全 文 ：园 艺 学 报 2005, 32 (2):268 ～ 272
Ac taH or ticu ltu rae S inica
收稿日期:2004 - 06 - 10;修回日期:2004 - 12 -07
基金项目:广东省科技攻关项目 (C 20304, 2002A204, 2003A2010401)
*通讯作者 A thor for corresponden ce
利用 RAPD和同工酶研究中国兜兰属种间亲缘关系
孙彩云 张明永 叶秀 * 梁承邺 夏快飞
(中国科学院华南植物园 , 广州 510650)
摘 要:本文选择 14种 10个碱基的寡核苷酸引物和 7种酶系统 , 应用 RAPD和同工酶分子标记技术分
析中国兜兰属 (Paphiopedilum) 种间亲缘关系 , 并与陈心启和 C ribb的传统分类 、 C ox等的 ITS结果进行比
较。研究结果显示 , RAPD和同工酶两种手段对种间亲缘关系的划分与传统分类大致吻合 , 同工酶比 RAPD
的结果更接近传统分类 。兜兰亚属需进一步分组 , 彩云兜兰 、 卷萼兜兰 、 紫纹兜兰及其变种云南虎皮应自
成一个组。
关键词:兜兰属;RAPD;同工酶;亲缘关系
中图分类号:Q 941+. 2 文献标识码:A 文章编号:0513-353X (2005) 02-0268-05
The Relationsh ip ofPaphioped ilum Species in China by RAPD and Isozym e
Sun C aiyun, ZhangM ingyong, Ye X iu lin* , Liang Chengye, and X ia Kua ife i
(South China Arboretum , the Chinese Academ y of Sciences, Guangzhou 510650, Ch ina)
Abstract:RAPD and isozyme ana lyses by 14 primers, which are 10 o ligonucleo tides, and 7 isozyme
sy stems w ere used to the study of the re lationsh ip among species of Paphioped ilum in C hina. M eanwh ile the
classifications ofPaphioped ilum got from traditiona l classification (Chens and C ribbs), ITS (Coxs), RAPD
and isozyme (Ou rs) are compared in this pape r. The resu lt show s that the rela tionship of the subgenus re-
vealebs isozyme dater ismo re sim ilar to traditional c lassification than that o fRAPD da te r. Ou r results exhibited
that the SubgenusPaphiopedilum need to be subdivided into seve ra l sections. The speciesP. ward ii, P. ap-
pleton ianum , P. purpuratum , P. ‘Yunnahupi’ arew a llcuted its own section.
Key words:Paph ioped ilum;RAPD;Isozyme;Re lationship
兜兰属 (Paphioped ilum Pfitzer)是兰科中较原始的属 , 中国兜兰属有 18个原生种 〔1〕。近年来 ,
国外用分子标记技术研究兜兰属遗传多样性的报道并不多 , M in等〔2〕用 RAPD分析 3种兜兰 , 研究发
现:Paphioped ilum barba lum (Lind.l ) P fitzer的 RAPD位点的多态性高于 P. ca llosum (Rch b. .f )
S tein和 P. n iveum (Rch b. .f ) Ste in。该结果与形态学 、系统学和核型分析的结果一致。 Antony V.
