全 文 ：园　艺　学　报　2006, 33 (5):1141 ～ 1144
Ac taH or ticu ltu rae S inica
收稿日期:2005 - 11 - 18;修回日期:2006 - 05 -29
基金项目:国家自然科学基金项目 (30160074);云南省科学基金重点项目 (2002C0003P)
*通讯作者 Au thor for correspondence (E-m ail: heyueqiu@ tom. com)
云南野生兰属主要种间亲缘关系的 AFLP分析
张俊祥 1　李枝林 2　范成明 1　程少丽1　赵明富1　何月秋 1*
(1云南农业大学植物保护学院 , 云南昆明 650201;2云南农业大学园林园艺学院 , 云南昆明 650201)
摘　要:采用 AFLP技术对云南省兰属的 14个种和 3个变种中的 38份样本进行了亲缘关系分析 。 16
对 AFLP引物扩增的条带聚类结果表明 , 云南省国兰遗传多样性非常广泛 , 相同品种间的不同个体扩增出
的条带模式相差很大。依据 AFLP数据 , 在相似系数 0.58的水平下 , 38个兰花样品分成 3组:莲瓣兰 、 春
剑 、 惠兰 、 寒兰分为第 1组 , 建兰 、 豆瓣兰 、 春兰 , 墨兰 、 虎头兰 、 西藏虎头兰 、 大雪兰 、 碧玉兰 、 文山
红柱兰 、 长叶兰和兔耳兰分为第 2组 , 送春和蜜蜂兰分为第 3组。
关键词:兰属;AFLP;遗传多样性;亲缘关系
中图分类号:S 682.31　　文献标识码:A　　文章编号:0513-353X (2006) 05-1141-04
Phylogenetics Analysis of the Ch inese O rch ids in Yunnan Province Using
AFLP Technique
Zhang Junxiang
1 , Li Zhilin2 , Fan Chengm ing1 , Cheng Shao li1 , ZhaoM ingfu1 , andHe Yueqiu1*
(1College of P lant Protection , Yunnan Agricu ltural University, Kunm ing, Yunnan 650201, China;2College of Gardening and
Horticulture, Yunnan Agricultura lUniversity, Kunm ing, Yunnan 650201, Ch ina)
Abstract:Thirty-eight co llections o f Chinese o rchids in Yunnan Province, China, including 14 species
and 3 varie ties, were ana lyzed phy logene tica lly using AFLP technique. PCR amplifica tion band pattern w ith
16 pairs o f primers ind ica ted tha t the Ch inese orchids we re ve ry dive rse, and individuals of the same species
had different band patterns. SubgenusJensoa appeared as a paraphy letic group. SubgenusCyperorchiswas no t
a monophy le tic group instead formed an offshoo t of subgenus Jensoa. A t a sim ilarity coe fficient o f 0.58, the
orchids could be clustered into 3 g roups:Cybid ium tortisepa lum Wu et Chen, C. tortisepa lum va r. longi-
bractea tum , C. faberi andC. kancan be longed to G roup 1;C. ensifolium , C. goering ii var. serratum , C.
goeringii, C. sinense, C. hookerianum , C. tracyanum , C. mastersii, C. low ianum , C. wenshanense,
C. ery thraeum andC. lancifolium to G roup 2;C. cyperifolium var. szechuan icum andC. pum ilum to G roup
3.
