全 文 ：分子标记及其在芸薹属植物育种中的应用
张俊华1,崔崇士2*,潘春清1
(1.东北农业大学农学院,黑龙江 哈尔滨 150030;2.东北农业大学园艺学院,黑龙江 哈尔滨 150030)
摘 要:随着生物技术的迅猛发展,分子标记技术的应用越来越受到生物学家及育种家的重视,应用也日趋
广泛。文章综述了近年来RFLP、RAPD、SSR、CAPS、AFLP等几种DNA分子技术及其在芸薹属植物育种中的应用。
关键词:分子标记;芸薹属植物;DNA多态性
中图分类号:S634;S603.8 文献标识码:A
收稿日期:2005-09-26
基金项目:国家863计划项目(2003AA207120)
作者简介:张俊华(1973-),男,山东人,副教授,博士研究
生,从事植物抗病性原理及抗病基因分子标记技术研究与教学工作。
*通讯作者
分子标记是指以生物大分子的多态性为基础
的遗传标记。分子标记技术的出现,使植物育种
中的“间接选择”成为可能,提高了遗传分析的
准确性和选种的有效性,因而在遗传育种领域愈
来愈受到重视,将二者有机结合是今后育种工作
的趋势。
目前植物遗传标记有 4种:①形态标记,这
是传统的最重要的鉴定方法;②生化标记,这是
建立在现代仪器分析的基础上主要依据部分化学
成分,尤其是有效成分的化学分析对植物进行标
记和分类的方法;③细胞标记,主要是染色体核
型和带型特征;④分子标记,是以生物大分子的
多态性为基础的一种遗传标记,即指可遗传并可
检测的生物大分子标记。广义上讲,分子标记包
括两类,即同工酶标记和DNA标记。狭义的分子
标记仅指DNA标记。
1 同工酶标记
同工酶是指一类底物相似或完全相同的酶分
子形式,即催化同一反应而结构不同的一簇酶。
它们可能由等位基因决定,也受到非等位基因的
控制,前者称为“等位酶”。由于不同的同工酶形
式在分子量和电荷等方面的差异,可以利用凝胶
电泳技术将它们分开,用专一的底物和特殊的染
料染色,在胶柱中呈现同工酶谱,并可以借助光学
扫描技术和相应的计算机分析软件进行定量分析。
同工酶作为生物基因表达的产物,受到严格的遗传
控制。所以同工酶可以作为物种的遗传标记,对于
物种和亲缘关系的鉴定、新物种的寻找和开发、植
物的发育生物学分析等方面具有一定的意义,在分
子标记的发展中起到重要作用[1]。
因为同工酶是基因表达的产物,受到生物在发
育过程中基因表达的时序控制,所以同一生物的不
同发育期会表现出不同的同工酶酶谱,这给物种间
关系的研究造成了一定的干扰。因此同工酶分析在
植物的研究上受到发育阶段和环境条件的影响,在
研究中特别强调取材的一致性。另外,尽管等位酶
的表现型与基因型有较好的关联,但它只能反映一
部分功能基因(外显子)的情况,而对大部分功能基
因和大量非功能基因无法表现,使其在应用范围上
有一定的局限性。因此在遗传多样性、QTL(数量
性状基因定位)制图、分子标记辅助育种、分子进
化等需要大量标记的研究中,同工酶标记逐渐为
DNA标记所取代。尽管如此,同工酶分子标记以
其共显性表达、重复性强、操作简便等优点使其仍在种
群遗传、分子进化、适应的分子基础、功能基础的克隆
等方面具有DNA标记所不可替代的作用。
2 DNA分子标记
DNA分子标记是指生物基因组DNA经限制性
内切酶酶切、聚合酶链式反应(PCR)扩增或两者结
合等措施处理后电泳,检测到的反映基因组某种变
异特征的特异性 DNA片段。与其他标记相比,
第37卷 第5期 东 北 农 业 大 学 学 报 37(5):700~705
2006年10月 JournalofNortheastAgriculturalUniversity Oct.2006
文章编号 1005-9369(2006)05-0700-06
DNA分子标记具有以下优点:①由于是直接反映
DNA分子水平上的变异,因而能对各发育时期的
个体、各个组织、器官甚至细胞作检测,既不受环
境的影响,也不受基因表达与否的限制,为研究工
作提供了极大的便利;②DNA分子标记对生物体
