全 文 ：西北农业学报　2010 , 19(3):70-75
Acta A griculturae Boreali-occidentalis Sinica
甘蓝型油菜和诸葛菜属间杂种的获得及其特性＊
王爱云1 ,2 ,李　栒2＊ ,胡大有3
(1.中南林业科技大学生命科学与技术学院 ,长沙　410004;2.湖南农业大学油料作物研究所 ,
长沙　410128 , 3.湖南益阳职业技术学院 ,湖南益阳　413039)
摘　要:采用人工授粉并结合子房培养的方法 , 进行了甘蓝型油菜和诸葛菜的正反属间杂交。授粉后 5 ～ 10
d , 取子房培养于 MS 或 B5 培养基(添加 6-BA、NAA、水解酪蛋白和活性碳), 结果表明 , 子房培养有助于提高
甘蓝型油菜和诸葛菜属间杂种获得频率。不同杂交组合 , 属间杂交可交配性不同。以诸葛菜为母本的所有杂
交组合没有获得成功 ,但是在以甘蓝型油菜为母本的正交组合中获得了 18 株属间杂种 , 其中 8 株在形态上近
似母本湘油 15 , 10 株来自于 742 与诸葛菜杂交组合 , 表现出完全的雄性不育 ,幼苗期叶色浅黄 , 生长发育缓
慢 ,植株矮小 , 花瓣呈现乳白色 ,第一次分枝数少且分枝部位较高。形态学和微卫星标记分析表明 , 这些植株
是真正的属间杂种。杂种后代植株(F 2 代或回交一代)表现多型性 , 多数植株的性状倾向母本甘蓝型油菜 , 可
育;部分植株表现为双亲的中间型 , 部分可育;少数植株发育缓慢 , 不育。这些杂种植株可能是油菜遗传改良
的宝贵资源。
关键词:甘蓝型油菜;诸葛菜;子房培养;属间杂交;杂种鉴定
中图分类号:S565　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1004-1389(2010)03-0070-06
Production and Characterization of Intergeneric Hybrids between
Brassica napus and Orychophragmus violaceus
WANG Aiyun1 ,2 , LI Xun2＊and H U Dayou3
(1 .C ol lege of Li fe S cien ce and Technology , Cent ral S ou th Universi ty of Forest ry and Teachnology , Changsh a
410004 , China;2.Th e Oi l C rop s In sti tu te , Hunan Agricultural University , Changsha　410128 , China;
3.Yiyang Vocat ional and T ech nical C ollege , Yiyang H u nan　413039 , China)
Abstract:Interg eneric reciprocal hybridization between B.napus and O.v iolaceus were conducted to
int roduce desi rable t rait s o f O.violaceus into cult ivated Brassica species by manual po llination and o-
vary culture.The ova ries pol linated w ere cultured on MS or B5 medium supplemented w ith various
plant hormones at 5 ～ 10th day after po llination , the results show ed that ovary culture helped to obtain
the intergeneric hybrids f rom the crosses B.napus ×O.violaceu , and g reat differences on the interge-
neric cro ssabili ty w ere found among cro ss combinations.All reciprocal cro sses failed , but 18 hybrid
plants w as obtained in the direct crosses , eight of w hich w ere similar to female parent B.nap us , ten
plants from the cro ss 742(B .nap us ,2n=38 ,AACC)×O.violaceus exhibited t rai ts w hich w ere not ob-
served in the parents , such as slight ly yellow ish leaf in y oung hybrid , slow g row th , dw arf , creamy
white petal , few er number of primary branche s and higher branching po sitio ns and complete male ster-
ile.Morpholo gy and analysis of micro satel li te markers proved that the hybrids were validated to be re-
al intergeneric hybrid obtained through ovary cul ture.The hybrid o ffspring s(F2 or BC1)showed po l-
＊收稿日期:2009-08-20　　修回日期:2009-10-20
基金项目:湖南省科技厅资助项目(05NK3046 , 2008SK4027);中南林业科技大学林木遗传育种学科建设费。
作者简介:王爱云(1964-), 女 , 湖南桃江人 , 副教授 , 博士 , 主要从事遗传育种教学和研究 。 E-mail:wangaiyun 12@ya-
hoo .com .cn
＊通讯作者:李　栒,女 ,教授 ,主要从事油菜遗传育种教学和研究。
ymo rphism.among the hybrid of fspring s ,most of them we re nearly matro clinous and fe rtile , simi lar to
B.napus , some w ere intermediate between the tw o parents show ing part ially fe rtile , and a few w ere
poo rly developed and male sterile.The hybrids should be valuable resource for the genetic improve-
ment o f oilseed g rape.
