全 文 ：HEREDITAS (Beijing) 2008年 5月, 30(5): 627―632
ISSN 0253-9772 www.chinagene.cn 研究报告

收稿日期: 2007−10−10; 修回日期: 2008−01−15
基金项目 : 国家自然科学基金 (编号 : 30670199、30770185)、浙江省自然科学基金 (编号 : X305692、301406)、浙江省科技计划项目 (编号 :
2006C32016)、杭州市科技科技计划项目(编号: 2005132H06)和浙江省“151”人才基金项目资助[Supported by the National Natural
Science Foundation of China (No. 30670199, 30770185), the Natural Science Foundation of Zhejiang Province (No. X305692, 301406),
the Zhijiang Scientific and Technological Program (No. 2006C32016), the Hangzhou Scientific and Technological Program (No.
2005132H06) and the Science Foundation for ‘151’ Talents of Zhejiang Province]
作者简介: 吴振兴(1982− ), 男, 浙江人, 硕士研究生, 专业方向: 植物分子遗传学。E-mail: wuzhenxing007@126.com
通讯作者: 王慧中(1962− ), 男, 浙江人, 博士, 教授, 硕士生导师, 研究方向: 兰属与石斛属分子生物学研究。E-mail: whz-2005@163.com

DOI: 10.3724/SP.J.1005.2008.00627
兰属 Cymbidium植物 ISSR遗传多样性分析
吴振兴 1, 王慧中 1, 施农农 1, 赵艳 2
1. 杭州师范大学生物化学与分子生物学杭州市重点实验室, 杭州 310018;
2. 浙江工商大学食品、生物与环境工程学院, 杭州 310018
摘要: 将简单重复序列区间扩增多态标记(inter-simple sequence repeats, ISSR)技术应用于 16 种兰属的遗传多样
性分析, 15 个引物共扩增出 836 条带, 其中有 227 条多态带, 多态百分比为 27.2%。UPGMA 聚类结果显示: 春
兰与春剑的亲缘关系最近, 而兔耳兰与其他 15 种兰属植物的距离最远。ISSR 聚类结果与传统分类结果基本相
似, 表明该技术能在分子水平上对传统兰属分类进行必要补充。
关键词: 兰属植物; 遗传多样性; ISSR
The genetic diversity of Cymbidium by ISSR
WU Zhen-Xing1, WANG Hui-Zhong1, SHI Nong-Nong1, ZHAO Yan2
1. Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310018,China;
2. College of Food, Biological and Environmental Engineering, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018, China
Abstract: ISSR was applied to detect the relationship between 16 Cymbidium species, and 836 bands were amplified with
15 primers, including 227 polymorphic bands. The polymorphic percentage is 27.2%. UPGMA results showed that the ge-
netic distance were closest between C.goeringii (Rchb.f.) Rchb.f. and C. goeringii var. longibracteatum, and C.lancifolium
Hook. was far away from the other 15 species. This result is quite similar to the traditional classification, indicating that the
technique could supplement some information to traditional taxonomy in the molecular level.
Keywords: Cymbidium; polymorphism; ISSR
兰属是兰科兰族的萼足兰涯族的一个属, 全世
界约有兰属植物 70 种[1], 主要分布于亚洲热带与亚
热带地区, 向南到澳大利亚北部。根据 Du Puy 和
Cribb 分类系统, 我国有 49 种兰属植物和一些变种,
产于秦岭以南各省[2]。我国兰花的市场交易额巨大,
这是由于兰属植物不仅具有观赏价值, 还具有重要
的药用价值[3]。
兰属植物在自然界中存在杂交, 也有人通过属
间杂交培育出优良品种 , 因此该属的分类较为混
乱[4]。兰属的系统分类以形态学为标准，而近几年,
利用分子标记技术对该属植物进行遗传多样性研究
也有了相关报道。文李等[5]应用 RAPD 技术分析兰
属植物的 5 个种 2 个变种的 13 个品种的亲缘关系,
结果与传统的形态分类有出入 ; 王慧中等 [6]用