Cox等〔3〕应用核 rDNA的 ITS核苷酸序列数据 , 研究杓兰属 、兜兰属 、 美洲兜兰属 、 碗兰属 、墨西哥
兰属的 150 ～ 170个种之间的亲缘关系 , 兜兰属的研究包括了中国兜兰属的 15个原生种。 ITS树状图
明确了 5个属和各属内种间的亲缘关系 , 兜兰属的划分与 C ribb的传统分类基本一致 。本研究搜集
了中国兜兰属的 17个原生种 (占分布种的 95%)、 2个变种及产于泰国的胼胝兜兰及其变种 , 利用
RAPD和同工酶技术研究这些种 、 变种和品种间的亲缘关系 , 以探讨分子标记技术所重建的兜兰属的
系统关系与传统形态分类的亲合度。
1 材料与方法
1.1 材料
21个供试材料见表 1, 分别来源于云南京正花卉公司和华南植物园。由于胼胝兜兰 (P. callo-
DOI牶牨牥牣牨牰牬牪牥牤j牣i ssn牣牥牭牨牫牠牫牭牫x牣牪牥牥牭牣牥牪牣牥牨牰
2期 孙彩云等:利用 RAPD和同工酶研究中国兜兰属种间亲缘关系
sum)及其变种 , 小叶兜兰 (P. barb ige rm)和卷萼兜兰 (P. appleton ianum ) 4种材料数目较少 , 未
能用于同工酶试验。
表 1 兜兰属供试材料
Table 1 The species, va rieties o f Chinese Paphioped ilum for RAPD and isozym e
编号
C ode
种及变种或品种
Species, varieties or cu ltivars
染色体数
Num ber
of ch ro-
m osom e
分布
D istribu tion
编号
C ode
种及变种或品种
Sp ecies, varieties or cu ltivars
染色体数
Number
of chro-
m osom e
分布
D istribut ion
1(1)
麻栗坡兜兰
P. ma lipoen se S. C. C hen et
2n=26
云南 、贵州 、越南
12(9)
带叶兜兰 P. hirsut issim um
(Lind.l ex H ook. ) S tein
2n=26
云南 、广西 、贵州
2(2)
同色兜兰
P. con co lar(B etem an) Pfitz
2n=26
云南 、广西 、贵州 、
泰国、柬埔寨、缅甸
13(10)
富宁兜兰
P. esquiro lei S ch ltr.
2n=
云南
3(3)
彩云兜兰
P. ward ii Summ erh
2n=
云南 、缅甸
14(11)
紫毛兜兰
P. villosum(Lind .l ) S tein
2n=
云南、越南 、老
挝 、泰国 、缅甸
4(4)
云南虎皮
P. “Yunnanhup i”
2n=
云南
15(12)
波瓣兜兰
P. insign e(Lind .l ) P fitz
2n=
云南
5(5)
紫纹兜兰
P. purpura tum(Lind.l ) S tein
2n=
广西 、广东 、
云南 、越南
16
卷萼兜兰
P. app leton ianum(Gow er) Rolfe
2n=
海南 、广西
6(6)
杏黄兜兰
P. armeniacum S.C. Chen etF.Y. Liu
2n=26
云南 、缅甸
17(13)
白花兜兰
P. em ersoni iK oopow itz et C ribb
2n=26
贵州 、广西
7(7)
硬叶兜兰
P. m icran thum T. Tang et F. W ang
2n=26
云南 、广西 、贵州
18(14)
红旗兜兰
P. charlesworth ii
2n=
云南
8
胼胝兜兰
P. ca llosum
2n=
泰国 、柬埔寨
19(15)
长瓣兜兰
P. d ianthum T. Tang et F. W ang
2n=
云南 、泰国 、贵州
9
胼胝兜兰变种
P. ca llosum var.
2n=
泰国 、柬埔寨
20(16)
飘带兜兰
P. par ish ii(Rchb. .f ) S tein
2n=26
云南 、泰国 、缅甸
10(8)
亨利兜兰
P. henryanum B raem
2n=
云南 、越南
21(17)
波萨尔兜兰
P. boxa lli
2n=
云南
11
小叶兜兰
P. barbig erum T. Tang et F. W ang
2n=
广西 、贵州
注:括号内的数指同工酶供试材料的编号。
Note:Th e num ber in th e b racketw as the rep resen tative of the serial number ofm aterials.