通常没有不良影响,也不影响生物性状的表现,即
表现为“中性”;③多数分子标记表现为共显性,
能分辨所有的基因型;④DNA分子标记的等位位
点变异水平比表型标记丰富得多,即多态性很高,
以致无须专门创造特殊的遗传材料;⑤其数量极
大,几乎是无限制的,遍及整个基因组。DNA分
子标记的所有这些特性,奠定了其具有广泛应用性
的基础。
目前已发展了很多不同类型的 DNA分子标
记,根据其技术特点可将其分为4类[2]。
2.1 基于DNA-DNA杂交的DNA标记
通过限制性内切酶酶解不同生物体的 DNA分
子后,利用同位素或非同位素标记的随机基因组克
隆、cDNA克隆、微卫星或小卫星序列等作为探针
进行DNA间杂交及放射自显影或非同位素显色技
术来揭示DNA的多态性。主要包括VNTR标记和
RFLP标记。
VNTR标记产生的多态性是由同一座位上的串
联单元数量的不同而产生的。许多生物体的 DNA
存在含有大量的串联重复序列的高变异区。以
15~75个核苷酸为基本单元的串联重复序列称为小
卫星(minisatelites),以 2~6个核苷酸为基本单元
的简单串联重复序列称为微卫星(microsatelites)或
简单序列重复(SSR)。小卫星和微卫星也常常称作
重复数可变串联重复(VNTR)标记。
利用限制性内切酶处理不同生物个体的DNA,
通过显示含有同源序列的酶切片段的大小,来检测
个体间差异的技术叫RFLP技术。其基本原理是酶
识别序列内的点突变由于部分 DNA片段的插入、
缺失、易位和倒位等引起酶切位点的缺失或获得,
这种限制性位点的改变使利用限制性内切酶切割
DNA所得的片段发生变化,从而导致限制性片段
的多态性。由于长期进化,植物的种、属间甚至品
种间同源DNA序列的限制性内切酶识别位点各不
相同,因此通过比较DNA片段的多态性,可以揭
示种、属间甚至种间的差异及相关性[3]。
其测定的方法是将样品 DNA用适当的限制性
内切酶酶切,形成不同长度的限制性片段,用
DNA探针进行 Southern杂交并发射自显影,就可
得到与探针同源的DNA序列在长度上的差异。
2.2 基于PCR技术的DNA标记
PCR技术是一种利用酶促反应对特定DNA片
段进行体外扩增的技术,此技术只需非常少量的
DNA样品,在短时间内以样品DNA为模板合成上
亿个拷贝。经过电泳分离、染色或放射自显影,即
可显示出所扩增的特定 DNA区段。它具有快捷、
简易、灵敏等优点,已被广泛地应用于分子克隆、
遗传病的基因诊断、法医学、系统分类学、遗传学
和育种学等方面,在DNA标记技术的发展上起到
了巨大的作用。根据所用引物的类型不同,基于
PCR的 DNA标记可分为随机引物的 PCR标记和
特异引物的PCR标记。
2.2.1 随机引物PCR标记
随机引物 PCR标记利用引物的核苷酸序列是
随机的,其扩增的DNA区段是事先未知的。应用
这种标记技术可在基因组中寻找未知的多态性座位
作为新的 DNA标记。随机引物 PCR扩增的 DNA
区段产生多态性的分子基础是模板 DNA扩增区段
上引物结合位点的碱基序列发生了突变。因此,不
同来源的基因组在该区段(座位)上将表现为扩增产
物有无的差异或扩增片段大小的差异。目前,常用
的 随 机 引 物 PCR标 记 主 要 有 可 分 为 RAPD、
AP-PCR、DAF、ISSR等。
2.2.1.1 RAPD标记
为了提高揭示DNA多态性的能力RAPD标记
所用的引物长度通常为 9~10个碱基,大约只有常
规的 PCR引物长度的一半。由于引物较短,所以
在 PCR中必须使用较低的退火(DNA复性)温度,
以保证引物能与模板 DNA结合。RAPD引物已经
商品化,可以向有关供应商直接购买,不需要自己
合成。商品化的 RAPD引物基本能覆盖整个基因
组,检测的多态性远远高于RFLP[4]。
2.2.1.2 DAF标记
与RAPD标记原理相似,但 DAF标记所使用
的引物比 RAPD标记的更短,一般为 5~8个核苷
