全 文 ：2008年 3月
2008, 30(1):35 -39
中国油料作物学报
Chinesejournalofoilcropsciences
芥菜型油菜与诸葛菜属间杂种的获得及鉴定
王爱云 1 , 李　栒2 , 胡大有 3
(1.中南林业科技大学生命科学与技术学院 , 湖南 长沙 410004;2.湖南农业大学 ,
湖南 长沙 410128;3.益阳职业技术学院 , 湖南 益阳 413039)
　　摘要:为探索属间杂交的亲和性以及改良芥菜型油菜油分品质 , 进行了芥菜型油菜和诸葛菜的属间杂交 , 杂交
亲本为芥菜型油菜四川黄籽 、红叶芥和诸葛菜。将授粉后 7d的子房切下消毒后 , 培养于添加适当植物激素的 MS
和 B5培养基。从 3 574个离体培养的授粉子房中 ,获得了 186粒成熟种子 , 其结籽率为 5.2% 。将种子取出 ,转接
于 MS培养基(添加 2.0mg/L6-BA+0.1 mg/LNAA),获得了单芽和丛生芽。将丛生芽分割为许多单芽 , 转接到
新鲜培养基中 , 获得了 96株小苗。杂种一代植株呈中间型 , 许多性状介于两个亲本之间 , 花粉育性低 , 植株结实性
差。 SSR分子鉴定表明 , F1杂种植株具有双亲的 200、 230bp两条特异带 , 但没有扩增出父母本均没有的新带。获
得的杂种后代植株有可能用于油菜的品质育种。
关键词:油菜;诸葛菜;属间杂交
中图分类号:S565.403.5　　文献标识码:A　　文章编号:1007-9084(2008)01-0035-05
Productionandidentificationofintergenerichybridsbetween
BrassicajunceaandOrychophragmusviolaceus
WANGAI-yun1 , LIXun2 , HUDa-you3
(1.ThelifeScienceandTechnicalInstitute, CentralSouthUnversityofForestryandTechnology,
Changsha410004 China;2.HunanAgriculturalUniversity, Changsha410128, China;
3.YiyangVocationalandTechnicalColege, Yiyang413039, China)
Abstract:TheintergenerichybridizationsbetweenBrasicajuncea(L.)Czern＆ Cosscv.Sichuanhuangzi,
B.junceacv.HongyejieandOrychophragmusviolaceuswerecariedouttostudythecrossing-compatibilityinor-
dertoimprovetheoilqualityofrapeseed.OvariesofB.junceapolinatedwithpolengrainsofO.violaceusando-
variesofO.violaceuspolinatedbyB.juncea, wereremovedandinoculatedontoMSandB5 mediaaddedwithvari-
ousplanthormonesatthe7thdayafterpolination.186seedswereharvestedfrom3 574polinatedovariescultured
invitrobyusingB.junceaasthematernalparent.Thepercentageofseedsetwas5.20%.Theseedsweretrans-
feredontotheMSmediaaddedwith2.0mg· L-1 6-BA+0.1 mg· L-1 NAA, andsomesinglebudsandcom-
poundbudswereproducedlater.Thecompoundbudswerethencutintoanumberofsinglebuds, whichwere
transferredontofreshmedia.Ninety-sixplantletsinvitrogrewfromthebuds.NineoftheNinety-sixplantlets
showedmanycharacteristicsinbetweenbothparents.Polenfertilityofhybridplants(F1)werepoor.SSRmolecu-
laridentificationrevealedthatthehybridplants(F1)had200、230bpSSRsegmentsfrombothparents, butnonew
SSRsegmentswerecreatedinF1.Theprogeniesobtainedfromtheintergenerichybridizationscouldbeusedinim-
provingseed-oilquality.
