全 文 ：园　艺　学　报　2005, 32 (6):1121 ～ 1124
Ac taH or ticu ltu rae S inica
收稿日期:2004 - 12 - 22;修回日期:2005 - 05 -11
基金项目:广东省科技攻关项目 (2002A204, 2003A2010401)
*通讯作者 Au thor for correspondence
中国兰属植物种间及品种间亲缘关系的 RAPD分析
孙彩云　张明永　叶秀 *　梁承邺　夏快飞
(中国科学院华南植物园 , 广州 510650)
摘　要:利用 RAPD分子标记分析中国兰属 (Cymbid ium) 的 28个原生种和部分种的不同品种及 3个
杂交种共 50个材料间的亲缘关系。获得 250条可明显区分的 DNA扩增片段 , 除 S143-850 bp 1条带为全部
材料共有外 , 其余带均为多态性位点。这些带最大的为 2 100 bp, 最小的为 200 bp, 以集中在 1 031 ～ 300
bp的带居多 。 UPGMA进行聚类分析显示:RAPD的聚类树状图所呈现出的亲缘关系大体与 ITS系统发育树
一致。建兰亚属可能为一自然类群。大花亚属并非自然类群 , 其成员之一文山红柱兰 (C. Wenshanense Y.
S. Wu e.t ) 偏离出去而与兰亚属聚在一起。兰亚属则为一高度异质性的类群 , 分散成互不关联的 3支。本
结果和 ITS系统发育分析表明 , 有必要对经典分类的兰属属下分类 , 特别是兰亚属进行修订。对 3个亚属
中各组的划分基本与传统分类的一致。春兰品种间的多样性高于其它测试品种。
关键词:兰属;兰科;RAPD
中图分类号:S 682.31;Q 941 +. 2　　文献标识码:A　　文章编号:0513-353X (2005) 06-1121-04
Stud ies on Relationsh ip between Species, Cultivars ofCymbidium UsingRAPD
Sun C aiyun, ZhangM ingyong, Ye X iu lin* , Liang Chengye, and X ia Kuaifei
(South China Institute of Botany, Chinese Academ y of Sciences, Guangzhou 510650, Ch ina)
Abstract:Cymbidium is a genus w ith very impo rtan t values o f ho rticu lture. In the present study genetic
closeness o f va rious species of Cymbidium was de te rm ined using RAPD. A tota l of 250 amplified bands w as
go tten from a ll PCR reactions by 12 selected primers, and their band size w as from 200 bp to 2 100 bp. Ex-
cept of the 850 bp band amp lified from S143 p rime r, a ll othe r amp lified bandsw ere dive rsity locus, andmost
of the bandsw e re located be tw een 1 030 bp and 300 bp. The UPGMA dendrog ram show ed some congruence
w ith the prev ious ITS phy logeny, which revealed the paraphy ly of subgen. Cyperorch is, and high po lyphy ly o f
subgen. Cymbidium. The subg roups w ithin each subgenus revea led by the RAPD were, how eve r, correspond
to the traditional taxonomy based on gross mo rpho logy. This study a lso show s h ighe r gene tic diversity o fC.
goeringii, being cultived fo r long history, than othe rCymbid ium species.