Key words:Brassica nap us;Orychophragmus v iolaceus;Ovary culture;Interg eneric hybridization;.
Hybridity verif icat ion
　　远缘杂交是产生遗传变异的有效方法 ,被广
泛应用于油料作物品质改良育种中[ 1-11] 。甘蓝型
油菜由于菜籽产量高 、品质优良 ,因而种植范围
广。近年来 ,尽管对于甘蓝型油菜遗传改良作了
大量研究 ,但是其遗传基础仍然相当狭窄 ,因此 ,
将野生种质资源的优良基因导入甘蓝型油菜中 ,
丰富油菜的基因库 ,具有重要的理论和实践意义。
诸葛菜(Orychophragmus violaceus), 芸薹族植
物 ,起源于朝鲜和中国 ,具有许多优良的农艺性
状 ,亚油酸(53.7%)和棕榈酸(14.3%)含量高 ,
亚麻酸(4.76%)和芥酸(0.94%)含量低[ 12] ,是十
字花科作物育种的优良种质资源。李再云等[ 1] 通
过有性杂交方法获得了甘蓝型油菜和诸葛菜的属
间杂种 ,但杂交率低 。由于基因组的非正常分离 ,
这些杂种除包含完整或部分甘蓝型油菜的染色体
外 ,仅包含诸葛菜的部分染色体或染色体片段。
为了获得新的附加系 ,因此有必要进一步开展甘
蓝型油菜和诸葛菜的属间杂交研究 。本研究拟用
不同的杂交组合 ,筛选高结籽率的甘蓝型油菜品
种 ,创造新的育种材料。
1　材料和方法
1.1　材 料
3个甘蓝型油菜(B.napus ,2n=38 , AACC)
品种为湘油 15 , 742 和 681A(雄性不育),由湖南
农业大学油料作物研究所提供 。诸葛菜(O.v io-
laceus ,2n=24 , OO),由南京植物研究所提供 。于
2004年 10月种植于湖南农业大学试验地 ,一般
栽培管理 。
1.2　杂交方法
2005年 3-4月 ,以甘蓝型油菜和诸葛菜为
亲本 ,在田间采用人工剥蕾去雄 、重复授粉方法 ,
进行正 、反属间杂交。授粉后 5 ～ 10 d ,将一些带
花托雌蕊切下 ,用于子房培养;另一些留在田间植
株上直到其完全成熟或干枯 ,作为试验对照 。用
于组培的子房首先用 70%的乙醇消毒 1 ～ 2 min ,
然后用质量浓度为 0.001 g ·mL -1的氯化汞灭菌
10 min ,无菌水冲洗 5次 ,最后将子房置于添加不
同质量浓度的植物激素(6-BA 、NAA 、IAA 和
KT)、500 mg · L-1水解酪蛋白和质量浓度为
0.005 g · mL -1的活性碳的 MS[ 13] 和 B5 [ 14] 培养
基(含糖 30 g ·L-1 、琼脂糖 7.5 g ·L -1 、pH 5.8)
上培养。在 16 h 光照/8 h 黑暗 ,光强 40μmol ·
m-2 · s-1 ,温度(25±2)℃,相对湿度 60%～ 70%
条件下 ,培养约 30 d ,收获成熟的种子。将种子置
于分化培养基(MS 添加 2.0 mg · L-1 6-BA 和
0.2 mg · L-1 NAA)上进一步培养 ,直到长成小
植株或丛生芽 。将丛生芽分割为许多单芽 ,转接
到新鲜培养基中 ,扩大繁殖系数。约2 周后 ,幼苗
转接于 MS(添加 0.05 mg ·L -1 NAA)或 1/2
MS 生根培养基中进行生根培养 。当植株高度达
8 ～ 10 cm ,进入 4 ～ 5叶期时 ,进行炼苗 ,然后种植
于盆钵中 , 置光照培养箱(16 h 、20℃光照/8 h 、
10℃黑暗 ,光强 40 μmol ·m-2 · s-1 ,相对湿度
60%)中生长。
1.3　杂种的形态特征和花粉育性分析