Keywords:Brasicajuncea;Orychophragmusviolaceus;Intergenericcrosses
收稿日期:2007-06-11
基金项目:湖南省科技厅资助项目(05NK3046)
作者简介:王爱云(1964-),女 ,湖南桃江人 ,高级讲师,博士 ,主要从事油菜遗传育种研究。
Tel:0737-6614336, E-mail:wangaiyun1964@yahoo.com.cn
　　芥菜型油菜(Brassicajuncea)主要分布于我国
西北和西南山区旱地 ,具有耐瘠 、耐旱 、抗黑胫病 、抗
裂荚 、黄籽 、含油量高 、种皮薄 、低纤维等优良特性 ,
但菜籽油中芥酸和硫代葡萄糖甙含量高 ,品质较差 。
通过远缘杂交可以有效地将异种 、属间的遗传物质
引入和转移到芥菜型油菜中 ,达到改良芥菜型油菜
品质的目的 。近年来 ,关于芥菜型油菜和甘蓝型油
菜 [ 1 ～ 2]白菜型油菜种间杂交[ 3 ～ 4] ,芥菜型油菜和诸
葛菜[ 5]的远缘杂交以及通过基因工程方法改良芥
菜型油菜等都有报道 ,说明人们对于芥菜型油菜的
研究已引起了广泛的重视 。
诸葛菜(Orychophragmusviolaceus)是十字花科
诸葛菜属的一种野生植物 ,其种子油品质优良 ,油
酸 、亚油酸含量高 ,芥酸含量低 [ 6] 。通过芥菜型油
菜和诸葛菜的有性杂交可利用这些有利基因改良芥
菜型油菜的遗传背景 ,从而获得芥菜型油菜新的种
质资源 。
1　材料和方法
1.1　材料
试验材料包括芥菜型油菜(B.juncea, 2n=36,
AABB)2个品种(系)四川黄籽 、红叶芥(原产地:中
国 、印度),湖南农业大学油料作物研究所提供 。诸
葛菜(O.violaceus, 2n=24, OO),南京植物研究所
提供 。上述材料均种植于湖南农业大学试验地 ,一
般栽培管理。
1.2　方法
1.2.1　杂交方法　用芥菜型油菜和诸葛菜分别为
父母本进行正 、反属间杂交。在盛花期采用人工剥
蕾去雄重复授粉的方法进行人工授粉。授粉后 7d
左右 ,一些雌蕊用来作为子房培养;一些留在植株上
直到其完全成熟或干枯 ,作为试验对照 。
1.2.2　培养方法和培养基　授粉后 7d左右取子
房 ,首先用 70%的乙醇消毒 1 ～ 2 min,然后用 0.1%
HgCl2灭菌 8 ～ 10min,用无菌水冲洗 5次 。接种前 ,
用无菌滤纸吸干子房表面无菌水 ,去除果柄 ,子房连
同花托一起接种到培养基上培养 。选择 MS和 B5
为基本培养基 ,附加一定量激素(表 1),蔗糖浓度为
3.0%(W/V),用 0.7%(W/V)的琼脂粉固化。接
种子房在温度 24 ～ 26℃,光照 16 h· d-1 ,光照强度
2000 lx条件下培养 20 ～ 30 d,从角果中取出成熟的
种子 ,在分化培养基上培养 ,形成芽或复合芽 ,然后
将长于 2cm的芽在新鲜培养基上培养 ,当幼苗生长
至大约 5cm时转入生根培养基培养 15 d左右 ,进行
1 ～ 2 d炼苗 ,然后用灭菌水将幼苗冲洗干净 ,移栽
到盆钵中生长 。
表 1　用于诸葛菜与芥菜型油菜杂交子房培养的培养基组成
Table1　MediacompositionsusedforovarycultureinthecrossesbetweenB.junceaandO.violaceus
培养基
Media
子房培养基
　　　　Ovaryculturemedia　　　　
A B C D
分化培养基
Differentiationmedium
生根培养基
Rootingmedium
基本培养基
Basalmedia MS MS B5 B5 MS MS
6-BA/mg/L 2 3 3 2 2.0
NAA/mg/L 0.2 0.1 0.2 0.3 0.1 0.05
水解酪蛋白
Casein/mg/L 500 500 500 500
活性炭
Activatedcarbon/% 0.5 0.5 0.5 0.5
1.2.3　计算方法　结角率(%)=收获的角果数 /
授粉花朵数 ×100 , 结籽率(%)=饱满种子数 /授粉
花朵数 ×100