Key words:Cymbid ium;O rch idaceae;RAPD
1　目的 、 材料与方法
日本学者曾应用 RA PD技术对兰属 (Cymbid ium ) 36个栽培品种的遗传多样性进行研究 〔1〕。
国内梁红健等 〔2〕用 RAPD对中国兰属 5个种 19个品种的亲缘关系进行探讨 。张明永等 〔3〕用 PCR
扩增和直接测序的方法分析兰属的 27个种 、 3个栽培种和 3个外来类群间的核 DNA ITS序列 。
研究结果表明大花亚属和兰亚属都表现为一复系群 , 建兰亚属为一并系群 , 各亚属内组间的关
系不明确 。
本研究利用 RAPD技术研究兰属的 50个材料 , 包括 28个原生种 , 3个变种 , 16个品种 , 3个杂
交种的遗传多样性和亲缘关系 。材料详见表 1。
DOI牶牨牥牣牨牰牬牪牥牤j牣issn牣牥牭牨牫牠牫牭牫x牣牪牥牥牭牣牥牰牣牥牫牱
园　　艺　　学　　报 32卷
表 1　试验所用种或品种
Tab le 1　The species, cultivars o fCymb id ium for RAPD
编号
C ode
种或品种
Species or cu ltivars
来源
Sou rce
编号
C ode
种或品种
Species or cu lt ivars
来源
S ou rce
1 纹瓣兰 C. a loifo lium(L. ) Sw 云南 26 墨兰 C. sinense(Jack son ex And r. )W illd. 广东
2 西山纹瓣兰 C. a loifo lium(L. ) Sw ‘x ishanw enban lan’云南 27 白墨 C. sinense(Jack son ex And r. )W illd. ‘baim o’ 广东
3 下关纹瓣兰 C. a loifo lium(L. ) Sw‘xiaguan w enban lan’ 云南 28 线艺墨兰 C. sinense(Jackson ex Andr. )W illd. ‘x ianyimolan’ 云南
4 硬叶兰 C. bicolor lind.l Subsp. obtusum Du Puyet C ribb 云南 29 海南墨兰 C. sinense(Jackson exA ndr. )W illd. ‘ ha inan mo lan’ 海南
5 冬凤兰 C. dayanum Rchb. .f 云南 30 黑墨 C. sinense(Jackson exA ndr. )W illd. ‘ he imo’ 广东
6 多花兰 C. floribundum L ind.l 云南 31 企黑 C. sinense(Jackson exA ndr. )W illd. ‘ qihei’ 广东
7 台兰 C. floribundum L ind.l ‘ tailan’ 云南 32 软剑白墨 C. sinense(Jackson ex Andr. )W illd. ‘ ruanjian ba imo’ 华南植物园
8 果香兰 C. suavissimum Sander ex C. Curtis 云南 33 落叶兰 C. defoliatum Y. S. Wu e t S. C. Chen. 云南
9 西藏虎头兰 C. tracyanum L. Ca stle 云南 34 莎叶兰 C. cyperifolium Wal.l ex Lind.l 云南
10 虎头兰 C. hookerianum Rchb. .f 云南 35 寒兰 C. kanranM akio 广东
11 滇南虎头兰 C. w ilsonii(Rolfe ex Cook)Ro lfe 云南 36 青寒兰 C. kanranM akio‘ qinghanlan’ 广东
12 美花兰 C. insigne Ro lfe 浙江 37 紫寒兰 C. kanranM akio ‘ zihanlan’ 云南
13 朱砂蝉兰 C. iridioides D. D on 云南 38 蕙兰 C. faberiRo lfe. 云南
14 长叶兰 C. ery thraeum Lind.l 云南 39 春兰 C. goeringii(Rchb. .f ) Rchb. .f 云南
15 碧玉兰 C. lowianum(Rchb. f) Rchb. .f 云南 40 朵香 C. goeringii(Rchb. .f )Rchb. .f ‘duoxiang’ 云南
16 文山红柱兰C. wenshanense Y. S.Wu et F. Y. Liu 云南 41 豆瓣兰C. goeringii(Rchb. .f )Rchb. .f ‘doubanlan’ 云南
17 莎草兰 C. elegans L ind.l 云南 42 春剑 C. goeringii(Rchb. .f ) Rchb. .f va r. long ibracteatum 云南
