全 文 ：书收稿日期:2013 － 07 － 16
基金项目:四川省教育厅资助项目(10ZA018) ;四川省科学技术带头人培养项目(11sd3105) ;西南科技大学科研基金资助成果(09zx7107、
12xjjx90)。
作者简介:李杰(1974 －) ，男，副教授，博士。研究方向:观赏园艺。Email:jay0224@ sina． com。
野生兰属植物菌根真菌的分离和表型鉴定
李 杰，王芝娜，匡 萍，张银洁
(西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010)
摘要:为鉴定野生兰属植物内生菌根真菌种类，以 6 种代表性兰属植物春剑、春兰、蕙兰、送春、建兰、莲瓣兰为材料，采用常
规分离方法，从其内生菌根中分离得到 30 个菌株。通过菌落特征和光学显微特征观察，将 30 种内生菌根真菌初步鉴定为
镰刀菌属、毛壳菌属、柱孢霉属和瘤菌根菌属 4 个种类。
关键词:兰属植物;菌根真菌;鉴定
中图分类号:S682．31 文献标识码:A 文章编号:1673-0925(2013)04-0254-04
Isolation and phenotype identification of mycorrhizal fungi
associated with wild Cymbidium plants
LI Jie，WANG Zhi-na，KUANG Ping，ZHANG Yin-jie
(College of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang，Sichuan 621010，China)
Abstract:The research was conducted to identify 30 mycorrhizal fungi associated with wild Cymbidium plants using the roots of 6 C．
plants，such as C． tortisepalum var． longibracteatum，C． goeringii，C． faberi，C． cyperifolim，C． ensifolium and C． tortisepalum from
Southwest China． The traditional method of isolating fungi from plants was used and morphological identification showed that 30 en-
dophytic fungi belonged to the genus Fusarium，Chaetomium，Cylindrocarpon，Epulorhiza．
Key words:Cymbidiumi;mycorrhizal fungi;identification
兰属植物(Cymbidium)是典型的菌根植物［1］，在其肉质根中分布有对其生长发育起促进作用的菌丝。
兰属植物从种子的萌发，甚至到可以进行光合作用的幼苗和成年植株，多寄生于 V． A 菌根(vesicular-ax-
buscular mycorrhizas)获得营养［2 － 3］。由于长期以来的人为破坏和自身的生物学“瓶颈”，野生兰属植物濒
危形势十分严峻，对其加强保护使其可持续利用迫在眉睫。菌根技术是解决兰属植物自身繁殖和发育生
物学“瓶颈”问题并实现兰科植物再引入技术的重要突破点［4］。因而从兰属植物肉质根中分离、鉴定其内
生真菌是研究兰属植物与其内生真菌共生关系的前提，是了解兰属植物菌根特点的基础。分离得到兰属
植物共生有益菌对实现中国兰属植物持续开发和濒危兰属植物保护具有重要意义。本文结合菌落特征和
光学显微特征对产于我国西南地区的几种地生兰属植物内生真菌进行了初步鉴定，以期为深入探讨兰属
植物与其内生真菌共生关系和协同进化提供依据。
1 材料与方法
1．1 试验材料
试验材料为采自云南的 6 种野生兰属植物:春剑(Cymbidium tortisepalum var． longibracteatum)、送春
(C． cyperifolim)、春兰(C． goeringii)、莲瓣兰(C． tortisepalum)、蕙兰(C． faberi)、建兰(C． ensifolium)。
1．2 试验方法