1.2.4　F1植株形态学观察及 F1花粉育性考察　
观察 、记载 F1 杂种生长发育不同阶段的形态学变
化 ,并照相 。按照李栒 [ 7] 的方法 ,采用醋酸洋红染
色 ,计算可染色花粉的百分率。
1.2.5　杂种后代的分子鉴定　DNA的提取:取亲
本和 F1杂种植株的幼叶 ,采用 CTAB法提取 DNA
并纯化 。
PCR反应条件:反应体积 20μL,其中 10×bufer
2.0μL(含 Mg2+)、10mmol· L-1dNTPs0.4μL、2.5U
·μL-1Taq酶 0.8μL、10μmol· L-1引物 1μL、25ng
·μL-1 DNA4μL、ddH2O10.8μL。 Taq酶购自北京
天为时代公司 , dNTPs购自北京鼎国公司 , 55对 SSR
引物(一部分由 htp://www.ukcrop.net下载而得 ,
另一部分是在 EMBL基因数据库中用 Primer5软件
设计的)由上海生工合成 ,引物名称见表 2。
PCR扩增程序:扩增反应在 BiometraPCR仪上
进行 。具体步骤如下:第一步 94℃预变性 5min,第
二步 94℃变性 1min,第三步 49 ～ 58℃退火 45s,第
四步 72℃延伸 90s,第五步从第二步到第四步 40个
循环 ,第六步 72℃延伸 8min。 4℃保存。
电泳及其检测:扩增产物在 3.0%琼脂糖凝胶
36 中国油料作物学报　2008, 30(1)
表 2　试验所用 SSR引物
Table2　ListoftheSSRPrimerpairsused
编号
No.
引物名称
PrimerName
编号
No.
引物名称
PrimerName
编号
No
引物名称
PrimerName
编号
No
引物名称
PrimerName
1 NA10-D07 15 RA2-G05 29 AF113919 43 AF095248
2 NA10-G08 16 RA3-H05 30 AF230693 44 X69320
3 Na10-B04 17 RA2-B01 31 U67451 45 S82294
4 NA12-C03 18 RA3-E04A 32 Z18921 46 AF095247
5 NA14-D07 19 RA3-G11 33 Na10-E08 47 AF045671
6 NA12-D09 20 RA3-H12 34 Na10-F01 48 AF045682
7 NA12-E05 21 AF051772 35 Na10-F08 49 AF128102
8 NA12-F03 22 AF113918 36 Na10-G05 50 AF128103
9 NA12-H02 23 AF207562 37 Na10-G06 51 AF269128
10 NA12-B02 24 X92955 38 Na12-A01 52 AF269129A
11 RA1-H11 25 AF180355 39 Na12-B01 53 AF269129B
12 RA2-C08 26 AF241115 40 Na12-B09 54 U72154A
13 RA2-E11 27 AF241115 41 AF051116 55 U72154B
14 RA2-E03 28 AF241115 42 AF051116B
中电泳 ,用 GelDOC1000凝胶分析仪进行观察 、分析
和照相 ,以确定 DNA片段在胶上的相对位置和大小。
2　结果与分析
2.1　芥菜型油菜与诸葛菜杂交的亲和性
芥菜型油菜(四川黄籽 、红叶芥)×诸葛菜共杂
交 4 276朵花。其中 3574朵在杂交后 7d左右取其
子房进行子房培养 ,大约 1个月后 ,收获到角果 129
个 ,饱满种子 186粒 ,半饱满种子 141粒 ,干瘪种子
72粒 ,平均结角率为 3.6%,结籽率为 5.2%;另外
的 702朵花保留田间 ,直到种子成熟 ,收获到 20个
角果 , 15粒饱满种子 , 31粒半饱满种子 , 30粒干瘪
种子 ,其平均结角率为 2.8%,结籽率为 2.1%。在
两个正交组合中 ,子房培养均获得了杂交角果 ,结角
率分别为 0.5%、5.2%;结籽率为 0.3%、7.6%,其