18 大雪兰 C. mastersiiG rif.f ex L ind.l 云南 43 白花春剑 C. goeringii(Rchb. .f ) Rchb. .f ‘ baihua chun jian’ 云南
19 马关兰 C. mastersiiG rif.f ex Lind.l‘maguan lan’ 云南 44 广东朵香 C. goeringii(Rchb. .f ) Rchb. .f ‘ duoxiang’ 广东
20 独占春 C. eburneum L ind.l 云南 45 莲瓣兰 C. L ianbanlan Tang e tW ang 云南
21 象牙白 C. eburneum L ind.l ‘ xiangya ba i’ 海南 46 黄花莲瓣兰 C. L ianbanlan Tang etW ang‘ huanghua lianban lan’云南
22 斑舌兰 C. tigrinum Parish ex Hook. 云南 47 兔耳兰 C. lancifolium Hook. 云南
23 韶关建兰 C. ensifolium(L. ) Sw. ‘ shaoguan jianlan’ 广东 48 白墨 ×象牙白 C. S inense×C. eburneum 华南植物园
24 大青 C. ensifolium (L. ) Sw. ‘ daqing’ 广东 49 西藏虎头兰 ×象牙白 C. tracyanum ×C. eburneum 华南植物园
25 铁骨素 C. ensifolium(L. ) Sw. ‘ tiegusu’ 云南 50 大花蕙兰 C. ×hybridus 华南植物园
总 DNA的提取主要用常规 CTAB法 〔4〕 , 叶片相对肉质的果香兰 、 斑舌兰 、台兰 、多花兰 、 纹瓣
兰 、硬叶兰用低盐 CTAB沉淀法〔5〕。除美花兰用干叶之外 , 其它材料均为新鲜叶片。 20 μL PCR反应
体系包括 10mmol L -1 Tris-HC l(pH 9.0), 50 mmo l L - 1 KC l;200 μmo l L - 1的各种 dNTPs;0.3
μmo l L- 1的 primer;20 ng的模板 DNA;1 units的 Taq聚合酶;2.0 mmo l L -1的 Mg2+ 25 μL的矿物
油 。用于扩增的随机引物见表 2。 PCR反应在 PTC-100TM上进行。反应程序:94℃ 4 m in ;36℃ 1
m in;72℃ 2m in, 1个循环 。 94℃ 1 m in;36℃ 1 m in;72℃ 2 m in, 28个循环。 94℃ 1 m in;36℃ 1
m in;72℃ 10 m in , 1个循环。扩增产物用 1.5% Agarose检测 , 电泳结果用无镀膜黑白速照胶片照
相记录 。
以 100 bpM arker作为分子量标记 , 确定胶上
各 RAPD带的位置和分子量大小 。在同一位置上
的带属同一位点 ( locus), 在某一个位点上 , 有
带的样品记为 “ 1”, 无带记为 “0”。所得的位点
按分子量从大到小排列 。所获数据用 NTSYS-pc
V1.80软件处理 , 计算 Jaccard系数 , 用 UPGMA
进行聚类分析 , 得出树状图。
表 2　用于 RAPD的引物序列
Table 2　Sequence o f the random nucleotide prim ers
引物
P rimer
序列
Sequence
引物
P rimer
序列
S equence
S106 ACGCATCGCA S167 CAGCGACAAG
S121 ACGGATCCTG S174 TGACGGCGGT
S133 GGCTGCAGAA S178 TGCCCAGCCT
S140 GGTCTAGAGG S180 AAAGTGCGGG
S142 GGTGCGGGAA S198 CTGGCGAACT
S143 CCAGATGCAC S199 GAGTCAGCAG
2　结果与讨论
2.1　RAPD扩增结果
从 100个购自上海 SanGon的引物中初选出 20个 , 对 50个材料进行 RAPD扩增 , 从中选出 12个
带多且亮 , 重复性好的引物的扩增产物作为最后结果 , 共获得 250条可明显区分的 DNA扩增片段 ,
1122
　6期 孙彩云等:中国兰属植物种间及品种间亲缘关系的 RAPD分析　
除 S143 - 850 bp 1条带为全部材料共有外 , 其余带均为多态性位点 。这些带最大的为 2 100 bp, 最小
的为 200 bp, 以集中在 1 031 bp ～ 300 bp之间的带居多 (图 1)。
图 1　引物 S143的 RAPD扩增结果
1～ 50为不同材料的编号 , 详见表 1。
F ig. 1　The RAPD ampl ified profile us ing the prim er S143
1 - 50 are m ateria l codes, see tab le 1.