观察 、比较 F 1 杂种和亲本苗期 、开花期和成
熟期等不同生长发育阶段的形态学特征 。在植株
成熟期 ,对其农艺性状进行调查研究。
按照李栒[ 15] 的方法 ,上午 9:00-10:00 取当
天开放的花蕾 ,用镊子拨开花蕾 ,将花药放在载玻
片上 ,用手术刀将花药切断 ,挤出花粉用质量浓度
为 0.01 g ·mL -1醋酸洋红处理花粉 ,染色 3 ～ 5
min ,在 Panasonic显微镜(10×20)下观察 ,每朵
花观察 5个视野 , 100 ～ 150 个花粉粒 ,统计红色 、
圆形花粉粒数 ,并计算可育花粉率。用可育花粉
率作为评价花粉育性的指标 。可育花粉率=(可
染色花粉粒数/观察总花粉粒数)×100%。
1.4　微卫星标记分析
采用改良 CTAB法[ 16] 提取 F1 及亲本小苗嫩
叶总 DNA 并纯化 ,用普通琼脂糖电泳检测品质。
SSR反应在 PCR仪中进行 ,其反应程序为:94℃
预变性 5 min , 94℃变性 1 min , 58℃退火 45 s ,
72℃延伸 1.5 min , 38个循环 ,72℃延伸 8 min ,
·71·3 期　　　　　　　　　　王爱云等:甘蓝型油菜和诸葛菜属间杂种的获得及其特性
结束反应 。55对引物中 Na10-G05(Sens5′-CG-
CA TG T TCCCACTACGATA-3′, A ntisense5′-
AAAACTAA TTGACAGATG TG TTCT -3′)对
于亲本显示明显的多态性 ,能够用于杂种真假的
鉴定 。PCR 扩增产物用质量浓度为 0.01 g ·
mL
-1
EB 染色 ,在质量浓度为 0.03 g ·mL-1琼
脂糖凝胶中电泳 ,用 Gel DOC1000 凝胶分析仪
(BIO-RAD , USA)进行观察 、分析和照相。
2　结果与分析
2.1　杂交组合对子房培养的影响
在 5个正 、反交杂交组合中 ,通过子房培养 ,
不同的杂交组合获得的角果数 、饱满种子数 、幼苗
数和杂种植株数明显不同(表 1)。在湘油 15×诸
葛菜 、742×诸葛菜和 681A ×诸葛菜 3个正交组
合中 ,获得了 13粒饱满种子 ,44株幼苗。其中 10
株来自于 742×诸葛菜 ,形态上完全不同于其双
亲;而由杂交组合湘油 15×诸葛菜获得的 8株幼
苗 ,在形态上近似母本(湘油 15),其余 26株与相
应的母本完全一致 。因 681A 为不育系 ,因此只
配置了 2个反交组合 ,即诸葛菜×湘油 15和诸葛
菜×742 ,在这两个反交组合中 ,仅仅从诸葛菜×
湘油 15获得了 1 粒饱满种子 ,将该种子接种于
MS 培养基上 ,萌发 ,最后获得了 13株幼苗 ,完全
相似于诸葛菜 。对于留在田间生长的子房 ,大部
分在授粉后约 7 ～ 10 d就开始萎焉 ,仅仅 2.8%的
子房形成了果荚 ,且其结籽率很低 。仅仅从 681A
×诸葛菜组合中获得了 1粒饱满种子 ,将其接种
于 MS 培养基上 , 产生了 6 株完全相似于母本
681A 的植株。由此看来 ,选择适合的亲本 、正确
的杂交方向 ,并结合子房培养 ,能够提高杂种植株
的获得频率。
表 1　不同杂交组合对产生杂种频率和杂种培养的影响
Table 1　 Effect of different cross combinations on seed frequency and seed culture
杂交组合
Cross
combinat ion
授粉花朵数
Pollinated
f lo ret(F)
培养子房数
Cultu red
ovary(O)
角果数
No.of
pod