酸,因而与模板DNA随机结合的位点更多,扩增
得到的 DNA条带也更多,检测多态性的能力更
强。在多态性程度比较低的作物如小麦上,DAF
技术是一种很有用的寻找 DNA分子标记的手段。
张俊华等:分子标记及其在芸薹属植物育种中的应用 ·701·第5期
但由于DAF使用了更短的引物,因而其PCR稳定
性比RAPD更低。
2.2.1.3 AP-PCR标记
也与 RAPD原理相似,与 RAPD区别的是
AP-PCR标记上所使用的引物较长,通常为 18~24
个碱基。因此,其 PCR反应条件与常规一样,稳
定性要比 RAPD好,但揭示多态性的能力要比
RAPD低。
2.2.1.4 ISSR标记
该技术检测的是两个SSR之间的一段短 DNA
序列上的多态性。利用真核生物基因组中广泛存在
的 SSR序列,设计出各种能与 SSR序列结合的
PCR引物,对两个相距较近、方向相反的 SSR序
列之间的DNA区段进行扩增。一般在引物的5′或
3′端接上 2~4个嘌呤或嘧啶碱基,以对具有相同
重复形式的许多 SSR座位进行筛选,使最终扩增
出的 ISSR片段不致太多。ISSR技术所用的 PCR
引物长度在20个核昔酸左右,因此可以采用与常
规PCR相同的反应条件,稳定性比RAPD好。
2.2.2 特异引物PCR标记
特异引物 PCR标记所用的引物是根据已知序
列的 DNA区段而设计的,具有特定核昔酸序列,
引物长度通常为 18~24核昔酸,可在常规 PCR的
复性温度下进行扩增,对基因组DNA的特定序列
区域进行多态性分析。根据引物序列的来源,主要
可分为 SSR标记、SCAR标记、STS标记及 RGA
标记等。
2.2.2.1 SSR标记
SSR的基本重复单元是由几个核苷酸组成的,
重复次数一般为 10~50。同一类微卫星 DNA可分
布在基因组的不同位置上。由于基本单元重复次数
的不同,而形成 SSR座位的多态性。每个 SSR座
位两侧一般是相对保守的单拷贝序列,因此可根据
两侧序列设计一对特异引物来扩增 SSR序列。经
聚丙烯酰胺凝胶电泳,比较扩增带的迁移距离,就
可知不同个体在某个SSR座位上的多态性。
2.2.2.2 SCAR标记
为了提高所找到的某一 RAPD标记在应用上
的稳定性,可将该 RAPD标记片段从凝胶上回收
并进行克隆和测序,根据其碱基序列设计一对特异
引物(18~24碱基)。也可只对该RAPD标记片段的
末端进行测序,根据其末端序列,在原来 RAPD
所用的10碱基引物上增加相邻的 14个左右碱基,
成为与原 RAPD片段末端互补的特异引物,以此
特异引物对基因组DNA再进行PCR扩增,便可扩
增出与克隆片段同样大小的特异带。这种经过转化
的特异 DNA分子标记称为 SCAR标记。SCAR标
记是一种显性标记,但有时也表现为长度的多态
性,为共显性的标记。
2.2.2.3 STS标记
STS标记是根据单拷贝的 DNA片段两端的序
列,设计一对特异引物,扩增基因组 DNA而产生
的一段长度为几百 bp的特异序列。STS标记采用
常规PCR所用的引物长度,因此PCR分析结果稳
定可靠。RFLP标记经两端测序,可转化为STS标
记。STS在基因组中往往只出现一次,从而能够界
定基因组的特异位点。用 STS进行物理作图,可
通过 PCR或杂交途径来完成。STS标记可作为比
较遗传图谱和物理图谱的共同位标,这在基因组作
图上具有非常重要的作用。
2.2.2.4 RGA标记
依据基因保守序列设计特异引物来扩增基因组
DNA可获得抗病基因类似物(RGA)片段。RGA既
可以作为一种基于特异引物PCR的DNA标记,其
本身又是潜在的抗病基因。许多研究结果显示,抗
病基因在染色体上有成簇排列的倾向。因此,这种
RGA扩增技术是寻找抗病基因DNA标记的一种有
效手段。
2.3 基于限制性酶切和PCR的DNA标记
以限制性酶切和 PCR技术为基础,将两种技
术有机结合的DNA标记主要有两种,一种是先将
样品DNA用限制性内切酶进行酶切,再对其酶切
