全 文 ：0 引言
兰属(Cymbidium)是兰科的树兰亚科的一个属，全
世界约有兰属植物55种，主要分布于亚洲热带与亚热
带地区，向南到新几内亚岛和澳大利亚。中国有49种
兰属植物和一些变种，产于秦岭以南各省[1]，中国人传
统上所说的兰花，大都是指兰科兰属中的地生兰类植
物，具有重要的药用价值和观赏价值[2-3]。
传统的兰属植物分类和品种鉴定常常以花和叶的
形态特征为依据，结果往往受到生长环境和发育阶段
的限制。由于各种变种以及自然杂交种的存在，仅凭
植株的形态特征进行兰花种质鉴定较为困难，这对兰
花品种研究产生了不利影响。DNA分子标记技术以
遗传物质为依据，从基因水平直接反映种间和种内差
异，突破以往用传统方法分类鉴定的局限性，直接在物
基金项目：2012年泰安市科技发展计划项目“名品春兰的遗传多样性研究”(20123079)；林业公益性行业科研专项“国兰新品种培育与产业化生产关
键技术研究”(201004080)。
第一作者简介：王晓英，女，1977年出生，博士，从事园林花卉科学研究工作。通信地址：271000山东泰安市罗汉崖路1号泰山林业科学研究院，Tel：
0538-6215136，E-mail：sdgtwxy@163.com。
通讯作者：王长宪，男，1959年出生，研究员，从事园林花卉科学研究工作。通信地址：271000山东泰安市罗汉崖路1号泰山林业科学研究院，Tel：
0538-6215136，E-mail：changxianwang@163.com。
收稿日期：2014-02-10，修回日期：2014-04-18。
兰属品种间遗传多样性的AFLP分析
王晓英，王长宪
（泰安市泰山林业科学研究院，山东泰安 271000）
摘 要：为从分子水平上研究兰属植物的遗传多样性和建立适合的分子标记反应体系。本研究采用
AFLP分子标记技术，对兰属植物的9个品种进行了遗传多样性分析。结果表明，筛选得到的8对引物
共扩增出965条DNA片段，其中多态性条带为931条，平均1对引物扩增条带121条（多态性带116条），
多态性位点频率为95.87%，说明遗传多样性丰富。用NTSYS2· 10进行UPGMA聚类分析，属于同种的
品种聚在一起，与表型分类基本吻合。兰属植物间遗传相似系数变化范围为0.416~0.606。此分子标记
技术体系可为兰属分类及种质遗传多样性分析提供技术依据。
关键词：兰属；品种；AFLP；遗传多样性
中图分类号：S682.31 文献标志码：A 论文编号：2014-0113
Genetic Diversity Analysis of Cybidium Cultivars by AFLP Molecular Markers
Wang Xiaoying, Wang Changxian
(Taishan Institute of Forestry Science, Tai’an 271000, Shandong, China)
Abstract: The aim was to analyze genetic diversity of Cybidium and establish suitable reaction system from
the molecular level. The genetic diversity and relationship of 9 cultivars of Cymbidium were evaluated using
AFLP molecular markers in this study. Among the 965 AFLP bands obtained from eight selective primer pairs,
931 (95.87%) were polymorphic. The average number of DNA bands per primer pair was 121，and the average
number of DNA polymorphic bands per primer pair was 116. Using NTSYS2·10 to UPGMA cluster analysis,
cultivars originated from the same species could be clustered together in the AFLP dendrogram and this
division was in consistence with the morphological classification. Genetic similarity among the cultivars ranged
from 0.416 to 0.606. The reaction system of AFLP could be used to the classifying of Cybidium and the
analysis of its germplasm genetic diversity.
