全 文 ：第 27卷第 2期 江 西 农 业 大 学 学 报 Vo.l 27, No. 2
2005年 4月 Acta Ag ricu lturae Unive rsitatis Jiangx iensis A pr. , 2005
文章编号:1000 - 2286(2005)02 - 0166 -06
七叶树属种和种群的遗传
多样性及遗传分化研究
费学谦1 ,丁 明 1 ,周志春 1 ,张 萍 1 ,江志标 2
　　(1. 中国林业科学研究院 亚热带林业研究所 , 浙江 富阳 311400;2. 浙江省桐庐县林业科技推广中心 , 浙江 桐庐
311500)
摘要:利用 RAPD标记对七叶树属 7个种 14个种群的遗传多样性和遗传分化进行了研究。 结果显示:七叶树
DNA提取以刚萌发的幼叶为佳 ,随着叶的生长 ,多糖干扰增加 , 成熟叶不适合基因组 DNA提取。七叶树属种
和种群之间基因多样性差异很大。在国产七叶树中 , 以陕西勉县中华七叶树种群和湖南新宁天师栗种群的基
因多样性最高 , 达 0. 261 3;甘肃康县中华七叶树种群和四川苍旺天师栗种群的基因多样性最低 , 分别为
0. 189 2和 0. 196 0。研究发现 ,除红花七叶树外 ,北美产的其它七叶树的基因多样性远低于国产七叶树 , 其中
以欧洲七叶树的基因多样性最小 , 仅为 0. 124 1。由于种群偏小 , 加之长期地理隔离 , 七叶树属种和种群间遗传
分化巨大 ,种和种群间的遗传变异高达 42. 21%。聚类结果可将天师栗分为中南部种群和北部种群两组 , 其北
部种群与中华七叶树和浙江七叶树遗传距离较近。北美七叶树中红花七叶树与天师栗的中南部种群亲缘关系
较近 ,而欧洲七叶树 、黄花七叶树和光叶七叶树相互之间以及与 3种国产七叶树间的亲缘地理较远。
关键词:七叶树属;RAPD;遗传多样性;遗传分化
中图分类号:S759. 82　　文献标识码:A
Stud ies on Genetic D iversity and D ifferentiation of
Species and Populations in Aesculus
FEI Xue - qian
1 , DING M ing1
ZHOU Zhi - chun
1 , ZHANG P ing1 , JIANG Zhi - biao2
　　(1. The Resea rch Institu te o f Subtropical Forestry, CAF, Fuyang 311400, China;2. The Extending Cen-
ter for Fo restry S＆ T of Tong lu County, Tong lu 311500, China)
　　Abstrac t:Gene tic d iversity and differen tia tion o f7 species including 14 populations ofAescu luswe re stud-
ied. Resu lts are as fo llow ing:Conside ring the interruption of polysacoharide during the gow th of leaves, the
ge rm ination pe riod of young leaves is optimum opportunity to ex tract DNA. S tudies indicated tha t there stands
significant gene tic d iversity of species and population inVescu lus, In native Vescu lus, the g reat genetic diversity
lies in the popu lations of Aesculus chinensis Bunge inM ianx ian, Shanx i Prov ince and A. w ilson ii Rehd in X in-
ning, Hunan Prov ince, which arrives at 0. 261 3, contrast to Aescu lus chinensis Bunge in Kanxian, G anshu
Prov ince and A. wilsonii Rehd in Cangw ang, Sichuan Prov ince, whose gene tic dive rsity is the low es.t The
stud ies also found tha t the genetic diversity o f Vesculus in no rth America is dramatically low e r than that o f n-
ative Vesculus, besidesA. pavia L. . Taking into account the factors of geographical isolation and sma ll population,
收稿日期:2004 - 10 - 09
基金项目:948项目(2001 - 11), 浙江省自然科学基金项目(302085)和浙江省科技厅项目资助
作者简介:费学谦(1953 -), 男 ,副研究员 , 主要从事林业科学研究。
DOI牶牨牥牣牨牫牳牫牰牤j牣j jau牣牪牥牥牭牥牫牴
第 2期 费学谦等:七叶树属种和种群的遗传多样性及遗传分化研究
the tremendous genetic differentiation ex ists in Vescu lus reach 42. 21%. C lustering analysis divides A. wilsonii
Rehd into tw o g roups:The south popu lation and north popula tion wh ich has ad jacent genetic distancew ith Aes-
culus chinensis Bunge and A. chinensis var. chekiangensis(Hu et Fang) Fang s. A. pavia L has c lose genetic
re lation w ith A. w ilsonii Rehd population in the m iddle and sou th Ch ina, andA. hippocastanum L, A. octandra
M arsh , A. glabra var. W illd have distan t geograph ica l rela tion.