中红叶芥 ×诸葛菜杂交组合的结角率和结籽率较
高。但试管苗大多数为偏母植株 。两个正交组合的
田间对照中 ,从红叶芥 ×诸葛菜得到了杂交角果 ,并
且其结角率 、结籽率都较高 ,而从四川黄籽 ×诸葛菜
没有获得杂交角果 。在两个反交组合中 ,共杂交
239朵花 ,其中诸葛菜 ×四川黄籽 ,子房培养和田间
对照分别授粉 98和 36个花蕾 ,诸葛菜 ×红叶芥则
分别为 69和 36个花蕾 ,无论是子房培养还是留在
田间的对照均未获得角果和种子 ,因此在表 2中没
有列出均为零的数据。由此看来 ,在芥菜型油菜与
诸葛菜杂交中 ,其亲和性大小为红叶芥 >四川黄籽
(表 3)。
表 3　芥菜型油菜与诸葛菜的杂交亲和性
Table3　Crossing-compatibilitybetweenB.junceaandO.violaceus
杂交组合
Croscombination
授粉花蕾数
No.of
polinatedflowers
结角数
No.of
pods
结角率 /%
Ratioof
setingpods
饱满粒数
Ful
seeds
半饱满粒数
Half-ful
seeds
瘪粒数
Holow
seeds
结籽率
Percentage
ofseedset/%
四川黄籽 ×诸葛菜
Sichuanhuangzi×
O.violaceus
子房培养
Ovaryculture 1 189 6 0.5 4 5 1 0.34
田间对照
Growthinfield 214 0 0.0 0 0 0 0.00
红叶芥 ×诸葛菜
Hongyejie×
O.violaceus
子房培养
Ovaryculture 2 385 123 5.2 182 136 71 7.63
田间对照
Growthinfield 488 20 4.1 15 31 30 3.07
总计或平均
Totalormean
子房培养
Ovaryculture 3 574 129 3.6 186 141 72 5.20
田间对照
Growthinfield 702 20 2.8 15 31 30 2.14
　　通过子房培养获得的种子被转移到新鲜培养基
上 ,有些发育成了复合芽 ,有些长成了单芽 。将复合
芽切成许多单芽 ,大约 1个月后 ,长成了小苗。经生
根 、炼苗后 ,将生长健壮的再生植株分批移栽到盆钵
中继续生长。本试验从四川黄籽 ×诸葛菜 ,红叶芥
×诸葛菜两组合分别得到了 21和 75株再生植株 。
2.2　属间杂种的主要形态特征
由田间对照获得的植株形态上完全与母本一
37王爱云等:芥菜型油菜与诸葛菜属间杂种的获得及鉴定
致 ,无任何变异(因在苗期取叶进行 SSR分子鉴定
证明全为假杂种 ,因此在下文中不再讨论)。在四
川黄籽 ×诸葛菜杂交组合中 ,经过子房培养获得的
21株再生植株 ,其中 4株形态上发生了变化 ,其叶
片缺刻比母本四川黄籽浅 ,叶翅少 ,叶表面和叶柄表
面像诸葛菜一样有少量毛 ,且叶表面没有像母本那
样的表面隆起(图 1a)。从红叶芥 ×诸葛菜杂交组
合中得到的 75株再生植株形态基本与母本一致 ,其
中有 5株叶片顶端较园 ,与诸葛菜的叶型相似。形
态变异的 9株植株现蕾比母本迟 ,花色与母本一样 ,
呈现黄色 ,花药干瘪 ,花粉量少 ,具雄性不育的特性。
花粉粒经醋酸洋红染色显示 , 可育花粉率分别为
21%和 17%(图 1b)。F1自交结实性差 ,果荚中大
部分为败育的胚珠(图 1c),得到的 F2种子颜色出
现了分离 ,不仅有黑色种子 ,也有棕色种子 ,但没有
出现像四川黄籽一样的黄色种子 。
a　F1植株形态特征;b　花粉粒;c　F2 败育的胚珠a　MorphologicalcharacterofintergenerichybridF1 plantsbetweenSichuanhuangziandO.violaceus;
b　F1 polengrainsfromSichuanhuangzi×O.violaceus;c　SterileF2 ovulesfromSichuanhuangzi×O.violaceus图 1　四川黄籽 ×诸葛菜后代表现
