全 文 ：Vol. 32 No. 2
Feb. 2012
第 32卷 第 2期
2012年 2月
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
Journal of Central South University of Forestry & Technology
八角属植物 AFLP体系的建立与优化
潘晓芳，孙雪阳，黄寿先，周传明，陈翠湖，闭冬玲
(广西大学 林学院，广西 南宁 530004)
摘 要： 以八角属部分树种和八角品种共 56个样品为试验材料，利用AFLP分子标记技术进行遗传多样性分析。
采用改良的CTAB法提取总DNA，通过对酶切 -连接反应、预扩增和选择性扩增反应过程中的关键因素进行优化，
建立了适合八角属植物的 AFLP分子标记体系。该体系应用于八角 AFLP研究，能够得到高质量的总 DNA和清
晰的遗传标记图谱，研究结果为八角种质资源分子生物学研究提供技术支撑。
关键词： 八角属；分子标记；AFLP；反应体系
中图分类号：S794 文献标志码：A 文章编号：1673-923X(2012)02-0086-03

Establishment and optimization of AFLP technical system for Illicium
PAN Xiao-fang, SUN Xue-yang, HUANG Shou-xian, ZHOU Chuan-ming, CHEN Cui-hu, BI Dong-ling
( Forestry College, Guangxi University, Nanning 530004, Guangxi，China )
Abstract: By taking 56 samples of Illicium species and Illicium verum Hook. f. varieties as testing materials, and using AFLP
molecular markers technology, the species and varieties’ genetic diversity were analyzed. The total DNA of the species and varieties
were extracted adopting the improved CTAB, and the AFLP molecular markers system that is suitable for Illicium plants was established.
Through applying the system to study Illicium plants, high quality total DNA and clear genetic markers map were obtained. The results
provide technical support for studying molecular biology of Anise germplasm resources.
Key words: Illicium; molecular marker; AFLP; reaction system
收稿日期：2011-09-12
基金项目：广西科学基金项目“八角种质资源的分子鉴别及遗传特性分析 (桂科基 0639008)”
作者简介：潘晓芳 (1963—)，男，壮族，广西武鸣人，副教授，博士研究生，硕士生导师，主要从事经济林栽培与良种选育教学与研究；
E-mail：gxpxf9460@sina.com
八角科 Illiciaceae 为一单属科，仅八角属
Illicium［1］，全世界有 34种，呈东亚—北美间断
分布，主产我国西南部至东部，我国有 25种［2］。
八角 Illicium verum Hook. f.［1］为八角科八角属重
要的香料和药用植物，我国八角栽培面积和产量均
占世界的 85 %，主要分布在广西、云南、广东等省
区［3］。采用分子标记技术对八角属植物开展遗传
多样性和亲缘关系研究，对八角属植物分类和八
角育种有着重要意义。
A F L P ( a m p l i f i e d f r a g m e n t l e n g t h
polymorphism)，即扩增片段长度多态性，是荷兰
Keygene 公 司 Zabeau 等 (1992)、Zabeau 和 Vos 等
(1993)发展的一种新的 DNA指纹技术 [4-5]。其原
理简单，引物设计巧妙，结合了 RFLP和 RAPD
技术的特点，被人们普遍认为是构建遗传图谱较
好的分子标记，对于植物遗传多样性的鉴定、物
种亲缘关系的研究作用突出 [5]。本研究应用 AFLP
分子标记技术对八角属植物进行遗传多样性鉴定，
通过建立和优化八角 AFLP体系，为八角种质资
源分子生物学研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
八角试验样品分别来自广西国有派阳山林场
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八角基因库、国有六万林场、国有高峰林场及广
东华南植物园等地，共 56份，所有样品均采摘新
鲜嫩叶 10片左右，用封口袋密封，放入冰盒中带
回实验室，置于 -20 ℃冰箱中低温保存。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取 本试验采用改良 CTAB法提
取 .其具体步骤如下：① 将叶片置于盛有变色硅
胶干燥器内干燥，称取材料 50 mg,液氮研磨 3～ 4
次，将粉末放到装有 800 μL 2×CTAB提取缓冲液
[100 mmol/L Tris.cl(pH＝ 8.0)，20 mmol/L EDTA，1.4
mmol/L Nacl，2 % (W/V)CTAB,40 mmol/L巯基乙醇 ]
的 2 mL离心管中；② 加入 60 μL巯基乙醇混匀，
60 ℃预热 30 min，其间混匀 2～ 3次，取出样品
于室温放置；③ 待样品冷却到室温加入 800 μL氯
仿∶异戊醇 (24∶ 1)，振荡混匀，12 000 r·min-1离
心 15 min；④ 取上清液于一新的 2 mL Ep管中加
入 1.5倍体积的 1×CTAB沉淀液 [50 mmol/L Tris.
Cl(pH＝ 8.0)，10 mmoL/L EDTA，1 % (W/V)CTAB,
20 mmol/L巯基乙醇 ]，放置 20～ 30 min，12 000
r·min-1离心 15 min；⑤ 将沉淀晾干，溶于 200 μL
TE-buffer中，再加入 400 μL 95 %乙醇，20 μL 3
M NaAC, － 20 ℃沉淀 1 h，4 ℃ 12 000 r·min-1离心
15 min；⑥ 再将沉淀用 500 μL 75 %乙醇清洗，
12 000 r·min-1离心 10 min，加入 30～ 50 μL TE-
buffer 溶解 DNA；⑦使用 0.8 % 琼脂糖凝胶，在电
泳缓冲液 0.5×TBE中电泳检测 DNA纯度、完整
性和产量，电压 180 V，电泳时间 40 min.
