 沙伟 04002
五营河 沙伟 04016
小兴安岭 沙伟 04020
2 毛尖金发藓 Polytrichum piliferum Schrad． ex Hedw． 老黑山 郑艳冰 12009
3 桧叶金发藓 Polytrichum juniperinum Hedw． 老黑山 郑艳冰 12005
4 台湾拟金发藓 Polytrichastrum formosum (Hedw．)G． Sm． 小兴安岭 沙伟 04008
大兴安岭 沙 伟 99170
5 硬叶小金发藓 Pogonatum neesii (C． Muell．)Dozy 东北 沙伟 175
6 拟金发藓 Polytrichastrum alpinum (Hedw．)G． Sm． 老黑山 郑艳冰 124018
7 多形拟金发藓 Polytrichastrum ohioense (Ｒen． et Card)G． Sm． 丰林保护区 沙伟 04026
8 小仙鹤藓 Atrichum crispulum Schimp． ex Besch． 五营河 沙伟 04004
都江堰 汪楣芝 57315
9 小胞仙鹤藓 Atrichum rhystophyllum (C． Muell．)Par． 丰林保护区 沙伟 04022
丰林公园 沙伟 04023
大兴安岭 沙伟 99011
10 细疣小金发藓 Pogonatum dentatum (Brid．)Brid． 长白山 沙伟 20381
1． 2 仪器及药品
1． 2． 1 仪器 美国产 PE － 9600 型 PCＲ仪;北京六一仪器厂
产 DY －3 型电泳仪和 DYCP － 33A 型水平板电泳槽;日本产
7A0 － 0012 型 Gene Specl、SANYO 制冰机和 NUALＲ － 6382E
型超低温冰箱;河北省黄骅航天仪器厂产 DZKW － D 型水浴
锅;德国产高速冷冻离心机 HEＲMLE Z323K;1 mL和 20、200、
100 μL微量加样器;UVP GDS － 8000 型紫外凝胶成像系统;
Barnstead纯水仪;PHS － 25 型酸度计;北京赛多利斯天平有
限公司产电子天平。
1． 2． 2 药品 Tris、HCl、EDTA、NaOH、溴化乙锭(EB)、乙酸
钠、冰乙酸、TE、CTAB、NaCl、TBE、乙醇、氯仿、异戊醇、溴酚
蓝、蔗糖、抗坏血酸钠、PVP和 3% β －巯基乙醇等，均为分析
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纯(AＲ);4 种 dNTP、TaqDNA 聚合酶及 A、B、C、D、H、Y 组引
物，均为上海生工生物工程股份有限公司产品;DGL 2000
Marker，为大连宝生物公司产品。
1． 3 试验方法
1． 3． 1 DNA提纯、保存及检测 采用改良 CTAB 法提取试
材 DNA;放入 － 20 ℃冰箱储存或放入 4 ℃冰箱待用;利用核
酸检测仪通过紫外吸收法对 DNA 样品进行定量分析和纯度
检测，并用琼脂糖电泳检测 DNA。
1． 3． 2 ＲAPD扩增
1． 3． 2． 1 扩增反应体系 ＲAPD 扩增体系总体积为 25 μL，
其中，10 × buffer、25 mmol /L Mg2 +、10 mmol /L each dNTP、
25 g /L TemplateDNA、5 000 U /mL Taq polymerase和 10 mmol /L
Primer等组分体积分别为 2． 5、2． 0、1． 0、1． 0、0． 3、0． 8 μL，用
无菌 ddH2O补足。
1． 3． 2． 2 扩增反应程序 94 ℃ 2 min;94 ℃ 1 min，36 ℃
1 min，72 ℃ 2 min，43 个循环;72 ℃ 5 min，1 个循环。
1． 3． 2． 3 ＲAPD 反应体系的优化 ＲAPD 反应体系为
25 μL，扩增引物为 A11。针对反应体系中模板 DNA、dNTP、
引物和 Taq酶浓度等 4 个组分，L16(5
4)正交试验基础上进一
步进行 L9(4
3)正交设计(表 2、表 3)，以寻求最优方案。
表 2 各组分浓度水平
水平
模板 DNA
(ng)
dNTP
(mmol /L)
Taq酶
(U)
引物
(mmol /L)
1 15 0． 3 1． 5 0． 3
2 20 0． 4 2． 0 0． 4
3 25 0． 5 2． 5 0． 5
表 3 L9(43)正交试验验的因素和水平处理组合
组合
模板 DNA
(ng)
dNTP
(mmol /L)
Taq聚合酶
(U)
引物
(mmol /L)
1 1(15) 1(0． 3) 1(1． 5) 1(0． 3)
2 1(15) 2(0． 4) 2(2． 0) 2(0． 4)
3 1(15) 3(0． 5) 3(2． 5) 3(0． 5)
4 2(20) 1(0． 3) 3(2． 5) 2(0． 4)
5 2(20) 2(0． 4) 1(1． 5) 3(0． 5)
6 2(20) 3(0． 5) 2(2． 0) 1(0． 3)
7 3(25) 1(0． 3) 2(2． 0) 3(0． 5)
8 3(25) 2(0． 4) 3(2． 5) 2(0． 4)
9 3(25) 3(0． 5) 1(1． 5) 1(0． 3)
1． 3． 4 扩增产物的检测 扩增结束，在反应混合物中加入
5 mL /L 上样缓冲液，混匀;取 15 μL 点入 1． 5%琼脂糖凝胶
中，用 0． 5 × TBE 电泳缓冲液在 3 V /cm(84 V)电场下电泳
2 ～ 3 h，经 0． 25 mg /L溴化乙锭染色 30 min，在紫外凝胶成像
系统下观察照相和分析。
1． 3． 5 引物筛选 正式扩增前，任意选取系统进化差异较大
的 2 个不同品种 DNA，以这 2 个品种均能扩增出清晰条带、
重复性和多态性好的为引物选择依据，对上海生工生产的 A、