1.2 RAPD分析
总 DNA的提取用低盐 CTAB沉淀法 [ 4] 。供试
材料全部为新鲜叶片。兜兰叶片多肉质 , 含多糖
和色素等较多 , 所以用氯仿∶异戊醇 (24∶1)抽
提 2次。 0.8% Agarose检测 DNA 质量 。 20 μL
PCR反应体系包括 10mmo l /L T ris-HC l(pH 9.0),
50 mmo l /L KC l;200 μmo l /L的各种 dNTPs;0.3
μmo l /L的 Primer;200 ng的模板 DNA;2 units的
Taq聚合酶;3.0mmol /L的 Mg2+;25 μL的矿物
油 。用于扩增的随机引物见表 2。 PCR反应在 PTC-
表 2 兜兰属的 RAPD引物序列
Tab le 2 Prim ers used in RAPD of Paph ioped ilum
引物
P rimer
序列 5’ -3’
S equence
G-C含
量 G-C
con tent
(%)
引物
P rim er
序列 5’ -3’
S equence
G-C含
量 G-C
con tent
(%)
S102 TCGGACGTGA 60 S141 CCCAAGGTCC 70
S104 GGAAGTCGCC 70 S181 CTACTGCGCT 60
S106 ACGCATCGCA 60 S183 CAGAGGTCCC 70
S107 CTGCATCGTC 60 S184 CACCCCCTTG 70
S114 ACCAGGTTGG 60 S188 TTCAGGGTGG 60
S133 GGCTGCAGAA 60 S189 TCCTGGTCCC 70
S136 GGAGTACTGG 60 S191 AGTCGGGTGG 70
100 TM上进行。反应程序:94℃ 2 m in ;33℃ 1 m in;72℃ 2 m in, 1个循环。 94℃ 1 m in;33℃ 1
m in;72℃ 2m in, 40个循环 。 94℃ 1 m in;33℃ 1 m in;72℃ 10 m in , 1个循环。 - 30℃保存 。扩增
产物用 1.5% Agarose检测 , 电泳结果用无镀膜黑白速照胶片照相记录。所获数据用 NTSYS-pc V1.80
(Rohlf, 1993)软件处理 , 计算 Jaccard (1908)系数 , 用 UPGMA进行聚类分析 , 得出树状图 。
1.3 同工酶分析
取兰花植株当年生嫩叶 0.1 g, 冲洗晾干 , 加 0.5mL复杂磷酸提取液〔5〕提取 AAT (天冬氨酸转
氨酶)、 EST (酯酶 )、 ME (苹果酸酶)、 G-6PD (6 -磷酸葡萄糖脱氢酶 )酶液;用 Tris-HC l提取缓
冲液〔5〕提取 PG I (磷酸葡萄糖异构酶)、 PGM (磷酸葡萄糖变位酶)、 SOD (超氧化物歧化酶)酶液。
充分研磨后 , 8 000 ～ 10 000 r /m in离心 2m in, 分装于 5个小离心管 (0.5mL), - 30℃保存备用。保
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园 艺 学 报 32卷
存时间不超过两星期 。 11.1%的 S igma水解淀粉胶电泳 。酶 、提取液 、电泳缓冲液及电泳条件的搭配
见表 3。
表 3 酶 、 提取液 、 电泳缓冲液及电泳条件的搭配
Table 3 The comb ina tion of enzym e, ex traction buffer and electrphoresis
酶〔聚体〕 Isozym e〔P loid ies〕 酶提取缓冲液 E xtraction buffer 电泳缓冲液系统
E lectration Bu ffer
电泳条件 E lectrat ion condi tion
AAT〔2〕, EST〔1, 2〕, G-6 PD〔2〕, ME〔4〕
复杂磷酸提取液 A
Com p lex PBS extraction buffer A
3×A
260～ 280 V , 150mA , 4℃, 6～ 8 h
PGT〔2〕, PGM(NADP)〔1〕, SOD〔2, 4〕
Tris-HC l提取液 B
Tris-HC l extraction buffer B
4×B
280～ 300 V , 150mA , 4℃, 8 h
读出各供试材料每一种酶谱的基因型 , 用 POPGENE V 1.31进行分析 , 计算 Nei的遗传一致度和遗