饱满种子
Plum p
seed(S)
干瘪种子
Shrivel
seed
S/O/ % S/ F/ %
每荚种子数
Seed/
pod
种子萌发率/ %
Rate of
seed
germinat ion
幼苗数
No.of
seedling
杂种植株数
N o.of
hyb rid
plan t
湘油 15×诸葛菜 A 1308 804 4 1 4 0.12 0.08 0.25 40.00 8 8
Xiangyou15×O.violaceus B 363 8 0 29 0.00 0.00 0.00 0 0
742×诸葛菜
742×O.violaceus A 509 408 10 7 7 1.72 1.38 0.70 7.14 15 10
B 90 0 0 0 0.00 0.00 0.00 0 0
681A×诸葛菜 A 1570 540 14 5 12 0.93 0.32 0.38 35.29 21 0
681A×O.violaceus B 662 29 1 55 0.15 0.03 1.70 6 0
诸葛菜×湘油 15 A 165 85 1 1 4 1.18 0.61 1.00 20.00 13 0
O.vio laceus×Xiangy ou 15 B 121 0 0 0 0.00 0.00 0.00 0 0
诸葛菜×742 A 104 51 0 0 0 0.00 0.00 0.00 0.00 0 0
O.vio laceus×742 B 96 0 0 0 0.00 0.00 0.00 0 0
注:A.子房培养;B.田间生长。
Note:A.Ovary-cu ltured condi tion;B.Field-grow n con di tion.
2.2　杂种的产生和形态特征
授粉后 5 ～ 10 d 取子房离体培养 1月左右 ,
大部分发育成空瘪果荚 ,但在成熟果荚内壁可见
败育胚痕迹。尽管培养了 3 656 个子房 ,仅收获
到 8个角果 ,14粒饱满种子(表 1),其中 2粒种子
在角果中已萌发 。将收获的种子转移到分化培养
基培养大约 2周后 ,一些发育成了植株 ,另一些则
发育成丛生芽 。将丛生芽分割成单芽培养 ,大约
1月后 ,产生了 57株小苗 。经过生根培养 ,炼苗 ,
移植于营养钵中 ,置光照培养箱中培养 ,最后所有
小苗均发育成了成熟植株 。
在 63株(其中子房培养获 57株 ,田间生长获
6株)F 1植株 , 45株完全相似于其母本 ,18株大部
分形态特征相似于母本 ,但在叶型 、叶色和分枝类
型等方面存在变异 ,初步确定为真杂种 。
由 742×诸葛菜获得的 10株 F1 杂种在幼苗
期 ,叶片呈浅黄色 、较厚 、椭圆形且叶缘锯齿较深 、
叶面光滑 ,明显不同于双亲。叶柄和叶脉呈现紫
色(图 1B),相似于父本诸葛菜 。杂种植株生长发
育迟缓 ,矮小(图 1H)。随着生长发育的进行 ,在
成熟期 ,植株的形态特征发生了明显的改变 ,完全
不同于幼苗期 。叶片呈现正常绿色 ,具三个裂片
(图 1C),相似于 742(图 1A)。相对于亲本而言 ,
杂种植株分枝位置较高 ,仅 3个分枝 ,且没有出现
二次分枝(图 1J)。花蕾和花朵比 742稍大 ,但比
诸葛菜小(图 1G),花瓣形状类似于 742 ,但着生
·72· 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　19 卷
方式相似于诸葛菜 ,每花序上花蕾和花朵数明显
少于双亲 ,花朵呈现乳白色且有黄色条纹(图
1F),不像母本 742(全黄)(图 1E)。6个没有伸长