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RAPD和AFLP技术对兰属 14种植物进行遗传多样性
分析, 发现两种标记技术所得数据有差异, 但结果基
本相似, 并与 Du Puy和 Cribb分类系统基本一致。
1994 年 , Zietkiewicz 等 [7]建立了 ISSR(inter-
simple sequence repeats, 简单重复序列区间扩增多
态性)标记技术。该技术稳定性好, 多态性高, 实验
操作简便且快速, 还可以揭示基因组水平的某些特
征, 且呈孟德尔式遗传, 因此该技术一经问世就被
广泛用于植物分子水平上的研究。Raina等[8]将构建
的 ISSR指纹图谱应用于 Arachis hypogaea的遗传多
样性分析、品种鉴定和系统发生关系的研究; Sca-
rano 等 [9]用 ISSR 方法鉴别柑橘体细胞杂合体 ;
Huang 等[10]用该技术分析了番薯属的亲缘关系, 获
得了丰富的多态性条带; 李海生等[11]使用 ISSR 标
记技术对海南海桑进行了遗传多样性分析。Joshi
等[12]用该法对 Swertia chirayita 微繁殖幼苗的遗传
的保守性进行了分析。
本实验采用 ISSR标记技术对所掌握的 16种兰属
材料进行亲缘关系的分析, 希望通过该标记方法研究
出兰属植物分类及系统发育的可行性, 为兰属植物资
源的开发及新种的选育提供分子水平的参考依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料
本实验研究对象为兰属 16 个种(表 1), 主要采
自杭州花圃和余杭大观山。
表 1 供试的 16 种兰属材料名称
Table 1 Sixteen species of Cymbidium tested in experiment
编号 No. 材料名称 Species
1 多花兰 C.floribundum Lindl.
2 文山红柱兰 C.wenshanense Y.S.Wu ex F.Y.Liu
3 夏凤兰 C.aestivum Z.J.Liu et S.C.Chen
4 墨兰 C.sinense (Jackson ex Andr.) Willd.
5 黄蝉兰 C.iridioides D.Don
6 虎头兰 C.hookerianum Rchb.f.
7 蕙兰 C.faberi Rolfe
8 台兰 C. fioribundum var. pumilum
9 兔耳兰 C.lancifolium Hook.
10 寒兰 C.kanran Makino
11 莲瓣兰 C.tortosepalum Fukuyama
12 春兰 C.goeringii (Rchb.f.)Rchb.f.
13 春剑 C. goeringii var. longibracteatum
14 建兰 C.ensifolium (L.)Sw.
15 莎叶兰 C. cyperifolium Wall.ex Lindl.
16 象牙白 C.maguanense F.Y.Liu
1.2 实验方法
1.2.1 DNA 提取与定量
按彭锐等 [13]的方法进行改进并用于基因组
DNA的提取。
先剪取保存于−74℃中的兰属植物叶片 2.0~2.5 g;
立即用液氮研磨至细末, 加入 5 mL预热 CTAB, 同
时加入 10 µL β-巯基乙醇, 65℃预热 1 h; 冷却后, 加
入等体积氯仿/异戊醇(24:1), 颠倒混匀 50 次, 放置
冰上 20 min; 10 000 r/min 4℃离心 10 min; 取上清,
加入 0.5倍体积 NaCl, 2倍体积无水乙醇, 碎冰上放
置 20 min; 用玻璃钩捞出絮状沉淀 , 转入干净的
Eppendorf 管中, 用 70%乙醇洗涤 3 次, 吸去乙醇;
自然干燥, 500 µL TE溶解; 加入等体积(500 µL)氯
仿/异戊醇(24:1), 颠倒混匀 50次, 放置冰上 20 min;
10 000 r/min 4℃离心 10 min; 取上清, 加入 0.5倍体
积 NaCl, 2 倍体积无水乙醇, 碎冰上放置 20 min;
8 000 r/min 4℃离心 10 min, 弃上清, 70%乙醇洗涤 3
次, 吸去乙醇; 自然干燥, 200 µL TE溶解。
用 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA 的降
解情况, 并用 UV-2401PC(岛津)紫外分光光度计检
测 DNA浓度(OD260、OD280的值)并定量。将所有的
DNA 分别稀释到 100 ng/µL, 作为 PCR 模板, 母液
于−20℃保存待用。
1.2.2 ISSR 引物的筛选
参考高丽等[14]、沈颖等[15]、Shen 等[16]所使用的
ISSR引物, 共筛选了 50条引物, 从中筛选出 15条能对
兰属材料进行扩增并获得清晰条带的引物(表 2)。
表 2 ISSR引物序列
Table 2 ISSR primer sequence
编号 No. 引物序列 Primer sequences
UBC807 (AG)8T
UBC811 (GA)8C
UBC812 (GA)8A
UBC817 (CA)8A
UBC818 (CA)8G
UBC820 (GT)8C
UBC825 (AC)8T
UBC827 (AC)8G
UBC834 (AG)8YT
UBC835 (AG)8YC
UBC840 (GA)8YT
UBC862 (AGC)6
UBC864 (ATG)6
UBC866 (CTC)6
UBC868 (GAA)6
*Y=(C, T)