Key words:Aesculus;RAPD;gene tic dive rsity;genetic differen tia tionn
七叶树属(Aesculus)树种主要分布在亚洲 、欧洲和美洲 ,有 30余种 ,原产我国的有 10余种 ,以西南
亚热带地区为分布中心 ,北达黄河流域的陕西 、甘肃 、河北 、河南 ,东至江苏 、浙江 ,南到云南 、广西及广东
北部[ 1] 。七叶树既是著名的观赏树种 ,又是重要的药用树种 ,其种子即为中药娑罗子。近 20年来 ,随着
七叶树三萜皂苷成分七叶皂苷被用作治疗血液循环障碍和水肿的良药 ,七叶树资源的开发利用日益受
到人们的重视。
虽然七叶树栽培范围较广 ,但各地均呈零星分布状态 ,种群较小 。由于长期的隔离 ,形态特征和经
济性状相差较大 ,形成了不同的种和种源 。随机多态性 DNA(Random Amp lified Po lymo rphic DNA ,
RAPD)技术是近 10年来发展起来的研究系统进化 、分类等的有效工具 ,并广泛应用于遗传多样性检
测 ,遗传图谱构建等领域 [ 2 ～ 4] 。本文利用该项技术 ,对不同来源的七叶树属种和种源进行 DNA指纹图
谱分析 ,探讨相互之间在遗传进化中的关系 ,以便为七叶树属遗传资源的发掘整理和开发利用提供理论
依据。
1　材料与方法
1. 1　样品采集
供试的国产七叶树种子采自 9个产地 。中华七叶树 (Aesculus chinensis Bunge):甘肃康县和陕西勉
县;浙江七叶树(A. chinensis va r. chek iangensis(Hu et Fang)Fang):浙江临安;天师栗 (A. w ilson ii Rehd):
河南西峡 、湖北房县 、湖南桑植和新宁 、四川苍旺和马边 。根据种源试验的要求 ,每个种群各选 15株以
上样株 (甘肃康县种群除外 ,仅从少数几株树木上采种),采集自然成熟的混合种子约 10 ～ 15 kg。红花
七叶树 (A. pavia L, TN)、光叶七叶树 (A. g labra var. W illd, TN)、黄花七叶树 (A. octandraM arsh, M I)和
欧洲七叶树 (A. h ippocastanum L, NY)引种自北美 (每树种种子数量 50 kg)。将所有种子育苗 ,于次年
春每树种和种源随机采集 12个不同单株的嫩叶用于 DNA提取 。
1. 2　DNA提取
新鲜嫩叶 4 g,采用 CTAB法提取 DNA[ 5] ,用紫外分光光度计 OD 280处测 DNA浓度 ,以 OD260 O/ D 280
值和琼脂糖凝胶电泳法确定 DNA的纯度。提取的材料优选从 2004年 3月 16日开始 ,每隔 20 d左右 ,
对浙江临安 、陕西勉县 、河南西峡 、湖南新宁 4个种源随机采集 1个单株的叶样 ,进行 DNA提取及浓度
和纯度检测 ,取平均值 。
1. 3　RAPD反应条件
随机引物和琼脂糖购自上海生物工程公司 (Sangon), Taq酶 、dNTP、反应缓冲液及标准 DNA均购自
上海华美生物工程公司。扩增反应在 JTC - 100基因扩增仪上进行。 RAPD扩增反应条件为:94 ℃预
变性 3 m in;然后进入 45个循环 ,每个循环 94℃变性 30 s, 37 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 2m in;循环完成
后 ,为保证 DNA延伸充分 ,再 72 ℃延伸 7 m in;最后于 4 ℃下保存。通过优化反应系统和扩增条件试
验 ,最终确定 20μL反应体系:10倍反应缓冲液 2 μL(100 mo l /L T ris - HC l, pH9. 0;500mo l /L KC l,