Key words:Cybidium;AFLP;G ene tic dive rsity;Phy logene tic re lationship
1　目的 、 材料与方法
本研究以云南野生兰花为材料进行 AFLP分析 , 旨在揭示其主要种间亲缘关系 , 为其育种和系统
发育研究提供理论依据。 38个供试样品包括 14个种和 3个变种 (表 2), 引种栽培于云南农业大学园
林园艺学院温室兰花圃中。 DNA的提取采用 CTAB法。 AFLP分析采用 Vos等 〔1〕建立的方法。利用
Mse I和 EcoR I酶切组合进行基因组限制性酶切 。所用的接头和引物见表 1 (上海生工)。针对M se I
和 EcoR I酶的接头 , 共用 16对引物进行选择性扩增。扩增后采用 4%聚丙烯酰胺凝胶和 B io-Rad电
泳设备 , 在 80W下电泳 1.5 ～ 2.0 h , 银染后于灯光下计数扩增的条带 , 并构成 0和 1数据矩阵表。
用 UPGMA方法进行聚类分析 , 采用 Pe rcen t disag reemen t方法得到聚类分析图。
DOI牶牨牥牣牨牰牬牪牥牤j牣issn牣牥牭牨牫牠牫牭牫x牣牪牥牥牰牣牥牭牣牥牭牪
园　　艺　　学　　报 33卷
表 1　DNA接头和 AFLP引物的核苷酸序列
Table 1　DNA sequences of adapters and prim ers
M se I接头和引物
Adap ter and p rimer
核苷酸序列
Nucleotide
EcoR I接头和引物
Adap ter and p rim er
核苷酸序列
Nucleotide
M se I接头 M se I adap ter 5-GACGATGAGTCCTGAG-3 EcoR I接头 E coR I ad apter 5-CTCGTAGACTGCGTACC-3
M se I引物 Mse I p rim er 3-TACTCAGGACTGAT-5 EcoR I引物 E coR I p rim er 3-CTGACGCATGGTTAA-5
92H18 5-GATGAGTCCTGAGTAA A-3 92R12 5-GACTGCGTACCAATTC C-3
92G41 5-GATGAGTCCTGAGTAA TTA-3 93B12 5-GACTGCGTACCAATTC AGG-3
92G18 5-GATGAGTCCTGAGTAA GCT-3 92S07 5-GACTGCGTACCAATTC ATA-3
92G02 5-GATGAGTCCTGAGTAA AAC-3 92S03 5-GACTGCGTACCAATTC AAG-3
92G43 5-GATGAGTCCTGAGTAA TTC-3 92S02 5-GACTGCGTACCAATTC AAC-3
92G16 5-GATGAGTCCTGAGTAA GGT-3 92S04 5-GACTGCGTACCAATTC AAT-3
92G37 5-GATGAGTCCTGAGTAA TGT-3 93B14 5-GACTGCGTACCAATTC CAC-3
92F37 5-GATGAGTCCTGAGTAA AAA-3 92S09 5-GACTGCGTACCAATTC GAA-3
92F39 5-GATGAGTCCTGAGTAA CCA-3 93B11 5-GACTGCGTACCAATTC ACC-3
92G35 5-GATGAGTCCTGAGTAA TGG-3 92S10 5-GACTGCGTACCAATTC TAA-3
2　结果分析与讨论
2.1　种间遗传多样性
采用Mse I+3引物和 EcoR I+3引物各 9条 , 构成 16对引物进行选择性扩增 。各引物对均能扩
增出清晰的条带 (分布在 100 ～ 1 000 bp之间 ), 共计 851条带 , 平均每对引物扩增出 53.2条带。扩
增条带数最多的为引物对 92G43 /93B11, 扩增到 80条 , 最少的为引物对 92G18 /93B12和 92G37 /
92B12, 仅扩增出 28条带。各引物对扩增出的条带多态率非常高 , 平均多态率为 96.4%。不同的兰
花以及不同的样本间条带数不同 (表 2), 表明云南省兰花样品存在很高的遗传多样性 。
表 2　兰花名称 、 采集地点和扩增的条带数
Tab le 2　N am es, collection sites and num bers of ampl ified bands o fCymb id ium spp.