第 5期 吴振兴等: 兰属 Cymbidium植物 ISSR遗传多样性分析 629


1.2.3 ISSR-PCR 分析
PCR 单管总体系: 5 µL 重蒸水, 1 µL 10×PCR
缓冲液 , 1 µL MgCl2 (25 mmol/L), 0.8 µL dNTPs
(2.5 mmol/L), 1 µL 微卫星间隔引物(5 µmol/µL),
0.2 µL Taq聚合酶 (5 U/µL), 1 µL DNA模板 (100 ng/µL),
总计 10 µL。
ISSR-PCR 程序参照沈颖 [15]的方法 , 建立了适
于兰属材料分析的程序, 其参数为: 94℃预变性 7
min, 45个循环(94℃变性 30 s, 52℃复性 45 s, 72℃延
伸 2 min), 72℃延伸 10 min, 4℃保存。
1.2.4 产物的电泳检测以及成像分析
PCR扩增产物中加入 5 µL上样缓冲液(0.25%溴
酚蓝, 0.25%二甲苯青, 40%蔗糖水溶液), 用 1.5%琼
脂糖进行电泳。电泳条件为 100 V(4~5V/cm)。检测
结果在凝胶成像系统(BIO-RAD)上拍照观察记录。
1.3 数据的统计分析
ISSR 产生一系列谱带, 因此属多位点非特异性
标记。电泳图谱中的条带根据迁移率拷带, 有条带
的用“1”记录, 没有条带的用“0”记录。总共分
析 15 条引物的扩增结果。通过 NTSYS-pc 软件的
UPMGA 法, 计算出兰属各个物种间的相似性系数,
绘出聚类图。
2 结果与分析
15 个 ISSR 引物共扩增到 836 条带, 其中多态
性条带有 227条, 多态性比例为 27.2%。扩增产物长
度介于 200~2 000 bp之间。其中 UBC807、UBC868
的电泳结果见图 1、图 2, 各物种间的遗传相似性系
数见表 3, 数据分析聚类图见图 3。
本研究统计所使用的引物中(表 3), 扩增所得到
的条带总数从 15~81 不等, 其中多态条带数最多的
是 UBC811, 共获得 26条, 最少的为 UBC827, 仅有
1 条。而多态百分比最高的是 UBC840, 达到 38%,
最少的为 UBC827, 仅为 7%。
表 4中的遗传相似系数与图 3聚类结果表明, 16
种兰属植物可以分成 3个部分, 其中多花兰、台兰、
夏凤兰、文山红柱兰、黄蝉兰、虎头兰等聚成第Ⅰ
类, 此类中多花兰与台兰的亲缘关系最近, 在 0.76
处相聚, 而黄蝉兰与虎头兰次之, 在 0.71 处相聚;

图 1 引物 UBC807的扩增结果
1~16: 16个兰属种; M: MarkerⅢ。
Fig. 1 ISSR profiles generated by primer UBC807
1−16: 16 species; M: MarkerⅢ.