Key words: Cybidium; Cultivar; AFLP; Genetic Diversity
www.caaj.org
农学学报 2014,4(10):69-72
Journal of Agriculture
种基因组DNA水平上显示遗传多样性，为分类鉴定提
供了高效准确的方法。
AFLP是新发展起来的一项检测DNA多态性技
术，它从原理上结合了RFLP和RAPD的优点，具有高
分辨率、高重复性、高灵敏度和共显性等特点，通过对
基因组DNA的限制性酶切片段进行选择性扩增而揭
示多态性[4-5]。AFLP标记技术已经在DNA指纹图谱绘
制、品种鉴定、遗传多样性分析及基因定位等方面得到
了广泛应用[6]。目前，已用于兰属植物的分子标记技
术有RAPD[7-9]、ISSR[10-12]和 SRAP[13-14]，利用AFLP分子
标记技术对兰属植物遗传多样性研究较少且技术体系
存在差异[6,15]，本实验以9个兰属品种为研究材料，利用
AFLP技术进行遗传多样性分析，拟建立适合兰属植
物的AFLP分子标记反应体系，为兰属植物遗传多样
性研究及新种的选育提供分子水平的技术依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
供试材料为兰属（莲瓣兰、建兰、春兰和春剑）的9
个品种（表 1），由泰安市泰山林业科学研究院兰花种
质资源圃提供。
1.2 操作步骤
1.2.1 基因组DNA提取 称取幼嫩叶片 50 mg，加入液
氮充分研磨成粉。将粉末放到装有 800 µL 2×CTAB
提取缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20 mmol/L
EDTA，1.4 mmol/L NaCl，2%(W/V)CTAB，40 mmol/L
巯基乙醇）的 2 mL离心管中。65℃水浴预热 30 min，
其间混匀2~3次，取出样品于室温放置，待样品冷却到
室温加入800 µL氯仿：异戊醇(24:1)振荡混匀，12000 r/min
离心15 min，取上清到1个新2 mL离心管中加入1.5倍
体积 1×CTAB沉淀液，放置 25 min，12000 r/min离心
15 min，将沉淀晾干溶于 200 µL TE-buffer (10 mmol/L
Tris-HCl 1mmol/L EDTA pH 8.0)，加入 400 µL 95%乙
醇，20 µL 3 mol/L NaAC，-20℃沉淀1 h，4℃ 12000 r/min
离心 15 min，500 µL 75%乙醇洗涤，12000 r/min离心
10 min，加入 30~50 µL TE-buffer溶DNA。0.8%琼脂
糖凝胶电泳检测。
1.2.2 限制性酶切及连接反应 0.5 mL离心管中加入
20 µL 反应体系（DNA 模板 4 µL，Adapter 1 µL，
HindIII/MseI 2 µL，10 ×NEB buffer 2.5 µL，10 mmol/L
ATP 2.5 µL，5 U/µL T4 Ligase 1 µL，H2O 7 µL），混匀离
心数秒，37℃保温5 h，8℃保温4 h，4℃过夜。
HindIII接头：5- CTC GT A GAC TGC GTA CC-
3；
MseI接头：5-GAC GAT GAG TCC TGA G-3。
1.2.3 预扩增 25 µL 反应体系（模板 DNA 2 µL，
10 mmol/L预扩引物 1 µL，10 mmol/L dNTPs 0.5 µL，
10× PCR buffer 2.5 µL，2 U/µL Taq酶 0.5 µL，ddH2O
18.5 µL）离心数秒，进行PCR扩增，94℃ 2 min，30个循
环(94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 80 s)，72℃ 5 min，将预扩
增产物-20℃保存备用。
1.2.4 选择性扩增 预扩产物稀释后作为选扩模板，按
25 µL体系（模板DNA 2 µL，10 × PCR buffer 2.5 µL，
1 mmol/L dNTP 0.5 µL，1 mmol/L HindIII引物 1 µL，
1 mmol/L MseI引物 1 µL，2 U/µL Taq酶 0.5 µL，ddH2O
17.5 µL）混匀后，离心数秒，进行 PCR循环，第 1轮扩
增(94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 80 s)后，每轮循环温度递
减0.7℃，扩增12轮。接着按(94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃
80 s)参数扩增23轮，延伸加时，72℃ 5 min。
1.2.5 凝胶分析 选择性扩增产物和上样缓冲液比例为
8:3，涡旋混匀，95℃变性，8 min后，立即冰浴，取 4 μL
上样到ABI377测序仪，进行4%聚丙烯酰胺凝胶电泳，
室温下电泳 2.4 h，自动采集原始胶图。对照(Marker)
为ROX500分子量内标。电泳结束后用Genescan3.1
从原始胶图中提取数据，然后用Binthere将片段的大
小提取出来，再用Excel将数据转换成 0和 1数据，用
Popgene和 Ntsys2· 10进行多态性和聚类分析。用
Max comp程序对聚类结果和相似系数矩阵之间的相
关性进行Mantel检验。
2 结果与分析
2.1 引物筛选和多态性分析
通过对 64对AFLP引物的筛选，筛选出了 8对多
态性较强且扩增产物清晰的引物组合（表 2）。8对引
物共扩增条带 965条，其中多态性带 931条；平均 1对
引物扩增条带121条，其中多态性带116条，多态百分
比为95.87%。8对引物组合均能揭示DNA多态性，其