传距离 , 得到系数矩阵图 , 用 UPGMA进行聚类分析和 Treev iew V 1.50软件处理 , 得出树状分枝图。
2 结果与分析
2.1 RAPD分析结果
14个寡核苷酸引物共产生 235条可明显区分
的 DNA片段 , 除保守位点 S102-500 bp、 S106-
1009 bp和 S183-700 bp 3个片段全部材料都具有
外 , 其余均为多态性片段 。最大片段为 2500 bp,
最小的为 166 bp, 主要集中在 200 ～ 1031 bp之间
(图 1)。
21个兜兰种间的树状聚类分枝图如图 2。这
些材料的 Jaccard相似性系数中有 3个在 0.50以
上 。其中杏黄兜兰 (P. armeniacum )和硬叶兜
兰 (P. m icran thum )之间的相似性系数最大 , 为
0.775, 长瓣兜兰 (P. d ianthum ) 和飘带兜兰
(P. parish ii)的相似性系数为 0.709, 云南虎皮
(P. Yunnanhupi)和紫纹兜兰 (P. purpura tum )
的为 0.578。其余的相似性系数集中在 0.150 ～
0.30。卷萼兜兰和带叶兜兰 (P. hirsutissimum )
之间的相似性系数最小 , 为 0.100。杏黄兜兰和
硬叶兜兰 , 长瓣兜兰和飘带兜兰 , 云南虎皮和紫
纹兜兰彼此之间的亲缘关系较近;卷萼兜兰和带
叶兜兰之间的亲缘关系较远 , 它们的形态特征差
别也比较大 。
2.2 同工酶分析结果
2.2.1 酶谱情况 兜兰属 17个原生种共染了 7
种酶 , AAT、 G-6PD、 ME、 PGM 各获得 1个位
点 , EST和 PG I各为两个位点 , SOD得到 3个位
点 。多态性位点的百分率为 90.91%。 7种酶的谱
带模式图 (图 3)。虽然单个酶不能把 17个材料
分开 , 但其中的 2 ～ 3个酶可以把它们区别开来 ,
特别是多态性程度较高的 EST、 PG I、 SOD同工酶
图 1 引物 S102 (上)、 S106 (中)和 S183 (下)
的 RAPD扩增结果
1～ 21为不同材料的编号, 详见表 1。
F ig. 1 The RAPD amp lified profile using the prim er
S102 (up), S106 (m iddle) and S183 (under)
1 - 21 is the num ber of materials, see Tab le 1.
图 2 兜兰属 RAPD树状图
F ig. 2 UPGMA dendrogram of 21 Paphioped ilum species based
on Jaccard coefficient ob ta ined from 14 RAPD prim er
270
2期 孙彩云等:利用 RAPD和同工酶研究中国兜兰属种间亲缘关系
酶谱 (图 4)。
图 3 兜兰属种间同工酶谱带模式图
F ig. 3 Schem atic illus tration o f isozym e o fP aphioped ilum species
图 4 兜兰属 17个种的同工酶酶谱
(编号 1～ 17的种名见表 1)
F ig. 4 Isozymem aps of 17 species of Paph ioped ilum
Th e species No. 1 - 17 in Tab le 1
图 5 兜兰属种间同工酶的 UPGMA聚类树状图
F ig. 5 UPGMA dendrogram o f 17Paphioped ilum species in China
ba sed on N eis genetic d istance obta ined from seven isozym es
2.2.2 遗传距离和树状图 读出各位点基因型 , 用 POPGENE V 1.31和 TreeV iew1.50软件处理资料 ,
据 N ei计算遗传一致度和遗传距离 , 进行 UPGMA聚类分析 , 得出树状图 (图 5)。
富宁兜兰 (P. esquirolei)和杏黄兜兰 、 硬叶兜兰之间的遗传距离最大 , 都为 1.450 , 其它材料
的遗传距离主要是集中在 0.200和 1.100之间 。
3 讨论
陈心启 〔1〕把中国兜兰属 18个原生种划分为宽瓣亚属 (Subgenus Parvisepa lum ) 和兜兰亚属