图 2 引物 UBC868的扩增结果
1~16: 16个兰属种; M: MarkerⅢ。
Fig. 2 ISSR profiles generated by primer UBC868
1−16: 16 species; M: MarkerⅢ.
表 3 ISSR标记条带数统计
Table 3 Numbers of ISSR bands
引物名称
Primer name
条带总数
Total bands
多态条带
Polymorphic bands
多态百分比
Polymorphic
percentage(%)
引物名称
Primer name
条带总数
Total bands
多态条带
Polymorphic bands
多态百分比
Polymorphic
percentage (%)
UBC807 75 19 25 UBC834 40 10 25
UBC811 81 26 32 UBC835 50 15 30
UBC812 63 14 22 UBC840 56 21 38
UBC817 64 19 30 UBC862 54 15 28
UBC818 33 12 36 UBC864 53 14 26
UBC820 71 16 23 UBC866 64 16 25
UBC825 62 17 27 UBC868 55 12 22
UBC827 15 1 7

630 HEREDITAS (Beijing) 2008 第 30卷



图 3 根据 ISSR标记计算的遗传相似系数获得的聚类图
Fig. 3 Dendrograms generated from genetic similarity between species on the basis of ISSR markers

表 4 根据 ISSR标记计算的各物种间遗传相似系数
Table 4 Genetic similarity between species on the basis of ISSR markers
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
1 1.00
2 0.74 1.00
3 0.76 0.68 1.00
4 0.69 0.64 0.65 1.00
5 0.73 0.68 0.68 0.67 1.00
6 0.71 0.70 0.64 0.61 0.71 1.00
7 0.68 0.62 0.62 0.67 0.71 0.65 1.00
8 0.76 0.70 0.71 0.68 0.72 0.72 0.70 1.00
9 0.67 0.65 0.63 0.67 0.68 0.65 0.64 0.65 1.00
10 0.76 0.71 0.70 0.64 0.72 0.68 0.66 0.72 0.66 1.00
11 0.74 0.69 0.69 0.71 0.74 0.72 0.77 0.74 0.74 0.75 1.00
12 0.72 0.63 0.67 0.67 0.68 0.68 0.70 0.68 0.64 0.69 0.74 1.00
13 0.73 0.64 0.67 0.68 0.68 0.69 0.70 0.70 0.65 0.71 0.75 0.96 1.00
14 0.71 0.64 0.65 0.77 0.70 0.65 0.74 0.73 0.69 0.71 0.76 0.70 0.71 1.00
15 0.73 0.65 0.69 0.71 0.69 0.68 0.73 0.74 0.68 0.71 0.77 0.72 0.74 0.75 1.00
16 0.71 0.68 0.68 0.67 0.70 0.64 0.70 0.71 0.71 0.74 0.76 0.72 0.73 0.76 0.71 1.00

墨兰、建兰、蕙兰、莲瓣兰、莎叶兰、春兰、春剑、
寒兰、象牙白等则聚成第Ⅱ类, 其中春兰与春剑的
亲缘关系最近, 均在 0.96 处相聚, 而墨兰与建兰、
蕙兰与莲瓣兰则同时在 0.77 处相聚, 寒兰与象牙白
则再次之, 在 0.74 处相聚; 而兔耳兰则远离这两大
类, 单独成为一支。
3 讨 论
3.1 兰属植物的分类研究
在 Du Puy 和 Cribb分类系统[17]中将象牙白划
在腋花组, 黄蝉兰、虎头兰、文山红柱兰分列在大
花组, 这两组同属于大花亚属; 将建兰、墨兰分为建