Fig1.MorphologyofintergenericcrossprogeniesderivedfromSichuanhuangzi×O.violaceus
2.3　属间杂种的 SSR分子鉴定
用亲本基因组 DNA为模板进行 PCR扩增 , 55
对引物中引物 S82294(序列为 Sense5 GCCAAG-
TAGCCGAGTGATGT3 , Antisense5 TTTGTTTA
CGGAGCGGTTTT3 )在亲本芥菜型油菜和诸葛菜
中分别检测到了 200、230bp的特异性条带 ,因此 ,该
引物可用于属间杂种 F1植株的真假鉴定 。用该引
物对所获得的 F1杂种植株鉴定研究表明 ,形态有变
异的 9株 F1植株具有双亲的两条特异带 ,但没有扩
增出父母本没有的新带;而其余偏母植株只有芥菜
型油菜的一条带。这些结果表明 ,由芥菜型油菜 ×
诸葛菜得到的 9株形态上有变异的植株为真杂种 ,
而其余偏母植株是假杂种。图 2显示了由杂交组合
四川黄籽 ×诸葛菜得到的 F1杂种植株同时具有父 、
母本的特征带 。
1:四川黄籽;2:诸葛菜;3-11:四川黄籽 ×诸葛菜F1;M:DNAMarkerⅠ
1:Sichuanhuangzi;2:Zhugecai;3-11:Sichuanhuangzi×ZhugecaiF
1
;M:DNAMarkerⅠ
图 2　引物 S82294在 2个亲本和其 F1中的扩增效果
Fig2.Amplifiedpatternsof2 parentsandtheirF1 withSSRprimerS82294
3　讨论
本研究表明 ,芥菜型油菜与诸葛菜杂交存在高
度不亲和 ,共授粉 4 276个柱头 ,获得 149个角果 ,
201粒杂交种子 , 96株再生植株 。对 F1植株的形态
38 中国油料作物学报　2008, 30(1)
学鉴定表明 ,大部分植株为偏母植株 ,仅 9株在某些
性状方面表现为父母本的中间型。李再云等 [ 5, 8]在
甘蓝型油菜 、芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥 ×诸葛菜 、
殷家明等[ 9]在芥蓝 ×诸葛菜以及 WUetal[ 10]在甘
蓝型油菜 OguCMS×诸葛菜的远缘杂交研究中也获
得了类似结果。偏母植株的产生可能是异源父本花
粉诱导的孤雌生殖所致。
芥菜型油菜与诸葛菜的可交配性不一样 ,以芥
菜型油菜做母本能获得杂种 ,以诸葛菜为母本在本
试验中没有获得杂种 。不同基因型间亲和性也有一
定的差异 ,如本研究中 ,红叶芥与诸葛菜的亲和性大
于四川黄籽与诸葛菜的亲和性。在育种中 ,可采用
芥菜型油菜 ×诸葛菜杂交方式 ,选用亲和性较高的
品种 ,如红叶芥 。孟金陵 ,吴江生[ 11 ～ 12] 在甘蓝型油
菜与芥菜型油菜的远缘杂交中也发现了类似的现
象 ,母本基因型分别控制受精指数高低和结实性强
弱 。
单向不亲和现象在种间杂交中普遍存在 ,如番
茄 、辣椒 、曼陀罗 、烟草 、亚麻等 ,均发现种间杂交时
存在单向不亲和性 ,但其机制现在还不清楚 ,多数研
究者认为单向不亲和与自交不亲和基因功能有关 。
芥菜型油菜与诸葛菜杂交时是否存在单向不亲和现
象还有待进一步研究 。
芥菜型油菜和诸葛菜杂交后代出现较高频率的
假杂种 , 96株杂交小苗中有 87株假杂种 ,因此 ,在
远缘杂交研究中 ,杂种的鉴定尤为重要。在杂种的
鉴定方法中 ,形态学鉴定最为简单 ,但在幼苗期尤其
是组培苗很难从形态上来辨认真假;SSR分子鉴定
研究表明和形态学鉴定结果一致 ,形态上有变异的
9株 F1植株不仅具有母本的 230bp特征带 ,而且具
有父本的 200bp特征带 ,是芥菜型油菜与诸葛菜的
真杂种 。分子标记适合杂种的真假鉴定 ,便于对杂
种进行组培扩繁和人工加倍。
近年来 ,为了改良现有的芥菜型油菜品种或者
创造新的种质资源 ,人们广泛进行了芥菜型油菜与
其它十字花科植物的远缘杂交 ,获得了一些较好的
结果 ,但远缘杂交的成功率仍然很低。
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39王爱云等:芥菜型油菜与诸葛菜属间杂种的获得及鉴定