全 文 ：应用与环境生物学报　1999 ,5(3):279～ 282 　 　
Chin.J.Appl.Environ.Biol. 　 1999-06-25
　
收稿日期:1998-07-08　　接受日期:1998-12-24
＊广东省高教厅自然科学重点科研项目　　＊＊通讯联系人 Corresponding author
胶束毛细管电动色谱法研究
兰属品种间的亲缘关系＊
文　李　叶庆生＊＊　潘瑞炽
(华南师范大学生物系　广州　510631)
摘　要　用胶束毛细管电动色谱技术对兰属植物的种质资源多样性及品种间的亲缘关系进行研究.13个兰属
品种的 CE-SDS 电泳图谱中 ,共出现 34个蛋白质标记峰 ,全部为多态性峰 ,每个样品均有 1～ 2个主峰.邻体聚
类结果与形态学分类结果不完全一致.种间的亲缘关系与传统的形态学分类法一致 ,但建兰种内各品种的聚类
不明显.
关键词　兰属;MECC;聚类分析
中图法分类号　Q949.718.430.9 ∶O657.8
STUDY ON THE RELATIONSHIPS AMONG CYMBIDIUM
CULTIVARS USING MECC
WEN Li , YE Qingsheng &PAN Ruichi
(Dept of Biology , South China Normal University , Guangzhou　510631)
Abstract 　Micellar electrokinetic capillary chromatography(MECC) was used to study Cymbidium
germplasm.34 markers of peaks appeared in 13 Cymbidium cultivars and all of them were polymorphic.There
were 1～ 2 main peaks in each cultivar.The results from neighbor-joining cluster analysis were not completely
consistent with those of morphological classification.The relationships among species were consistent with tradi-
tional taxonomic analysis , but the cultivars in C.ensifolium did not cluster clearly.
Keywords　Cymbidium;MECC;cluster analysis
长期以来 ,用于种质资源研究的主要手段还是形态学分类方法 ,六 、七十年代以来的同工酶技术和近来一
些分子生物学标记技术如 RAPD和 AFLP等也曾广泛地应用于这方面的研究 ,但毛细管电泳仪在这方面的应
用甚少.
与普通的电泳相比 ,毛细管电泳(Capillary Electrophoresis , CE)具有高效 、快速 、操作简单和所需样品少等优
点.胶束电动力学色谱(MECC)是 CE 技术的一个重要的领域.在MECC 系统中 , 实际上存在类似于色谱的两
相:一是流动相(即待测样品);另一是起到固定作用的胶束相(分子筛),中性离子根据本身疏水性的不同而达
到分离 ,这种方法与被分离物质的电荷大小无关.在 CE-SDS 蛋白质电泳中 , 电泳缓冲液中含有起分子筛作
用的亲水性多聚体(Polymer)使得 SDS-蛋白质复合体按照它们分子量大小而迁移 , 即低分子量的蛋白质比高
分子量的蛋白质迁移得快 ,从而达到分离的目的.
中国兰花一直深受人们的喜爱 ,具有很高的观赏和经济价值 ,由于在自然界杂交的结果 , 兰属植物变异很
大 ,中间类型很多 , 种的界限不清楚 ,给花卉品种的整理和研究带来困难[ 1] .本文用胶束毛细管电动色谱法分
析了兰属植物部分品种间 SDS-蛋白质的差异 ,进行兰属植物种质资源的研究 ,探讨兰属植物部分品种间的
亲缘关系.
1　材料和方法
1.1　实验材料
实验材料兰属(Cymbidium)植物 5 个种 2 个变种
中的 13个品种(见表 1).
1.2　仪器和试剂
使用 BioFoeus 3000高效毛细管电泳仪(Bio-Rad ,
美国);电泳使用 CE-SDS Protein Kit(Bio-Rad , 148-
4160)提供的试剂.
1.3　实验方法
用含有终浓度为 1%的 SDS 和 10 mmol/L 的 β -
巯基乙醇无离子水提取兰属植物叶片中的水溶性蛋
白 ,每 0.5 g叶片中加入 2.5 mL提取液 , 研磨 , 12 000
xg 离心 15 min , 取上清液.200 μL 样品中加入 10 μL
内标(苯甲酸), 样品经沸水浴处理 10 min , 取出冷却
后 , 用台式离心机 15 000 r/min 离心 2 min , 样品分析
表 1　用于本实验分析的兰花品种
Table 1　Cymbidium cultivars used in this study
种　名
Species
品种 名
Cultivars
编号
No.