的雄蕊几乎等长 ,而 742 由 4 长 2短雄蕊组成。
花药颜色由灰白变成棕色 ,花粉粒发育不完全 ,表
现为完全的雄性不育(图 2A)。开花期比 742大
约推迟 15 d左右 。
由湘油 15×诸葛菜获得的 8株 F 1 杂种叶型
相似于诸葛菜叶型 ,卵圆形 ,叶缘有浅锯齿 ,叶翅
完全退化 , 叶色介于双亲之间(图 1I)。花蕾大
小 、现蕾时间 、开花期以及花色均与母本相同 ,但
花粉量较母本少 ,花粉可育率 37%(图 2B)。
湘油 15×诸葛菜 F1 植株自交 ,产生 35粒 F2
种子 ,27株 F2 植株。其中 22株大部分性状相似
于其母本湘油 15 ,且可育;5株则明显不同 ,株高
为双亲的中间型 , 65 ～ 80 cm ,出现基生分枝(图
1L),相似于父本诸葛菜 ,部分可育 42×诸葛菜
F1 植株与 742回交 ,产生回交一代种子 21粒 ,15
株回交一代植株。这些植株中 12株相似于 742 ,
部分可育;3株发育迟缓 ,株高 80 ～ 113 cm ,没出
现分枝 ,在叶腋处直接着生花蕾 ,且花粉量极少 ,
不育(图 1K)。
　　A , E.742;D , G.诸葛菜 O.violaceus;B ,C , F , H , J.742×诸葛菜 F1 　742×O.vio laceus F1;I.湘油 15 ×诸葛菜 F1 　Xiangyou 15
× O.violaceus F1;K.(742×诸葛菜)×742(BC1)　(742×O.v iolaceus)×742(BC1);L.湘油 15 ×诸葛菜F2 　Xiangyou15×O.v io-
laceus F2
图 1　甘蓝型油菜×诸葛菜杂种植株的形态特征
Fig.1　Morphology of some intergeneric hybrid plants of B.napus× O.violaceus
图 2　F1 可育和不育花粉粒
Fig.2　Fertile and sterile pollens in F1
·73·3 期　　　　　　　　　　王爱云等:甘蓝型油菜和诸葛菜属间杂种的获得及其特性
2.3　微卫星引物 Na10-G05分析
55 对微卫星引物多态性分析表明 , 引物
Na10-G05对父本能够扩增出 900 bp 和 350 bp
条带 ,对母本却能扩增出 350 bp和 175 bp条带 ,
能够用于 F1 杂种植株真假鉴定 。在 63株 F 1 植
株中 ,形态学鉴定初步确定为杂种的 18株植株能
够扩增出 900 bp 、350 bp和 175 bp三种条带(图
3),因此 ,这些 F 1植株是真杂种。
1.742;2.诸葛菜　O.violaceus;3～ 17.742×诸葛菜 F1　742×O.violaceus F1 ;M.DNA marker I
图 3　 SSR引物 Na10-G05 在亲本和其 F1 中的扩增结果
Fig.3　Amplified results of parents and their F1 with SSR primer Na10-G05
3　讨论
芸薹属栽培种和近缘种之间的远缘杂交是将
优良性状导入栽培植物 、合成雄性不育系的重要
方法之一[ 17] ,但由于存在杂交障碍 ,一般不易获
得成功。其成功率的高低依赖于二者亲缘关系的
远近[ 18] 。为了获得杂种 ,首先必须确认障碍发生
的时期 ,然后确定克服障碍的有效方法 。据报道 ,
甘蓝型油菜和诸葛菜杂交存在明显的不亲和
性[ 19] 。在本研究中 ,笔者同样也证明了二者存在
受精后不亲和现象。
胚挽救技术能够用来克服受精后不亲和现象
的发生 ,提高杂交成功率 ,因而极大地扩大了远缘