　　兰属 50个材料的聚类树状图的 Jaccard相似
性系数主要集中在 0.100 ～ 0.250之间 , 其中建兰
的两个品种:韶关建兰和大青之间的相似系数最
大 , 为 0.644。白花春剑和碧玉兰 、 白墨 ×象牙
白和冬凤兰 、 西藏虎头兰 ×象牙白和蕙兰 、大花
蕙兰和冬凤兰之间的相似系数最小的为 0.050。
2.2　亚属的划分
RAPD的 UPGMA聚类树状图 (图 2)所呈现
出亚属间的亲缘关系大体与 ITS〔3〕系统发育一致。
建兰亚属可能为一自然类群 (虽然其成员之一广
东朵香与建兰亚属的主体和大花亚属的主体构成
三歧分支 )。大花亚属并非自然类群 , 其成员之
一文山红柱兰偏离出去与兰亚属聚在一起。兰亚
属则为一高度异质性的类群 , 图 2中兰亚属分散
成互不关联的 3支。本文的结果和 ITS系统发育
分析表明 , 有必要对经典分类〔6〕兰属属下分类 ,
特别兰亚属进行修订 。
2.3　组的划分和组间及种间亲缘关系
RAPD的研究结果支持传统分类对兰亚属组
的划分 , 但文山红柱兰在硬叶组 , 长叶兰在带叶
组 。
图 2　兰属种间 、 品种间 RAPD的 UPGMA聚类树状图
F ig. 2　UPGMA dendrogram o f 50 Cymb id ium species,
cultivars in Ch ina ba sed on Ja ccard coefficient ob tained
from 12 RAPD prim ers
　　大花亚属中 , 大花组和腋花组亲缘关系最近 , 莎草组和斑舌兰组亲缘关系最近 。在腋花组中 , 独
占春与大雪兰最先聚合 , 然后是马关兰 , 最后是象牙白 , 这一结果不支持传统分类认为马关兰是大雪
兰的变种 , 象牙白是独占春变种的观点。
《中国植物志》第十八卷〔7〕把建兰亚属分为 3个组 , 其中把春兰组合到建兰组。而有文献把春兰
组和建兰组分开 〔6〕。从树状图看 , 建兰亚属的 3个组中 , 建兰组和春兰先聚合成 1个大分支 , 兔耳兰
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组与落叶兰和一些野生花组成另一分支。所以 , 建兰组和春兰组无论分开或合并都可以 。本研究与
Puy等〔6〕、 梁红健等 〔2〕对寒兰的分类的看法不同 , 而支持陈心启 〔8〕的观点 , 把寒兰与莎叶兰 、 春兰 、
蕙兰 、 莲瓣兰放在一起构成春兰组。建兰组中 , 传统分类把落叶兰归在建兰组中 , 本研究却显示它与
兔耳兰亲缘关系较近 。建兰和墨兰的各个品种都先聚合 , 然后再构成建兰组 , 说明两者亲缘关系很
近 。
2.4　种间多样性
RAPD结果显示种内不同品种间的多样性不同 , 仅春兰各品种间的变异较高 , 这造成品种间形成
了两个分枝 , 而纹瓣兰 、大雪兰 、墨兰 、 韶关建兰 、寒兰 、 台兰等种内各品种都聚在一起形成 1个单
独的分枝 , 这些种内不同品种间的遗传多样性不高 。
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C hen S C, J iZ H. The orchids of Ch ina. B eijing:Ch ina Forestry Publishing House, 1998. 70～ 102 ( in Ch inese)
中国园艺学会第七届青年学术讨论会
中国园艺学会第九届第 8次常务理事扩大会决定 , “中国园艺学会第七届青年学术讨论会 ” 由山东农业大学园艺
科学与工程学院和山东省园艺学会承办 , 将于 2006年 7月或 8月在山东泰安举行。
会议交流主题:(1) 园艺作物种质资源 、 遗传育种与生物技术;(2) 园艺作物有机 、 无公害及标准化安全生产;
(3) 园艺作物栽培及生理 、 生态;(4)园艺作物采后处理 、 贮藏与加工技术;(5) 园艺作物病虫害综合治理;(6)
园艺环境与工程;(7) 设施园艺;(8)园艺作物种业;(9) 园艺教育;(10) 园艺产品的国内与国际贸易;(11) 其
他。会议征文需提交未公开发表过的论文。其撰写格式请参照 《园艺学报》论文的格式要求 , 字数 (含图表) 勿超
过 5 000字。论文可通过电子邮件 (xkzhao@ sdau. edu. cn;yykx2238@163. com)提交 , 也可邮寄拷贝有该论文的 3. 5
寸软盘 (M icro softW o rd格式)。经专家评审被接受的论文将在会议召开之前编辑成论文集 , 正式出版发行。征文截止
日期:2005年 12月 31日。
联系人:赵祥奎 、 王秀峰;联系地址:(271018) 山东泰安岱宗大街 61号 , 山东农业大学园艺科学与工程学院
“学术会议秘书组”;电话:0538 -8242654, 8242456;传真:0538 - 8242654, 8242456;电子信箱同上。
山东农业大学
园艺科学与工程学院
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