建兰
C.ensifolium
四季兰　　Siji lan
大凤素　　Dafengsu
铁杆素　　Tiegansu
1
2
3
独占春
C.eburneum
象牙 白 花 兰 　 Xiangyabai
Hualan
4
春剑
C.longibracteatum 通海剑兰　Tanhai Jianlan 5兔耳兰
C.lancifolium 兔耳兰　　Tuerlan 6
寒兰
C.kanran 野生寒兰　Yesheng Hanlan 7春兰
C.georingii 莲瓣春兰　Lianban Chunlan 8
墨兰
C.sinense
海南墨兰　Hainan Molan
白 墨　　Baimo
徽州墨　Huizhou Mo
企 黑　　Qihei
金 嘴　　Jinzui
9
10
11
12
13
前保持在室温.每批样品重复 3 次 ,为使批内每个样品的电泳参数尽量一致 ,每次开机先电泳 10个样品 , 在仪
器状态稳定后再进行实验结果的记录.实验样品均每天新鲜制备 ,毛细管电泳的具体方法见图 1.
记录每个品种每种蛋白质的出峰时间 , 根据不同蛋白质的出峰时间 ,对每个峰进行统计 , 有峰出现计为
1 ,无峰出现计为 0 , 计算出 CE-SDS 蛋白质的相似系数-Ss(Similarity coefficient), Ss 为两个品种同时为 1 或 0
的峰数之和与总峰的比值.根据相似系数矩阵 ,按邻体聚类法进行系统树状图的构建和聚类分析.
2　实验结果
根据各个品种的电泳图谱(图
1),记录下苯甲酸峰后的每个蛋白
质峰的迁移时间 , 并根据苯甲酸峰
进行校正 , 可以看到每个品种都有
1 ～ 2 个主峰 , 且种间的差异较大 ,
种内的差异较小 , 13 个所分析品种
共出现 34个蛋白质标记峰 ,全部为
多态性峰.
表 2为蛋白质出峰记录的相似
系数矩阵.根据相似系数矩阵构建
的聚类分析图如图 2.
表 2　CE-SDS 蛋白质峰相似系数矩阵
Table 2　Matrix of similarity coefficient of CE-SDS protein peaks
样 品
Samples
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
2 .853
3 .853 .941
4 .471 .559 .500
5 .559 .676 .559 .706
6 .559 .559 .618 .500 .647
7 .824 .824 .824 .618 .794 .588
8 .676 .676 .676 .412 .588 .441 .647
9 .647 .794 .735 .588 .706 .559 .824 .588
10 .676 .765 .706 .676 .794 .559 .794 .618 .912
11 .765 .735 .735 .588 .824 .588 .735 .647 .794 .794
12 .765 .735 .735 .588 .824 .588 .735 .647 .794 .794 1.00
13 .706 .794 .735 .500 .735 .618 .706 .588 .735 .735 .882 .882
3　讨 论
聚类分析结果见图 2.在相似系数 0.852 和 0.790处分别作结合线 L1 和 L2.在结合线 L1处将各品种划分
为 a～ h 8个组 , a组为建兰的 3 个品种 , b 组为寒兰的 1 个品种 , c组为墨兰的 2 个品种 , d 组为墨兰的 3个品
种 , e组为春剑的 1 个品种 , f为独占春的 1 个品种 , g为春兰的 1 个品种 , h 为兔耳兰的 1 个品种 , 除墨兰的 5
个品种被划为 c和 d 两个组之外 ,其它的每个组都代表一个种 , 这与传统分类的划分一致.1993 年 , 我国的吴
应祥结合Schlechter和Hunt的见解及其多年的工作基础[ 2] ,将春兰划在兰组(Sect.Uniflorum);将独占春等划在
蕙组(Sect.Floribundum)的大花亚组(Subsect.Grandiflorum), 春剑 、建兰 、寒兰和墨兰等划在蕙组的小花亚组
(Subsect.Microcymbidium);兔耳兰划在宽叶组(Sect.Geocymbidium)[ 3] .在结合线 L2 处 , a , b , c , d和 e 五个组聚
为A组 , 表明建兰 、墨兰 、春剑和寒兰的亲缘关系很近 , 这与形态学分类结果一致 ,此组的 4 种兰花全部划在形
280　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　应 用与 环境 生物 学 报　　　　　　　　　　　　　　　　　5卷
态学分类中蕙组的小花亚组;B 组为独占春;C 组为春兰 , D组为兔耳兰 , 说明建兰 、墨兰 、春剑和寒兰 、独占春 、
春兰及兔耳兰这 4组是平行的关系 , 这与传统的分类结果一致.从系统聚类图可以看到 , B 组 、C 组与 A组在
相似系数0.676 处聚合 ,说明这 2个种与 A组的距离较
远.D组为兔耳兰与 A组的亲缘关系最远 , 在相似系数
0.647处才与 A 组聚合.从图 2 还可以看出 , 墨兰的 5
个品种的聚类不明显 , 亲缘关系的划分不清晰 , 金嘴 、
徽州墨和企黑与春剑和寒兰的关系更近 , 而与海南墨
兰和白墨的关系相对较远.
总的说来 , 本文用 CE-SDS 技术对兰属植物种间
亲缘关系的调查结果与传统的分类结果基本一致.实
验结果表明 ,建兰 、墨兰 、寒兰和春剑这 4 个种的亲缘
关系十分接近 ,春兰和独占春与前几个种的亲缘关系
相对较远 ,兔耳兰与它们的亲缘关系最远.与传统分类
结果不同的是:墨兰种内的亲缘关系聚类不太明显.