1．2．1 菌株分离和纯化 剪取健康完整根段，流水冲洗干净后，于 75%酒精浸泡 5 min，0．1%升汞消毒 4
亚热带农业研究
Subtropical Agriculture Ｒesearch
第 9 卷 第 4 期
2013 年 11 月
DOI:10.13321/j.cnki.subtrop.agric.res.2013.04.016
min，无菌水冲洗 3 次。在超净工作台上将根段切成 2 mm 左右，置于马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose
agar，PDA)培养基，25 ℃恒温培养。待接种根段内长出菌丝后切取菌丝边缘至新的 PDA培养基，系列转
移至纯培养后，接种于 PDA斜面培养基上，4 ℃保存，备用。
1．2．2 真菌菌株的培养和观察 将纯化保存的菌株接种于 PDA培养平板上，25 ℃恒温培养，观察菌落特
征，并挑出菌丝，置于光学显微镜下观察细胞个体特征。
2 结果与分析
2．1 内生真菌的分离
经过严格的表面消毒和系列转移培养，确保没有杂菌污染至纯培养，共从 6 种野生兰属植物的菌根中
分离出 30 株内生真菌(表 1)。从分离结果看，从春兰中分离的菌株数最多，达 10 种，而从送春和建兰中
仅分离得到 1 种菌株。从同一采集地区的不同种类兰属植物中分离的菌株数也不相同。
表 1 兰属植物内生真菌分离统计
Table 1 Statistics of mycorrhizal fungi isolated from Cymbidium
种类 采集地 生境特点 分离菌株
春剑 云南保山 松科与壳斗科针阔混交林 L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7
春兰 云南富民 壳斗科常绿落叶阔叶混交林 G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10
蕙兰 云南昆明 壳斗科与松科针阔混交林 F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7
送春 云南保山 松树林 C1
莲瓣兰 云南丽江 壳斗科常绿落叶阔叶混交林 T1、T2、T3、T4
建兰 云南逍海 松科与壳斗科针阔混交林 E1
2．2 内生真菌的形态学特征
根据菌落及菌丝体光学显微特征，所分离的 30 个菌株共分为 4 类，其典型特征种类见图 1 － 4。
2．2．1 种类Ⅰ 在 PDA培养基上生长迅速，匍匐生长产生大量白色、乳白色菌丝，絮状，随着生长有黄、
绿、紫、粉色色素;部分菌株具有同心圆，菌丝有隔、有分枝、无锁状联合，直径 2 － 5 μm;分生孢子梗散生，
瓶梗状。大型分子分生孢子镰刀形、弯月形，(11．25 － 23．75)μm ×(4 － 5)μm，具 1 － 3 个隔，小型分子孢
子椭圆形，无隔，(6．00 － 11．25)μm ×(2．50 － 4．50)μm(图 1)。
标本研究:分离自春兰的 G1、G2、G3、G6、G9、G10，分离自蕙兰的 F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7，分离自建
兰的 E1，分离自送春的 C1。
A．菌落形态;B．分生孢子(× 400)。
图 1 内生真菌 G6 菌落和光学显微特征
Fig． 1 Colony and mycelial optics characteristics of endophytic fungi G6
2．2．2 种类Ⅱ 菌落边缘不规则，气生菌丝黄色或浅黄色，菌丝透明分枝、有隔，后期培养基表面有大量
的球形子囊壳，墨绿色，四周有毛，子囊棒状，子囊孢子单细胞，椭圆形，两端尖(图 2)。
标本研究:分离自莲瓣兰的 T1、T2、T3。
2．2．3 种类Ⅲ 菌落菌丝短绒状，匍匐生长，菌丝白色、黄白色至黄褐色，后期分泌色素致培养基背面呈
·552·第 4 期 李杰等:野生兰属植物菌根真菌的分离和表型鉴定
红褐色至紫黑色，分生孢子无色，椭圆形，(15 － 17)μm ×(4 － 5)μm;菌落菌丝绒毛状，黄白色或黄褐色，
分生孢子瓶梗状，菌丝直径 4 － 6 μm;菌落菌丝部分成束，无色或淡黄褐色，分生孢子无色，圆筒形，(16．0
－ 36．5)μm ×(3．5 － 5．0)μm(图 3)。