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
品种名称
白玉素
地荷
荷型素
集圆
神童冠
宋梅
万字
小天龙
绿梅
种类
莲瓣兰（素心）
建兰（色花）
春剑（素心）
春兰（梅瓣）
建兰（叶艺）
春兰（梅瓣）
春兰（梅瓣）
建兰（水仙梅）
建兰（梅瓣）
表1 兰属植物的9个品种名称
王晓英等：兰属品种间遗传多样性的AFLP分析··70
中引物HindIIIAAC/MseI CTC扩增出多态性条带最少
为 100条，多态性比例为 98.04%，HindIIIAGC/MseI
CTC扩增的多态性带最多为 132条，多态性比例为
97.06%，表明兰属植物具有丰富的遗传多态性。
2.2 凝胶分析
AFLP扩增产物长度介于 70~500 bp之间，其中引
物HindIIIAGC/MseI CTT的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
见图1，结果条带清晰，该引物共扩增出132条带，其中
多态性带 125条，占 94.7%，说明上述体系可用于兰属
植物的AFLP分析。
2.3 聚类分析
基于 AFLP的扩增结果，用 NTSYS2 · 10进行
UPGMA聚类分析，得到兰属植物品种亲缘关系树状
图（图 2）。将聚类结果进行Mantel检验，相关系数为
0.8219，达到极显著水平，表明聚类结果很好地体现了
兰属植物品种间的亲缘关系。由AFLP技术得到的聚
类图将9个品种共分为4个部分，属于同种的品种聚在
一起，与表型分类基本吻合，如春兰品种集圆、万字和
宋梅聚在一起，建兰品种地荷、神童冠、小天龙和绿梅
也聚在一起。聚类结果表明AFLP技术可将种内的品
种完全区分开。总之此技术体系可以很好地揭示供试
兰属植物种间和种内的遗传差异和亲缘关系。
9个品种间遗传相似系数变化范围为 0.416~
表2 8对AFLP引物标记条带数统计
引物对
HindIIIAAC/MseI CTC
HindIIIAAG/MseI CTC
HindIIIAAG/MseI CTT
HindIIIACA/MseI CTC
HindIIIACA/MseI CTT
HindIIIACT/MseI CTT
HindIIIAGC/MseI CTC
HindIIIAGC/MseI CTT
总和
平均
条带总数
102
117
128
116
108
126
136
132
965
121
多态条带
100
113
122
111
107
121
132
125
931
116
多态百分比/%
98.04
96.58
95.31
95.69
99.07
96.03
97.06
94.7
95.87
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M
500 bp
490 bp
475 bp
450 bp
425 bp
400 bp
380 bp
360 bp
340 bp
320 bp
300 bp
280 bp
260 bp
240 bp
220 bp
200 bp
190 bp
180 bp
160 bp
140 bp
120 bp
100 bp
90 bp
70 bp
M：Marker；1~9：样品编号，具体名称见表1
图1 引物对HindIIIAGC/MseI CTT扩增结果
Coefficient
0.45 0.49 0.53 0.57 0.61
白玉素
集圆
莲瓣兰
万字
宋梅
春兰
地荷
神童冠
小天龙
绿梅
荷型素 春剑
建兰
图2 AFLP标记的UPGMA聚类图
··71
0.606。‘小天龙’和‘绿梅’间相似系数最高，为 0.606，
说明具较高的同源性。‘荷型素’与其他供试品种的遗
传相似系数都较小，与‘万字’的相似系数最小，为
0.416，说明‘荷型素’与‘万字’间的遗传距离较远。
3 结论与讨论
本研究采用HindIII/MseI体系对兰属植物进行基
因组DNA的酶切和接头连接，并筛选出了8对多态性
较强且扩增产物清晰的引物组合（表1），共扩增出965
条DNA片段，其中多态性条带为931条，平均1对引物
扩增条带 121条，多态性带 116条，多态性位点频率为
95.87%。兰属植物AFLP-PCR适宜的扩增体系为：预
扩增25 µL反应体系（模板DNA 2 µL，10 mmol/L预扩
引物 1 µL，10 mmol/L dNTPs 0.5 µL，10×PCR buffer
2.5 µL，2 U/µL Taq酶 0.5 µL，ddH2O，18.5 µL）；选择性
扩增 25 µL反应体系（模板DNA 2 µL，10×PCR buffer
2.5 µL，1 mmol/L dNTP 0.5 µL，1 mmol/L HindIII引物
1 µL，1 mmol/L MseI引物 1 µL，2 U/µL Taq酶 0.5 µL，
ddH2O 17.5 µL）。
前人利用AFLP技术对兰属植物进行遗传多样性
研究的酶切体系均采用EcoRI/MseI[6,16-17]和PstI/MseI[15]，
而本实验条件下，HindIII/MseI体系能够得到清晰、稳
定和多态性丰富的指纹图谱，DNA分子水平上的多态
性可对兰属植物进行遗传多样性分析，通过聚类分析
可区分兰属植物，完善和补充了兰属植物分子标记反
应体系，是一种适于兰属亲缘关系及遗传多样性分析
的方法。
谢伟等[7]和梁红健等[18]认为莲瓣兰与春兰、建兰是
平行关系，而本实验结果表明莲瓣兰品种与春兰品种
的亲缘关系较近，这与陈心启等[2]和孙彩云等[19]的研究
结果基本相符；本实验结果表明春剑品种和春兰品种
亲缘关系较远，与吴应祥[20]观点一致，而陈心启等[2]认
为春剑是春兰的一个变种。总之，兰属种间和种内分
类存在分歧，有待进一步深入研究，对兰属种质资源保
护与新品种开发都有重要意义。
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