图 2　兰属CE-SDS蛋白质聚类分析图.横坐标为相似系数
Fig.2　Dendrogram of Cymbidium cultivars based on similarity co-
effi cient.Axis on the bottom of the dendrogram indicating
simi larity coefficient
　　由于 CE具有高效 、快速 、准确和灵敏度高等优点 , 在分离和定性分析等方面的应用较多 , 曾广泛地应用
于离子 、糖类 、蛋白质和 DNA 等物质以及单细胞分离分析等[ 4～ 7];在医学方面也有较多的应用[ 8～ 9] ;利用 CE
技术对蛋白质的分析的报道也不少[ 10 ～ 13] ,但利用品种间的蛋白质差异来进行种质资源和品种间亲缘关系方
2813期 文　李等:胶束毛细管电动色谱法研究兰属品种间的亲缘关系 　　
面的研究还很少见报道.
　　从图 1 A-M可以看到 , 不同品种间的 CE-SDS 电泳图谱总有或多或少的差异 , 而种内的差异要比种间
的差异小.本文研究结果说明 , CE在种质资源研究方面是一个值得注意的方法.
参考文献
1　Liang HJ(梁红健), Liu M(刘敏), Zhong ZY(钟志宇), Wu YX(吴应祥), Li WB(李文彬).Ident if ication and classification of
Chinese Cymbidum wi th RAPD.Acta Horticul Sin(园艺学报).1996 , 23(4):365～ 370
2　Wu YS(吴应祥), Chen SC(陈心启).A taxonomic review of the orchid genus Cymbidium in China.Acta Phytotaxon Sin(植物分类
学报).1980 , 18(3):292～ 307
3　吴应祥.中国兰花.第 2版 ,北京:中国林业出版社 ,1993.26～ 64
4　Luo GA(罗国安), Wang YM(王义明), Wang RJ(王如骥), Wang QG(王清刚).Lecture of principles and applicatiohns of capi llary
elect rophoresis(Ⅵ)Application of CE in DNA analysis , carbohydrate analysis and capillary ion analysis.Chin J Chromatog(色谱).
1998, 16(1):38～ 43
5　Kennedy RT , Oates MD , Cooper BR , Nickerson B , Jorgenson JW.Microcolumn separations and the analysis of single cell.Science.
1989, 246:57～ 63
6　Woolley AT , MathiesR A.Ultra-high speed DNA fragment separations using microfabricated capillary array elect rophoresis chips.Pro
Natl Acad Sci USA.1994 , 91:1348～ 1352
7　Shear J , Fishmen HA , Albritton NL , Garigan D , Zare RN , Scheller RH.Single cell as biosensors for chemical separation.Science.
1995, 267:74～ 77
8　Yang YY(杨迎迎), Sun FS(孙发山), Wang L(王磊), Zhang YK(张玉奎).Determination of inosine in oral tonic by high perfor-
mance capillary electrophoresis.Chin J Chromatog(色谱).1997, 15(1):60～ 61
9　Wang YM(王义明), Luo GA(罗国安), Wei W(魏伟), Guan YH(关燕华).Lecture of principles and applications of capi llary elec-
trophoresis(Ⅴ)Application of capillary electrophoresi s in pharmceutical analysis and clinical chemist ry.Chin J Chromatog(色谱).
1997, 15(6):494～ 498
10　Fang XH(方晓红), Zhu T(朱涛), Sun YL(孙亦梁).Application of capillary zone electrophoresis to the separation of proteins and
peptides.Chin J Chromatog(色谱).1993 ,11(4):210～ 213
11　Liu XD(刘晓达), Liao J(廖杰), Yang JG(杨景庚), Wang QL(王全立), Liu YQ(刘耀清), Ma LR(马立人).Capi llary i so-
electric focusing of protein.Chin J Chromatog(色谱).1997 , 15(1):8～ 11
12　Wehr T , Rodriguez-Diaz R, Lin CM.Capillary electrophoresis of proteins.Adv Chromatog.1997 ,37:238～ 361
13　Yang Q , Hjdajat K , Li Sam FX.Trends in capillary electrophoresis.J Chromatog Sci.1997 , 35(8):358～ 373
邱 扬 、张素琴等获我刊优秀论文奖
根据我部决定(见本刊99年第 2期第159页)和有关专家推选评定 ,邱扬 、张金屯
的论文《关帝山八水沟天然植物群落时空梯度的数量分析》[ 1999 ,5(2):113 ～ 120]和
张清文 、张素琴 、刘海洲等的论文《多糖产生菌 T 与 β-胡萝卜素产生菌 C1-B的融合研
究》[ 1999 , 5(2):195 ～ 198]获本刊 1999年第 2期优秀论文奖.本刊将授予两篇论文奖
金各 500元人民币 ,授予两篇论文的每位作者获奖证书.
本刊编辑部
282　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　应 用与 环境 生物 学 报　　　　　　　　　　　　　　　　　5卷