第 5期 吴振兴等: 兰属 Cymbidium植物 ISSR遗传多样性分析 631


兰组, 寒兰, 春兰、春剑分在春兰组, 兔耳兰列为兔
耳兰组。
吴应祥 [18]将德国兰科学者 R.Schlechter 与
P.F.Hunt两人所承认的 8个兰属组合并成 6个组。其
中春兰、莲瓣兰、春剑、蕙兰、建兰、寒兰、墨兰、
莎叶兰属于长苞组; 多花兰、台兰、冬凤兰则属于
短苞组; 长柱组中有黄蝉兰、虎头兰、象牙白、文
山红柱兰等物种; 兔耳兰隶属宽叶组。
本研究中的 16 种兰属植物在刘仲健等[19]分类
中可归为 3 个亚属中的 8 个组。其中夏凤兰分在兰
亚属的带叶组, 多花兰、台兰隶属于多花组, 其中台
兰被认为是多花兰的一个变种; 黄蝉兰、虎头兰属
于大花亚属大花组, 而象牙白、文山红柱兰分别属
于该亚属的腋花组; 莎叶兰属于建兰亚属的地生腋
花组, 而建兰、墨兰、寒兰、春兰、春剑均属于该
亚属的建兰组, 蕙兰、莲瓣兰则分在无关节组, 兔耳
兰则属于兔耳兰组。
文李等[5]利用 RAPD技术分析后得到建兰与墨兰
亲缘关系最近。王慧中等[6]利用 RAPD 和 AFLP 聚类
结果显示, 寒兰与春兰、春剑聚为一类; 而黄蝉兰、虎
头兰以及文山红柱兰较远。张明永等[20]研究表明, 兔
耳兰偏离出兰属植物分类群, 成为最基部一分支。
3.2 兰属与石斛属的 ISSR研究进展
高丽等[14]采用 ISSR 分子标记技术对湖北省内
的 11个春兰野生居群共 325个个体的遗传多样性水
平及居群遗传结构进行了研究。11 个 ISSR 引物共
检测到 127 个位点 , 其中 112 个为多态位点 , 占
88.19%。结果表明, 野生春兰各居群间产生遗传分
化, 亟待保护。
沈颖等[15]采用 ISSR 法对石斛属 9 种植物进行
鉴别, 10 条 ISSR 引物中有 7 条扩增出多态性条带,
多态位点从 7~14 个不等, 片段范围 220~1 260 bp,
其中UBC807与UBC864能将所有被测种区分开来。
沈洁等[21]通过筛选引物, 并检测影响铁皮石斛
ISSR反应体系中各因子在不同浓度下的扩增效果。
通过分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化,
建立了铁皮石斛稳定且可靠的反应体系。
3.3 ISSR对兰属物种的遗传多样性的研究
引物设计是 ISSR标记技术的关键步骤[22]。ISSR
引物常常为 5′端或 3′端加锚(1~4 nt)的二核苷酸、
三核苷酸、四核苷酸的重复序列, 重复次数一般在
4~8 次之间。本研究所用引物都是 3′端加锚的, 这
样的引物能够扩增出 SSR之间的片段。由于 SSR在
植物整个基因组当中都有均匀分布 , 因此常规的
PCR 方法, 就能获得多态性高且片段长度局限于一
定范围内的条带。
实验结果显示, UBC807、UBC840 两种引物扩
增条带就能将所有材料区分开; 其他引物中除春兰
与春剑有极高的相似性外, 其余 14 个物种的 DNA
指纹图谱也不尽相同。从以上结果可以看出, 本研
究所筛选的 ISSR引物对兰属植物的 DNA指纹图谱
构建具有有效性, 分子水平上的多态信息则便于对
兰属 16种植物进行遗传多样性分析。
ISSR 聚类分析显示, 多花兰、台兰、夏凤兰、
文山红柱兰聚在一起, 除文山红柱兰外, 其他的与
传统分类相似; 而黄蝉兰、虎头兰也聚在一起, 与传
统分类相同; 象牙白归到第Ⅱ类中, 这个与传统分
类有出入。第Ⅱ类中, 其余几个物种虽在一类, 但莎
叶兰、寒兰等关系均与传统分类有差异。而兔耳兰
则远离这两大类 , 传统分类中它应该更靠近第Ⅱ
类。实验结果表明, ISSR 标记对兰属分类与刘仲健
等[19]在形态上对兰属的分类大体相似, 而某些分组
上则有出入。因此, 本实验对兰属在分子水平上的
分类研究可提供必要补充。
总之, ISSR 标记技术对兰属的遗传多样性的评
估和系统发育关系的分析具一定的有效性, 是一种
适于兰属亲缘关系及遗传多样性分析的方法。该
研究对兰属种质资源保护与新品种开发都有重要
意义。
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