片段有选择地进行扩增,然后检测其多态性,这种
标记称为 AFLP标记;另一种是先对样品 DNA进
行专化性扩增,再用限制性内切酶对扩增产物进行
酶切检测其多态性,称为CAPS标记。
2.3.1 AFLP标记
AFLP是 1993年由荷兰科学家 Zabeau和 Vos
发展起来的一种检测DNA多态性的新方法。AFLP
的原理是基于对植物基因组总DNA双酶切经PCR
扩增后的限制片段进行选择。植物基因组 DNA经
限制性内切酶双酶切后,形成分子量大小不等的随
机限制性片段,将特定双链接头(adapter)连接在这
些 DNA片段的两端,形成一个带接头的特异片
·702· 东 北 农 业 大 学 学 报 第37卷
段,作为DNA扩增的模板。接头序列以及与其相
连的限制位点作为随后进行的限制片段扩增的引物
结合位点。PCR引物 3′末端含有选择核苷酸,选
择核苷酸延伸到酶切片段区,这样就只有那些两端
序列能与选择核苷酸配对的限制性酶切片段被扩增。
扩增片段通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测[5]。
2.3.2 CAPS标记
CAPS标记是特异引物 PCR与限制性酶切相
结合而产生的一种DNA标记,实际上是一些特异
引物 PCR标记的一种延伸。其揭示的是特异 PCR
产物DNA序列内限制性酶切位点变异的信息,也
表现为限制性片段长度的多态性。包括用一个或多
个4碱基内切酶消化扩增片段,用琼脂糖或聚丙烯
酰胺凝胶电泳检测其多态性。4碱基内切酶平均可
以在每256个碱基得到一个酶切位点。选择这种酶
切 PCR产物的平均长度在 0.5~2.0kb之间,而且
切割有很高的概率。在植物中,它们可以用于水稻
基因型的分类,用于大麦遗传图的绘制,用于筛选
与生菜的抗性基因有关系的STS位点。
2.4 基于单个核苷酸多态性的DNA标记
将具有单核苷酸差异引起的遗传多态性特征的
DNA区域作为一种 DNA标记,即最近发展起来
的单核昔酸多态性(SNP)标记。SNP在大多数基因
组中存在较高的频率,在人类基因组中平均每 1.3
kb就有一个SNP存在。这种类型的DNA多态性仅有
两个等位基因的差异,所以SNP最大的杂合度为50%。
尽管单一的SNP所提供的信息量远小于现在常用的遗
传标记,但是SNP数量丰富,可以进行自动化检测,
因此,SNP具有广泛的应用前景。
3 分子标记在芸薹属植物育种中的应用
3.1 分子遗传图谱的构建
分子遗传图谱的构建是基因定位与标记辅助育
种的重要环节。目前,用于芸薹属分子遗传图谱构
建的分子标记主要包括 RFLP(限制性片段长度多
态性)、RAPD(随机扩增的多态性 DNA)和 AFLP
(扩增的片段长度多态性)等。拟南芥和芸薹属植物
基因编码序列的同源性达 80%以上,根据拟南芥
和芸薹属之间的DNA序列的高度保守性,可以相
互了解它们之间共有的遗传信息。1999法国学者
提出了能相互探知拟南芥和芸薹属之间共有遗传信
息的 ACGM(AmplifiedConsensusSequenceGenetic
Marker)标记,即扩增共有遗传标记。它是建立在
亲缘关系比较近的物种之间编码区(exon)高度保守
而非编码区(intron)存在着潜在的多态性的基础之
上的。ACGM标记根据功能基因编码区的保守性
设计引物,然后以植物总DNA为模板进行PCR扩
增,分析功能相同的基因存在与否、拷贝数的多少
及其分布,以及它们之间的序列同源性,具有简
便、迅速的特点。
芸薹属植物遗传连锁图谱的发展已经有 10多
年的历史。Slocun[6]利用芸薹属亚种间、花椰菜和
白菜杂交 F2群体构建了第一张 B.oleracea的 RFLP
连锁图谱。以后相继出现了 RAPD、STS、SCARS
和 AFLP标记图谱。至今,已构建了近 40张芸薹
属植物的遗传图谱。我国在芸薹属作图方面研究较
少,张鲁刚等[7]利用芜菁(BrassicacampestrisL.ssp.