标本研究:分离自春兰的 G4、G5、G7、G8 及分离自莲瓣兰的 T4。
A．菌落特征;B．子囊壳(× 400) ;C．分生孢子(× 400)。
图 2 内生真菌 T2 菌落和光学显微特征
Fig． 2 Colony and optical microscopy characteristics of endophytic fungi T2
A．菌落特征;B．菌丝(× 400) ;C．分生孢子(× 400)。
图 3 内生真菌 G5 菌落和光学显微特征
Fig． 3 Colony and mycelial optics characteristics of endophytic fungi G5
2．2．4 种类Ⅳ 菌落根状，扁平，生长缓慢;气生菌丝近伏于培养基表面，量少，较短绒毛状;菌丝白色透
明，分枝几乎直角，分枝处略缢缩且不远处有隔;无锁状联合，无分生孢子，部分细胞膨大成念珠状，球形或
不规则(图 4)。
标本研究:分离自春剑的 L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7 菌株。
A．菌落特征;B．菌丝(× 400) ;C．念珠细胞(× 400)。
图 4 内生真菌 L7 菌落和光学显微特征
Fig． 4 Colony and mycelial optics characteristics of endophytic fungi L7
2．3 内生真菌的形态鉴定
菌株 G1、G2、G3、G6、G9、G10、F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、E1、C1 的光学特征为分生孢子镰刀状，弯月
形，有 1 － 3 隔，部分能分泌绿、黄、红等色素，分生孢子梗散生，瓶梗状等特征符合镰刀菌属;菌株 T1、T2、
·652· 亚 热 带 农 业 研 究 第 9 卷
T3 的菌丝黄色或浅黄色，培养基表面有毛，后期有大量子囊壳，分生孢子等特征与伍建榕等［5］和郭云忠
等［6］对毛壳菌属特征的描述相吻合;菌株 G4、G5、G7、G8、T4 菌落菌丝白色、黄褐色，短绒毛，后期分泌色
素致培养基背面呈红褐色至紫黑色，显微镜下菌丝无色或淡黄色。分生孢子无色，具隔膜等特征与范
黎［7］描述的柱孢霉属(Cylindrocarpon)相符;菌株 L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7 菌丝无锁状联合，分枝起源处缢
缩，分枝呈直角或锐角且不远处有隔，无任何孢子等特征与文献［8 － 9］的瘤菌根菌属(Epulorhiza)相符。
3 小结与讨论
通过形态学鉴定，分离自 6 种不同野生兰属植物的 30 种内生真菌都是常见的兰科植物菌根真菌，分
别隶属于镰刀菌属、毛壳菌属、柱孢霉属以及瘤菌根菌属。同时与从 30 种内生真菌中分离的 rDNA ITS 序
列进行 Blast比对［10］，形态鉴定与分子鉴定高度一致，并和 Aline et al［11］和胡陶等［12］分离的菌根真菌特征
吻合且高度同源，但这些真菌是否为兰属共生益兰菌则需进一步进行共生萌发试验。
武静宇［13］从浙江天目山春兰分离得到了瘤菌根菌属菌根真菌，李潞滨等［14］从四川、湖北和河南春兰
中分离得到了胶膜菌属(Tulasnella)、瘤菌根菌属，伍建榕等［15］从野生春兰分离得到了兰科丝核菌属(Ｒhi-
zoctonia)。本文从来自不同采样地域的 6 种兰花中分离出了不同种类的菌根真菌，隶属于镰刀菌属、毛壳
菌属、柱孢霉属和瘤菌根菌属。这些菌株有的分离自不同产地的同种兰花，如从不同地区的春兰中分别分
离得到 10 个菌株，经鉴定分属于镰刀菌属和柱孢霉属。有的菌株分离自相同产地的不同兰花，如在同一
生境条件下的春兰、蕙兰、送春和建兰中，都分离得到了同属于镰刀菌属的内生真菌。因此，笔者认为兰科
植物生存的环境对共生真菌种类和真菌分布范围存在影响。不同类的菌根真菌能与同种兰科植物建立共
生关系，并对兰花生长发育产生积极的促进作用，很可能是这些菌根真菌与共生的兰科植物之间存在某种
程度的营养专一性，能提供兰科植物生长所需要的营养物质，但有关物质流的交换需要进一步深入研究。
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·752·第 4 期 李杰等:野生兰属植物菌根真菌的分离和表型鉴定