种类
Species
序号
Code
采集地
Co llect ion s ite
AFLP条带数
Num ber of
AFLP band
种类
Species
序号
Cod e
采集地
C ollection si te
AFLP条带数
Number of
AFLP b and
莲瓣兰 L144 昆明市 Kunm ing 433 蜜蜂兰 C. pum ilum Rolfe L74 保山市 Baoshan 494
C. tortisepa lum Wu et Chen L160 怒江州 Nu jiang 599 L194 文山州 W en shan 504
L168 怒江州 Nu jiang 584 豆瓣兰 C. goering ii L27 丽江市 Lijiang 296
春剑 C. tortisepa lum var. L38 大理市 D ali 575 var. serra tum W u e.t C hen L85 文山州 W en shan 329
long ibracteatum Wu et Chen L55 大理市 D ali 538 L87 文山州 W en shan 385
蕙兰 C. faberi Rolfe L88 大理市 D ali 503 长叶兰 L68 临沧市 Lin cang 298
L149 昆明市 Kunm ing 459 C. erythra eum Lind l L75 思茅市 S im ao 385
寒兰 C. kan can M ak ino L29 思茅市 S im ao 514 建兰 C. en sifo lium L46 思茅市 S im ao 392
L201 思茅市 S im ao 370 L49 思茅市 S im ao 403
西藏虎头兰 L19 临沧市 Lincang 236 墨兰 C. sinen seW illd L117-1 文山州 W en shan 309
C. tracyanum L. Castle L28 迪庆州 D iqing 291 L117-3 文山州 W en shan 302
送春 C. cyperifolium var. L123 文山州W en shan 393 碧玉兰 L6 文山州 W en shan 258
szechuan icum Wu et Chen L133 大理市 D ali 440 C. lowianum Rchb. f L71 思茅市 S im ao 290
L145 昆明市 Kunm ing 427 虎头兰 L9 大理市 Dali 238
大雪兰 C. m astersii Lind l L7 临沧市 Lincang 349 C. hookerianum Rchb. f L67 大理市 Dali 201
春兰 C. goering ii Rchb. .f L171 怒江州 Nu jiang 308 L83 思茅市 S im ao 172
L60 大理市 D ali 344 文山红柱兰 L118 文山州 W en shan 274
C. wenshanense. W u et L iu
L61 大理市 D ali 345 兔耳兰 C. lancifolium H ookL40 思茅市 S im ao 408
L62 大理市 D ali 330 L80 文山州 W en shan 317
2.2　AFLP聚类分析
从图 1可以看出 , 38个样品种间相似系数在 0.56 ～ 0.74之间 。依相似系数 0.58的水平 , 可以将
1142
　5期 张俊祥等:云南野生兰属主要种间亲缘关系的 AFLP分析　
38个兰花样品分成 3个组 。第 1组 (A):莲瓣兰
(L144, L160, L168)、 春剑 (L55, L38)、 惠兰
(L149, L88)、寒兰 (L29, L201);第 2组 (B)
依相似系数 0.64的水平分为两个亚组:第 1亚组
(B1) 包括建兰 (L46, L49)、 豆瓣兰 (L27,
L85 , L87)、 春兰 (L60, L61, L62, L171);第
2亚组 (B2)包括墨兰 (L117-3, L117-1)、虎头
兰 (L9, L83, L67)、西藏虎头兰 (L19, L28)、
大雪兰 (L7)、 碧玉兰 (L71 , L6)、 文山红柱兰
(L118)、 长叶兰 (L68, L75)、 兔耳兰 (L40,
L80);第 3组 (C):送春 (L123, L133, L145)