15 mo l /LM gC l, 0. 01%明胶 , 5. 0 g /L BSA), Taq聚合酶 1 U , dNTP 1. 75 mo l /L, Mg2+浓度 2. 5 mol /L,
DNA模板 50 ng,引物浓度 0. 4 μmo l /L。扩增产物经 1. 5%琼脂糖凝胶电泳分离 ,溴分乙淀染色 ,再用
FR - 200电泳凝胶呈像系统拍照记录结果。
对来自不同种群 ,随机选取其中 1株的 DNA模板 ,使用 S1 ～ S500的 120个 10 bp随机引物进行扩
增 ,从中筛选出 16个谱带清晰 、多态性强 、稳定性好的引物 ,用于七叶树的 RAPD扩增 。
1. 4　数据处理及分析
167
　江 西 农 业 大 学 学 报 第 27卷
图 1　引物 S243对部分七叶树群体的 RAPD扩增结果
F ig. 1　RAPD amp lified fragments of partAesculus popu la tions by prim e r S344
　　用 FR -200型获取扩增产物电泳图谱后 ,以分子标准 200 bp梯度 Marker推算出各条带的分子量 ,
分别对图谱中同样分子量条带进行有(1)或无 (0)的记载。将获得的原始数据用 PROGENE1. 31软件
进行统计分析。
2　结果与分析
2. 1　取样时间对模板 DNA质量的影响
表 1显示了采用 CTAB法对 4个种源幼苗不同生长时期叶片基因组 DNA的提取结果 。从中可以
清楚地看出 ,叶片的幼嫩程度对 DNA的质量有着决定性的影响 ,选用 4月 5日以前的幼叶 ,在提取 、有
机溶剂沉淀后结团较小 ,但 DNA浓度 、纯度俱佳 ,其 OD 260 O/ D280值均在 1. 8 ～ 2. 0之间 ,琼脂糖凝胶电
泳呈单条明亮的谱带 。而随着叶片的生长 ,虽然提取的沉淀物显著增多 ,但 OD 值却急剧下降 , 4月 26
日和 5月 20日分别比 3月 16日下降了 1. 66倍和 7. 23倍 ,且 OD 260 O/ D 280值也显著下降 。紫外扫描图
显示 OD260和 OD 280处均无明显吸收峰 ,表明提取出的沉淀中 DNA含量很低 ,且干扰物质不是蛋白质 。 5
月 20日以后已无法用电泳检测到明显的 DNA谱带。经苯酚 -硫酸法 [ 6]测定 ,沉淀物的主要成分为多
糖 。扩增试验证明 , 4月 26日前后取样提取的 DNA虽然纯度已经不高 ,仍然可以用于 RAPD扩增 ,但 5
月 20日以后由于叶片淀粉等储藏物质的积累 ,常规方法已不能获得高质量的 DNA。即使采用特殊的
去除多糖的步骤 [ 7, 8] ,纯度也增加无几。
表 1　取样时间对 DNA效果的影响
Tab. 1　 In fluence of samp ling tim e on DNA ex trac tion
采样时间 /月 -日 生长状态 平均 OD260 平均 OD280 平均 OD260 O/ D280
03 - 16 味未完全展开 1. 126 9 0. 591 1 1. 91
04 - 05 部分叶红色 , 已展开 0. 987 8 00. 535 1 1. 84
04 - 26 成年叶 ,绿色 0. 422 7 0. 259 1 1. 63
05 - 20 成年叶 , 已封顶 0. 139 0 0. 120 9 1. 15
2. 2　七叶树属种和种群 RAPD扩增结果
用 16个引物对来自 13个七叶树种和种群 156个体共扩增出 99条 DNA片段 ,片段大小分布在 200
～ 2 200 bp间 。在检测的 99个位点中 , 84个位点呈多态性 ,多态性比例为 84. 85%,明显高于栗属[ 9]
(Castaneam ill. )77. 0%、木麻黄 [ 10] (Casuarina equisetifolia L. )46. 09%和南方红豆杉[ 11] (Taxusmairei)