B、C、D、H、Y组共 6 组随机引物进行筛选。
1． 3． 6 数据处理 在筛选出的引物中，选取扩增清晰、稳定、
重复性好的引物进行条带统计。电泳获得基因组扩增图谱的
每 1 条带(DNA片段)均为 1 个分子标记，并代表引物的 1 个
结合位点;根据各分子标记在相同电泳迁移率的有无，统计得
到所有位点的二元矩阵，有 DNA 扩增带(显性)记为“1”，无
带记为“0”，强带或可分辨的弱带赋值均为“1”;用 NTSYS －
PC软件处理 ＲAPD数据，依据 NEI － LI法计算各品种间的遗
传相似度，按照类平均法(UPGMA)建立亲缘关系树状图。
2 结果与分析
2． 1 ＲAPD反应体系优化
在 L9(4
3)正交试验设计中，组合 1、3 扩增出 2 条带，组
合 2 扩增出 4 条带，组合 5 扩增出 1 条带，其余组合未扩增出
条带;组合 2 的多态性及清晰度最好，最佳 ＲAPD扩增反应条
件为反应总体积 25 μL、dNTP 为 0． 4 mmol /L、引物为
0． 4 mmol /L、基因组 DNA为 15 ng、Taq 酶 2． 0 U，其他成分为
无菌 ddH2O。
2． 2 引物筛选
利用优化反应体系对上海生工生物工程股份有限公司生
产的 A、B、C、D、H、Y组 120 条引物进行筛选，共筛选出 12 条
多态性好的引物(表 4)，用于全部供试样品 DNA的扩增。
表 4 筛选出的引物及其序列
引物 序列 引物 序列
SBSA － 02 TGCCGAGCTG SBSD － 11 AGCGCCATTG
SBSA － 10 GTGATCGCAG SBSH －03 AGACGTCCAC
SBSB － 08 GTCCACACGG SBSH －19 CTGACCAGCC
SBSC － 02 GTGAGGCGTC SBSH －20 GGGAGACATC
SBSC － 05 GATGACCGCC SBSY － 04 GGCTGCAATG
SBSD － 08 GTGTGCCCCA SBSY － 06 AAGGCTCACC
2． 3 扩增结果
选用重复性和多态性较好、谱带清晰的 12 条引物对 4 属
10 种金发藓科植物样品进行 ＲAPD 扩增，结果由图 1、图 2、
图 3 和表 5 可见，每个引物的扩增片段在 2 ～ 9 条之间;12 个
随机引物共获得 68 条谱带，即共检测到 68 个位点，平均每个
引物检测到 5． 67 个位点，其中，多态性条带为 42 条，多态百
分率为 61． 76%。
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2． 4 聚类分析
基于 ＲAPD扩增结果，用 UPGAM法进行聚类分析，得到
供试材料相似性系数表和 10 种金发藓科植物系统学关系树
状图。由表 6 和图 4 可见，10 种金发藓科植物的遗传相似性
系数在 0． 02 ～ 0． 96 之间，说明这 10 种植物亲缘关系较近;细
叶拟金发藓与其他种遗传距离较远，自为 1 类，其余 9 种聚为
1 类;其他 9 种植物的遗传相似性系数在 0． 64 处又可分 2 两
类，即硬叶小金发藓和细疣小金发藓聚为 1 类，其余 7 种聚为
表 5 12 个引物对 10 个供试材料的扩增结果
引物
扩增带数
(条)
多态带数
(条)
多态带百分率
(%)
SBSA － 02 7 7 100． 00
SBSA － 10 5 4 80． 00
SBSB － 08 9 5 55． 56
SBSC － 02 9 6 66． 67
SBSC － 05 2 2 100． 00
SBSD － 08 8 6 75． 00
SBSD － 11 6 2 33． 33
SBSH － 13 5 2 40． 00
SBSH － 19 4 1 25． 00
SBSH － 20 6 3 50． 00
SBSY － 04 5 3 60． 00
SBSY － 06 2 1 50． 00
1 类;这 7 种植物在遗传相似性系数 0． 78 处又可聚为 2 类，
即小仙鹤藓和小胞仙鹤藓聚为 1 类，台湾拟金发藓、拟金发
藓、多形拟金发藓、毛尖金发藓和桧叶金发藓聚为 1 类。这说
明 10 种金发藓科植物遗传相似性极高，与形态解剖学及其形
态分类学地位表现出高度的一致性，这也与 Hyvnen 等结
论［3，11］相一致。
表 6 10 种金发藓科植物 ＲAPD遗传相似度
材料编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 1． 000 0
2 0． 017 9 1． 000 0
3 0． 017 9 0． 910 7 1． 000 0
4 0． 017 9 0． 767 9 0． 714 3 1． 000 0
5 0． 017 9 0． 660 7 0． 678 6 0． 678 6 1． 000 0
6 0． 017 9 0． 750 0 0． 696 4 0． 946 4 0． 732 1 1． 000 0
7 0． 017 9 0． 785 7 0． 803 6 0． 839 3 0． 803 6 0． 821 4 1． 000 0
8 0． 017 9 0． 803 6 0． 785 7 0． 714 3 0． 571 4 0． 696 4 0． 767 9 1． 000 0
9 0． 017 9 0． 732 1 0． 678 6 0． 821 4 0． 678 6 0． 767 9 0． 803 6 0． 714 3 1． 000 0
10 0． 017 9 0． 660 7 0． 607 1 0． 678 6 0． 928 6 0． 696 4 0． 803 6 0． 607 1 0． 750 0 1． 000 0
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