和蜜蜂兰 (L74, L194)。第 2组 (B)和第 3组
(C)在相似系数 0.58处聚为一类 , 所有样品在
相似系数 0.56处聚为一个整体。
目前 , 各研究者对其分类的结论不尽相
同 〔2, 3〕。现存的兰属分类系统是基于宏观形态学
性状 、 尤其是花粉块的数目以及唇瓣与蕊柱的愈
合程度而建立的 〔4〕。
图 1　38个兰属样品亲缘关系树状图
F ig. 1　Dendrogram of 38 samples ofCymbid ium based
on percent agreem ent s im ila rity
　　依据陈心启的形态分类方法 , 大花亚属与建兰亚属是一种平行关系〔2〕。孙彩云等〔5〕 , 文李等〔6〕
利用 RAPD技术分析认为建兰和墨兰的亲缘关系最近。叶庆生等 〔7〕利用同工酶和 SDS-PAGE技术分析
的结果与文李等基本相同 。梁红健等 〔8, 9〕用 RAPD技术和同工酶分析兰属 5个种 19个品种的亲缘关
系 , 认为寒兰和墨兰的亲缘关系较近 。张明永等利用核 DNA的 ITS技术研究发现大花亚属为一复系
群 , 建兰亚属为一并系群 , 但未能将大花亚属的大雪兰 、虎头兰 、西藏虎头兰 、长叶兰 、碧玉兰和文
山红柱兰聚类成同建兰亚属平等关系 , 而是将其聚类成为建兰亚属的一个内部支系 〔4〕。本研究将大
花亚属的虎头兰 、西藏虎头兰 、 长叶兰和碧玉兰所有样品聚为一类 , 也将其聚类成为建兰亚属的 1个
内部支系 (B2b), 寒兰和墨兰均属于第 2组 (B组 )亲缘关系较近 , 前者属于 B1a支系 , 后者属于
B2a支系。由于兰属在自然条件下 , 许多个体不是完全纯合的 〔10〕 , 本试验结果亦表明同一种下的不
同个体扩增出的 AFLP条带数差别较大 , 呈现出遗传多样性。由此看来 , 这些分类上的差异可能是因
不同研究者所用的样本不同所致。
莲瓣兰 、送春和春剑是兰属中广为栽培但颇有争议的分类群 〔11〕。吴应祥等将春剑和莲瓣兰划入
春兰种下的变种 (C. goeringii va r. longibracteatum)〔12〕。鉴于春兰叶的下部有关节 , 花序通常只具 1
朵花 , 春剑与莲瓣兰叶的下部无关节 , 花序通常具 3 ～ 5朵花 , 陈心启等又将春剑与莲瓣兰从春兰中
划出来作为莲瓣兰下的两个变种〔11〕。作者的 AFLP聚类结果表明 , 莲瓣兰和春剑亲缘关系较近 , 都被
聚类到第 1组的 A1分支中 , 而这个分支与被划分到 B2b分支内部的春兰相距较远 , 我们的 RAPD结
果也表明莲瓣兰和春剑亲缘关系最近 , 与春兰亲缘关系较远 , 支持陈心启等的形态分类结果 〔11〕。 Du
Puy等〔13〕认为送春与莎叶兰 (C. cyperifolium)更为相似 。陈心启等比较了送春 、 蕙兰和莎叶兰的形
态特征 , 认为送春明显接近莎叶兰 , 而不是蕙兰下的 1个变种 , 将其移入莎叶兰下作为 1个变种
(C. cyperifolium var. szechuanicum)〔11〕。本研究结果表明送春 (图 1的 C1支系 )与蕙兰 (图 1的 A
组 )亲缘关系较远 , 送春不应是蕙兰下的 1个变种 , 但我们没有收集到莎叶兰 , 故送春是否属于莎
叶兰的 1个变种 , 还有待今后进一步证实 。
豆瓣兰叶片宽度较春兰窄 , 通常不具有春兰的香气 , 其他性状与春兰基本相同 。陈心启将豆瓣兰
作为春兰的变种 。本研究将它们聚类到 B1b分枝 , 即两者在 DNA水平上的亲缘关系亦很近 。陈心启
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园　　艺　　学　　报 33卷
将兔耳兰归于建兰亚属的宽叶组 , 而吴应祥将兔耳兰定为一个独立的组 〔3〕。王慧中等用 RAPD技术
分析的结果表明 , 兔耳兰与大花亚属材料属于同一组 , 但 AFLP技术分析的结果则表明兔耳兰与建兰
亚属并在同一组 〔14〕。张明永等分析兰属 27个种 、 3个栽培品种的 DNA ITS区段序列 , 其中兔耳兰的
结果支持吴应祥的结果〔3〕。本试验 AFLP结果与王慧中的 RAPD结果一致 , 即兔耳兰与大花亚属亲缘
关系更近 , 被划分到 B2分枝内。由此看来 , 兔耳兰的系统分类定位还有待于采用更多样本做进一步
确证。
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