51%的多态性比例 (表 2)。扩增结果发现 ,各引物检测到 RAPD位点数介于 5 ～ 9之间 ,每引物平均提
供的 RAPD标记信息量超过 6个 ,多态位点多少不等 ,其中 S372扩增出的 9个位点中有 8个为多态性
位点 ,而 S123和 S324所有位点都呈多态性 。图 1给出了引物 S243的 RAPD扩增产物在部分七叶树植
株样品中的分离情况 。
2. 3　七叶树属种和种群的遗传分化
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第 2期 费学谦等:七叶树属种和种群的遗传多样性及遗传分化研究
从表 3可见 ,七叶树属种和种群间的多态性位点比例差异很大 ,平均为 49. 23%。湖南新宁天师栗
种群和陕西勉县中华七叶树种群的多态性位点比例分别高达 65. 66%和 60. 61%,而甘肃康县中华七叶
树种群仅为 43. 43%。除红花七叶树外 ,北美产七叶树的多态性位点比例都较低 ,均在 40%以下 ,尤以
欧洲七叶树最低 ,其多态性位点比例为 31. 31%,不及湖南新宁天师栗种群的一半。从基因多样性和
Shannon表型指数平均值(分别为 0. 362和 0. 525 9)来看 ,七叶树属植物的遗传多样性较高 ,但不同种
和种群间基因多样性相差很大 。不同树种间的比较发现 ,国产七叶树的基因多样性远高于北美产七叶
树 。而在国产七叶树中 ,陕西勉县中华七叶树种群 、湖南新宁 、湖北房县 、河南西峡和四川马边天师栗种
群的基因多样性较高 (0. 235 1 ～ 0. 261 3),而甘肃康县中华七叶树种群和四川苍旺天师栗种群的基因
多样性较低 (0. 189 2 ～ 0. 196 0),导致这一结果与七叶树种群大小有关 。基因多样性高的种群通常较
大 ,基因多样性低的种群一般较小。在北美产的 4种七叶树中 ,红花七叶树的基因多样性相对较高 ,达
0. 204 1,而欧洲七叶树 、光叶七叶树和黄花七叶树的基因多样性则很低 ,如欧洲七叶树的基因多样性的
测定值仅为 0. 124 1,这与欧洲七叶树作为北美的长期引种栽培种以及遗传基础窄有关 。
估算种群间的基因分化系数(G st)可以区分种群间和种群内的相对遗传变异大小 ,揭示物种遗传变
表 2　16个 RAPD引物对七叶树属种和种群 DNA模板的扩增结果
Tab. 2　Amplificat ion re su lts of spec ie s and popu lat ion s in Aescu lus by 16 RAPD prim ers
引物 序列 5’ ～ 3’ 位点总数 多态位点数 引物 、序列(5’ ～ 3’ ) 位点总数 多态位点数
S32 TCGGCGATAG 8 6 S324 AGGCTGTGCT 6 6
S102 TCGGACGTGA 5 4 S344 CCGAACACGG 5 4
S103 AGACGTCCAC 5 4 S366 CACCTTTCCC 7 6
S123 CCTGATCACC 5 5 S372 TGGCCCTCAC 9 8
S158 GGACTGCAGA 6 5 S422 ACCAGGGGCA 6 5
S164 CCGCCTAGTC 7 6 S452 CAGTGCTGTG 5 4
S234 AGATCCCGCC 6 5 S464 GTGTCTCAGG 6 5
S238 TGGTGGCGTT 7 6 S484 AGTGCGCTCA 6 5
合计 99 84
表 3　13个七叶树属种和种群的基因多样性参数
Tab. 3　Genetic d iversities of 13 spec ies and popu lation s in Aescu lus
种 (种源) 多态性位点数 多态性位点比例
/%
Ne i’ s(1973)
基因多样性
Shannon
表型指数
中华七叶树(陕西勉县) 60 60. 61 0. 261 3 0. 374 2