杂交的范围。油菜育种工作者利用该技术已将近
缘种野生植物的许多优良性状导入了栽培作
物[ 1-3 , 7] 。在本研究中 ,自然条件下没有获得任何
杂交种子 ,而通过子房培养获得了 14 粒杂种 ,因
此 ,子房培养能够提高杂种获得频率 ,这与其他报
道一致[ 20-23] 。
在本研究中 ,甘蓝型油菜和诸葛菜的杂交结
实率非常低 ,且不同的杂交组合的结实率存在明
显差异。不同基因型也许导致了基因组之间亲和
力不同[ 1 , 3 , 19 , 24 ] 。据报道[ 1] ,在甘蓝型油菜和诸葛
菜杂交中 ,尽管运用胚挽救技术 ,也仅仅三种基因
型甘蓝型油菜(奥罗 ,华优 8 号和 GR144-149)与
诸葛菜表现亲和 ,而另外的 4个品种与诸葛菜以
及以诸葛菜为母本的所有反交组合均表现不亲
和。本研究也得到了相似结果 。由 742×诸葛菜
和湘油 15×诸葛菜两个杂交组合获得了杂种 ,而
681A 与诸葛菜表现不亲和 ,没有产生杂种。所有
的反交组合都没有获得成功 ,也许是由于甘蓝型
油菜和诸葛菜之间存在严重的单向不亲和性 。如
此的单向不亲和现象在芸薹族其他作物的远缘杂
交中普遍存在[ 23 , 25] 。因此 ,在远缘杂交中 ,选择
适合亲本和杂交方向对于提高杂交成功率具有非
常重要的意义 。
鉴定远缘杂种真假 ,通常采用形态学 、细胞
学 、同工酶和 DNA 分子标记等技术 。本试验采
用形态学和分子标记技术对所获得的 F1 代植株
进行了杂种真假鉴定 ,18株为真杂种。在这些杂
种植株中 ,大部分性状相似于母本(甘蓝型油菜)。
这进一步证明了杂种中具甘蓝型油菜染色体的细
胞较多 ,而具诸葛菜染色体的细胞相对较少[ 2] 。
由 742×诸葛菜获得的杂种表现完全的雄性不
育 ,乳白色花瓣 ,较少的一次分枝且分枝位置较
高 ,这些现象与文献[ 1]报道不一致 ,是否是由不
同的染色体组成所致 ,还有待进一步研究。
由于染色体的不均等分配和异常的染色体行
为;或者是由于外来 DNA 片段的插入 ,干扰控制
花粉发育基因的正常功能发挥[ 26] ;多极分裂 ,导
致一个孢母细胞产生不同大小的微核[ 27] ,这些造
成遗传物质不平衡的因素均有助于花粉不育 。在
本研究中 ,究竟是何原因导致花粉育性降低甚至
完全不育有待于进一步深入研究。
在本研究中 ,来自于 742×诸葛菜的杂种植
株在苗期叶柄和叶脉呈现紫色 ,相似于诸葛菜 ,而
在后期生长的叶片呈现正常绿色。这或许是由于
在苗期叶柄和叶脉处叶绿素的合成受到抑制 ,控
制紫色性状的基因表达 ,而在生长后期 ,随着诸葛
菜染色体在体细胞中部分或全部消减从而导致正
常绿色表现。这也许能够作为甘蓝型油菜与诸葛
菜的杂种后代中存在染色体消减现象的一个间接
·74· 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　19 卷
证据 。李等在芜菁和诸葛菜杂交中发现 , A 基因
组在杂种染色体消减中起主要作用[ 3] 。在甘蓝型
油菜和诸葛菜杂交中也许也是由于 A 基因组的
作用 ,从而使诸葛菜的遗传物质难以导入甘蓝型
油菜中。
尽管前人对于甘蓝型油菜和诸葛菜杂交作了
深入研究 ,但本研究中获得的这种具高位分枝和
乳白色花瓣且雄性不育的杂种至今还未见报道。
本试验获得的杂种植株既可作为甘蓝型油菜遗传
改良的桥梁品种 ,也可作为基因组结构研究材料。
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·75·3 期　　　　　　　　　　王爱云等:甘蓝型油菜和诸葛菜属间杂种的获得及其特性