rapiferaMetzg.)和结球白菜(B.campestrisL.ssp.
pekinensis(Lour)Olsson.)F2群体,构建了我国第
一个白菜RAPD标记分子连锁图。刘忠松等[8]利用
F2群体构建了 Brassicaoleracea的 RFLP连锁图,
利用 DH群体构建了 BrassicanigraRFLP连锁群。
这是目前我国构建的仅有的芸薹属植物遗传图谱。
韩国在大白菜遗传图谱构建上居领先地位,Kim等[9]
用 F2群体构建了含有 115个 RFLP标记,总长 1
382cM、标记间平均遗传距离为 12.0cM,包含
10个连锁群的遗传图谱。Kim等[10]利用 AFLP和
RAPD分子标记,通过DH群体建立了大白菜遗传
图谱,该图谱包括 272个标记,11个连锁群,总
长1247.1cM,标记间平均间隔为4.6cM。
3.2 种子纯度鉴定
目前种子品种纯度的鉴定显得尤为重要。鉴定
品种纯度的常规方法是根据田间表型性状进行鉴
定,既费时又费地,还影响种子销售,积压资金,
而生化和分子生物学方法有时不准确,并且成本过
高,分子标记方法既快速又简便。Mail运用RAPD
技术对甘蓝型油菜品种的纯度进行了鉴定,但是由
于 RAPD重复性差,易产生假带,制约了其在品
种纯度鉴定中的应用。有实验表明,AFLP适用于
种子真实性和品种纯度的鉴定,尤其在鉴定亲源关
系较近、遗传背景较窄的蔬菜品种上具有更大的优
势;同时还适用于亲本或自交系的纯度鉴定和植物
新品种的保护,这是AFLP标记技术申请专利保护
的原因。
张俊华等:分子标记及其在芸薹属植物育种中的应用 ·703·第5期
3.3 种质资源的遗传多样性评价
种质资源是遗传研究的原材料,用传统的田间
表型性状进行鉴定,从种质资源中发现有益基因甚
少,同工酶标记数量有限,由于有许多有价值的有
益基因和不利基因连锁,用一般种质资源的鉴定方
法很难发现,而分子标记可以用来绘制蔬菜品种、
品系的指纹图谱,用来检测品种的差异。Rabbani
[11]和我国学者张汝刚[7]采用 RAPD标记对芥菜型油
菜进行了遗传多样性分析,孟金陵[12]及Diers[13]运用
RFLP技术对甘蓝型油菜进行了遗传多样性进行分
析。分子标记不但可以辅助准确的导入野生材料的
单个优良质量性状的基因,减少连锁累赘,而且可
以发现和导入控制产量和品质等重要农艺性状的优
良数量性状基因位点(Quantitativetraitloci,QTL)。
3.4 抗病基因的分子标记
在芸薹属作物抗病基因分子标记的研究中,抗
黑胫病、抗根肿病、抗白锈病等基因的工作比较
多。对于芜菁花叶病毒(TuMV),Walsh等[14]将抗
芜菁花叶病毒的一个抗性显性基因TuRB01定位在
Brassicanapus的 A基因组上,暗示该基因很有可
能起源于 B.rapa;另一个对该病毒免疫基因
TuRB02则定位在C基因组上。中国西南农业大学
雷建军等[15]曾经利用抗病基因结构的保守性从结球
甘蓝中克隆了与TuMV抗性共分离的TuBR2基因,
并且证实甘蓝抗TuMV基因遗传为单显性基因,抗
TuMV性状符合孟德尔遗传规律。
3.5 分子标记辅助育种
DNA分子标记辅助育种技术,是通过利用与
目标性状紧密连锁的DNA分子标记对目标性状进
行间接选择的现代育种技术。作物育种学家希望培
育出性状优良的品种,而实现这一目标的关键是对
诸如高产、优质、抗病虫等目标性状的选择。长期
以来育种家们大多是借用易于鉴别的形态学和同工
酶等遗传标记来辅助育种,并在作物育种中取得了
很大成功。但是这类标记的最大不足之处在于其数