中华七叶树(甘肃康县) 43 43. 43 0. 189 2 0. 270 5
浙江七叶树(浙江临安) 53 53. 54 0. 222 5 0. 321 7
天师栗 (河南西峡) 57 57. 58 0. 240 0 0. 346 8
天师栗 (湖北房县) 56 56. 57 0. 241 2 0. 347 7
天师栗 (湖南桑植) 47 47. 47 0. 208 3 0. 298 0
天师栗 (湖南新宁) 65 65. 66 0. 261 3 0. 381 1
天师栗 (四川苍旺) 46 46. 46 0. 196 0 0. 281 4
天师栗 (四川马边) 53 53. 54 0. 235 1 0. 335 8
红花七叶树(TN, USA) 52 52. 53 0. 204 1 0. 298 9
光叶七叶树(TN, USA) 39 39. 39 0. 164 3 0. 238 0
黄花七叶树(M I, USA) 38 38. 38 0. 174 0 0. 247 2
欧洲七叶树(NY, USA) 31 31. 31 0. 124 1 0. 181 7
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　江 西 农 业 大 学 学 报 第 27卷
图 2　13个七叶树属种和种群的 UPGMA聚类图
F ig. 2　Dend rogram gene ra ted by the UPGMA cluster
ana lysis from 13 species o r population in Aesculus
异的主要来源[ 12] 。表 4的基因分化系数估算结果显示 ,有 42. 21%的遗传变异存在于七叶树属种和种
群间 ,而七叶树属种群内的遗传变异只占 57. 79%。与我国木荷 [ 13] 、枫香 [ 14]等广布性树种以及马褂
木 [ 15]等呈星散片断分布的树种比较 ,七叶树属植物的遗传变异较多地存在于种和种群间 ,而种群内的
遗传变异则相对较小 ,这与七叶树种群偏小 、种群间长期地理隔离有关 。
表 4　七叶树属种和种源的遗传分化系数
Tab. 4　Gene tic d ifferen tiation coeffic ients am ong spec ies and popu lation s in Aescu lus
指标 有效等位基因(Ne)
基因多样性
(H e)
Shannon
表型指数( I)
总的种源基因
多样性(H t)
种源内基因
多样性(H s)
种源间基因
分化系数(Gst)
平均数 1. 654 9 0. 362 1 0. 525 6 0. 362 3 0. 209 3 0. 422 1
标准差 0. 345 0 0. 165 7 0. 220 8 0. 027 4 0. 014 6
2. 4　七叶树属种和种源的亲缘地理和分子聚类
基于 Nei’ s(1979)非偏差遗传距离的估算 ,并采用 UPMGA聚类法得出七叶树属种和种群的聚类树
状图。图 2的树状图显示 ,天师栗可明显地分成两组:一组为中南部的种群 ,包括湖南桑植 、新宁 、四川
苍旺和马边 ,其种群间的亲缘关系较近 ,如四川苍旺和马边种群的分子遗传距离仅为 0. 077 1,湖南桑
植和新宁种群间的遗传距离也只有 0. 117 8;另一组为包括湖北房县和河南西峡两个北部的天师栗种
群 ,这两个种群在地理上相距很近 ,其间的遗传距离也很小 ,为 0. 109 0。从中还发现 ,天师栗的北部种
群与中华七叶树和浙江七叶树的亲缘关系较近 ,而与天师栗中南部种群存在显著的遗传分化 ,遗传距离
较远。在树木分类上 ,浙
江七叶树为中华七叶树的
变种 ,但聚类结果发现 ,浙
江七叶树 (浙江临安 )和
中华七叶树 (陕西勉县 )
在 DNA分子水平上的关
系较近而难以区分 ,其间
的分子遗传距离为 0.