(Subgenus Paphioped ilum ), 亚属没有进一步分组 。 C ribb〔6〕把兜兰属分为 Parvisepalum 、 B rachypeta-
lum 和 Paphioped ilum 3个亚属 , 其中的 Paph ioped ilum 亚属又进一步分为 5个组 , 即 Coryoped ilum 、
Parda lopeta lum 、 Coch lopetalum、 Paphioped ilum 、 Barbata。产于中国的 18个种分别划在 3个亚属 ,
其中在 Paphioped ilum亚属中只有 Parda lopetalum、 Paph ioped ilum 和 Barbata 3个组有中国的种。 Cox
等 〔3〕应用核基因组 rDNA的 ITS系列对中国兜兰种的划分 , 无论是亚属或组的划分与 C ribb〔6〕的基
本一致 。
从 RAPD和同工酶的研究结果看大多数种的聚合情况是相近的 , 只是同工酶把同色兜兰和白花兜
兰划入了 Paph ioped ilum亚属 , 但同色兜兰独立一个组;而 RAPD把同色兜兰划到 Parvisepalum 亚属 ,
白花兜兰仍在 Paph ioped ilum亚属内。虽然同工酶和 RAPD把白花兜兰放在不同的亚属 , 但从两者聚
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园 艺 学 报 32卷
合情况看白花兜兰与彩云兜兰 、紫纹兜兰 、云南虎皮聚合成的分支组的亲缘关系都较近 。陈心启把同
色兜兰和白花兜兰划到 Parvisepa lum 亚属 , C ribb和 Cox等的 ITS把同色兜兰划到另一个亚属
(B rachypetalum 亚属 ), 白花兜兰划到 Parvisepa lum 亚属 。可见 RAPD、 同工酶 、 ITS〔3〕和陈心启 、
C ribb
〔6〕传统分类法之间的主要分歧在于同色兜兰和白花兜兰的位置。
据 RAPD与同工酶的研究结果 , 我们认为中国兜兰属划分有两种方法:(1)划分为 Parvisepa lum
和 Paphiopedilum 亚属 , Paph ioped ilum 亚属再分为 3个组 。 (2)划分为 3个亚属 , 即 Parvisepalum、
Paphiopedilum和 B rachypetalum 亚属 , Paph iopedilum 亚属再分为两个组。以上两种划分方法都说明
Paphiopedilum亚属需进一步分组 , 结合现有彩云兜兰 、紫纹兜兰 、 云南虎皮 、 卷萼兜兰的活体植株的
形态特征 , 我们认为彩云兜兰 、 紫纹兜兰 、 云南虎皮 、 卷萼兜兰应自成一个组;与 Cox等的 ITS〔3〕
和 C ribb〔6〕的分类结果也很相似 , 只是在 3个组之间的关系及组内的部分种间亲缘关系上有所不
同 。兜兰亚属 (Paph iopedilum)进一步分组是合理的 。致于造成组之间的关系及组内的部分种间
亲缘关系上有所不同的原因可能有以下几种:(1)植物的形态特征和遗传组成的差异 。由于气候 、
环境等因素的影响 , 有的种形态特征发生了变化 , 但其遗传物质却未发生变化;有的则正好相反 。
(2)不同的分类手段各自有优缺点 。 ITS检测的是 rRNA的内转录间隔区 , 即 18S和 26S rRNA基
因之间的非编码系列的核苷酸组成情况 , 同工酶所反映的是结构基因所编码的产物 , 即蛋白质的
情况 , 而 RAPD所反映的则是整个基因组的情况 , 虽然同在分子水平 , 但所反映的则是分子水平
的不同层次的状况 , 所以结果不可能会完全吻合。当然 , 对于种间亲缘关系的研究 , ITS是比较高
效可靠的方法 。因为 ITS在被子植物中长度很保守 , 均为 200 ～ 300 bp, 易于进行 PCR扩增及测序
分析 , 同时它属于中度保守的序列 , 这些特点使短小的 ITS区可提供足够多的信息作种或种以下系
统分类研究及遗传变异分析 〔7〕。 RAPD作为一种较敏感的分析手段适用于作物种质资源的比较 、 鉴
定;不同育种材料亲缘关系的判断以及群体纯度检测等方面 。所以应该根据不同的目的选择不同
的研究方法 。至于白花兜兰和同色兜兰的真正的分类学位置应如何确定尚需进一步研究 。
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