量有限,要找到与目标性状密切相关的标记往往很
困难。而且由于环境影响,应用这类标记于育种实
践,要求育种家必须有丰富的育种经验,花费较长
的时间才能选育出具有优良目标性状的品种。因此
育种家们一直希望能找到一类数量丰富、选择效应
高的标记,以提高育种效率和育种过程的预见性。
由于分子标记辅助育种技术的明显优越性,该技术
已引起了发达国家的高度重视。技术的关键是与重
要农艺性状紧密连锁的 DNA分子标记的鉴定。
Diers等[13]研究两套材料的一般配合力、特殊配合
力及基于RFLP的遗传距离同F1杂种优势的关系,
结果表明,在双列杂交材料中一般配合力和遗传距
离都与杂种种子产量呈显著相关,但包含遗传距离
和一般配合力的多元线性回归模型与杂种产量的相
关性比任意单个变量与产量的关系都显著。王晓武[16]
利用 BSA法获得了 1个与甘蓝显性雄性不育基因
连锁的 RAPD标记,在辅助 2个甘蓝自交系回交
一代及2个青花菜自交系回交一代的MS基因转移中,
预测的准确率超过90%。王俊霞等[17]已将得到的2个
RAPD标记用于选育CMS新恢复系的研究。
3.6 存在的问题
现有的从基因功能的角度研究芸薹属的分子标
记所存在的问题主要归结为两个方面:①目前芸薹
属植物基因组作图基本上依赖于拟南芥现有的基因
序列,未能充分利用芸薹属植物特有而拟南芥没有
的基因序列;②扩增共有遗传标记 (ACGM)技术
基本上依赖于拟南芥中的基因序列。在目前还无从
明确哪些基因在芸薹属植物之间及其和拟南芥之间
发生了变异,因此这一技术需要逐一比较大量的功
能基因,目前只是比较了少数几个参与初级代谢的
基因。因此,需要充分利用芸薹属自身特有的基因
资源,发展新的、有效的、特别适合于芸薹属植物
的分子标记技术。
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张俊华等:分子标记及其在芸薹属植物育种中的应用 ·705·第5期
Molecularmarkertechniquesandtheir
applicationinBrassica
ZHANGJunhua1,CUIChongshi2,PANChunqing
(1.AgricultureColege,NortheastAgriculturalUniversity,HarbinHeilongjiang150030,PRC;
2.HorticultureColege,NortheastAgriculturalUniversity,HarbinHeilongjiang150030,PRC)
Abstract:Withthedramaticdevelopmentofbiotechnique,moreandmorebiologistsandbreedersvaluethem.
Thispapersummarizedtheapplicationofmolecularmarkertechniquessuchasrestrictionfragmentlength
polymorphism(RFLP),randomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD),simplesequencerepeats(SSR)andamplified
fragmentslengthpolymorphism(AFLP0)inmarker-assistedselection.
Keywords:molecularmarker;Brassicaplant;DNApolymorphic