107 8,仅相当于湖北房县
和河南西峡两个在地域上
相邻的北部天师栗种群间
的遗传距离 。甘肃康县的
中华七叶树种群在地域上
与陕西勉县种群相邻 ,从
理论上讲 ,两者应归为一
类 ,但在聚类图中甘肃康
县中华七叶树种群却与天
师栗中南部种群划归一
类 。究其原因 ,可能与甘
肃康县中华七叶树种群所
取样本较小有关 ,这可从
该种群具有较小的基因多样性得到证实(表 2)。
从聚类树状图还可以看出 ,红花七叶树虽然产自北美 ,但与国产天师栗中南部种群的亲缘关系较
近 ,而北美产的光叶七叶树 、黄花七叶树和欧洲七叶树与 3种国产七叶树的地理亲缘关系较远 ,其间互
为独立 ,遗传分化巨大 。
170
第 2期 费学谦等:七叶树属种和种群的遗传多样性及遗传分化研究
3　讨论和结论
七叶树新叶生长初期 DNA提取效果良好 ,随着叶片的生长 ,积累的多糖类物质逐渐增多 ,导致提取
的 DNA质量明显下降 。由于多糖类物质的去除程序繁琐 ,耗时 ,耗试剂 ,且效果不理想 ,七叶树叶中
DNA的提取应尽量取幼叶 ,避免使用成熟叶。因七叶树一般每年多只抽梢 1次 ,掌握合适的采样时间
非常重要。在浙江地区 ,样品采集时间应不迟于 4月底 ,不同气候区可根据生长情况确定采样时间。
相传佛祖释加摩尼诞生并圆寂在七叶树下 ,因此七叶树古时作为佛门三宝树之一而披上神秘色彩。
诸如中华七叶树 、浙江七叶树和印度七叶树等多人工栽培 ,而常见于寺庙周围 ,如浙江杭州的灵隐寺周
边就种有较多的浙江七叶树古树。七叶树属植物的天然种群和人工栽培种群体都较小 ,一般在数株至
数百株之间 ,这些种群在历史上还长期隔离。本文利用 RAPD分子标记研究发现 ,七叶树属种和种群间
遗传分化巨大 ,种和种群间的遗传变异高达 42. 21%,而种群内的遗传变异仅占 57. 79%,远低于其它广
布性和呈片断化分布的树种[ 13 ～ 15] 。从基因多样性保护的角度 ,应较多地考虑从种群这一层次 ,加强对
多个不同种群遗传资源的维护和保育 。实验结果表明 ,国产七叶树的基因多样性显著地高于北美产的
4种七叶树 ,其中以欧洲七叶树的基因多样性最小 。北美产的欧洲七叶树是一种长期引种栽培树种 ,其
遗传基础较窄 ,而红花七叶树 、光叶七叶树和黄花七叶树在原产地也呈零星分布状态 ,缺乏基因交流 ,造
成了这种结果。
天师栗从遗传距离上可分为中南部种群和北部种群 ,其中北部种群与中华七叶树及其变种浙江七
叶树的遗传距离较近 。而北美产的红花七叶树与天师栗的中南部种群亲缘关系比较接近 ,其余 3个北
美产七叶树相互之间以及与国产七叶树间的亲缘地理均较远。由于本试验采样点七叶树均呈零星分
布 ,采样中有个别种群样本较小 、代表性不强的问题 ,甘肃康县中华七叶树种群在聚类分析中与天师栗
南部种群归为一类 ,可能就是这个原因造成的 ,因此在今后的工作中更系统的加强遗传进化关系分析是
必要的 。
致谢:在七叶树属种和种群的试验种子采集和育苗过程中得到中国林科院亚林所金国庆 、饶龙兵 、刘昭息 、栾启
福 , 浙江省桐庐县林业局张均民 、天云生 、陈忠良 、四川省林科院郭红英 、国家林业局泡桐中心庞辉等的帮助和支持 ,致此
谢忱。
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