1.2.2 限制性酶切及连接体系 限制性酶切及连接
采用一步进行，即在 0.5 mL离心管中加入对照模
板 DNA(浓度为 50 ng/ μL)或 DNA模板 n μL、
Adapter 1μL、Pst I/Mse I mμL、10 XReaction buffer
2.5 μL、10 mmol ATP 2.5 μL、T4 Ligase 1 μL以及
AFLP-Water，构成共计 20 μL的反应体系 .混匀后
离心数秒，37 ℃保温 5 h，8 ℃保温 4 h，4 ℃过夜 .限
制性酶切及连接与样品 DNA用量和酶用量有关，
为了确定最佳样品用量和合适的酶用量，将样品
DNA模板用量设为 100、200、300 ng(样品浓度为
50 ng/ μL，即加入 2、4、6 μL样品 DNA)；利用
Pst I/Mse I 2种限制性内切酶进行双酶切，其用量设
为 1 、2 、3、4 μL共 4个水平。当酶切—连接完
成后，取酶切产物 5 μL，加入 load buffer 2 μL混
合后，在 0.8 % 的琼脂糖凝胶中检测酶切效果。
1.2.3 预扩增体系 该反应体系总体积为 25 μL，即
在 0.2 ml离心管中加入模板 DNA 2μL、Pre-ampmix
1±0.5μL、dNTPs 0.5μL、10XPCR buffer 2.5μL、
Taq DNA polym ease 0.5μL、AFLP-Wat er 18.5± 0.5μL.
在预扩增时，选用的预扩增引物序列为 Pst I预扩增
引物序列 5’＞GAC TGC GTA CAT GCA G＜ 3’、
Mse I预扩增引物序列 5’＞ GAT GAG TCC TGA
GTA A C＜ 3’，用量设为 0.5、1.0、1.5 μL共 3个
梯度，以确定合适的引物用量 .离心数秒后，按下列
参数：变性 94℃ 2 min (变性 94 ℃ 30 s，复性 56 ℃
30 s，延伸 72℃ 80 s )延伸 72℃ 5 min进行 PCR扩增，
循环30轮 .预扩增完成后，取5 μL预扩增产物在0.8
% 的琼脂糖凝胶中检测预扩增效果。
1.2.4 选择性扩增体系 反应体系总体积为 25
μL，即在 0.2 mL离心管中加入预扩增稀释样品
2μL、10XPCR buffer 2.5μL、dNTPs 0.5μL、Pst I
引物 1μL (共 8种 )、Mse I引物 1μL (共 8种 )、
Taq酶 0.5μL、AFLP-Water 17.5 μL，混匀后，离心
数秒，按下列参数 PCR循环：(1)第一轮扩增参数
为 94 ℃ 30 s，65℃ 30 s，72 ℃ 80 s；(2)以后每轮循
环温度递减 0.7℃，扩增 12轮；(3)接着按下列参数
扩增 23轮 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 80 s。产物稀
释的倍数对选择性扩增效果影响很大，本研究将预
扩增产物的稀释倍数设为 10、20、30倍以确定适宜
的稀释倍数。引物选用北京鼎国生物技术有限责任
公司合成的 Pst I/Mse I引物，共 64种组合，经试验
筛选出效果较好的几对引物组合进行选择性扩增。
2 结果与分析
通过 CTAB 法提取纯度高的八角基因组
DNA，见图 1。并按照预先的设计方案，对 AFLP
体系的条件进行筛选，获得了优化的 AFLP反应
体系，具体优化方案见表 1。
通过该优化体系，成功的分析了八角种质资源
的遗传多样性。从 64对引物中筛选出 6对扩增产
物丰富的引物进行扩增，引物组合分别为：P-GAG/
M-CAA、P-GAG/M-CAG、P-GTC/M-CTA、P-GTC/
M-CTG、P-GTG/M-CAA、P-GTG/M-CAC. 所 筛 选
的 6对引物共扩增得到 989条带，其中多态性条带
为988条，多态性比率高达99.90 %.经过体系的优化，
得到了条带清晰的 AFLP图谱，见图 2。
潘晓芳，等：八角属植物 AFLP体系的建立与优化88 第 2期
图 1 部分八角样品DNA检测
Fig. 1 DNA detection of part of Anise samples
图 2 部分样品的AFLP指纹图谱(P-GAG/M-CAA)
Fig. 2 AFLP fingerprint of part of samples(P-GAG/M-CAA)
表 1 酶切-连接、预扩增和选择性扩增的优化体系
Table 1 The suitable systems of restriction-ligation, pre-amplification and selective amplification
酶切 -连接体系 预扩增体系 选择性扩增体系
模板 DNA 4 μL 模板 DNA 2μL 预扩增稀释样品 2μL(预扩产物 1∶ 20稀释 ,作为选扩模板 )
Adapter 1μL Pre-ampmix 1μL 10 XPCR buffer 2.5μL
PstI/Mse I 2μL dNTPs 0.5μL dNTPs 0.5μL
10 XReaction buffer 2.5μL 10XPCR buffer 2.5μL Pst I 引物 1μL(共 8种 )Mse I 引物 1μL(共 8种 )
10 mM ATP 2.5μL Taq DNA polymease 0.5μL Taq 酶 0.5μL
T4 Ligase 1μL Water 18.5μL Water 17.5μL
Water 7μL
预扩增反应条件：变性 94 ℃ 2 min(变
性 94℃ 30s，复性 56℃ 30s，延伸 72℃
80s.)延伸 72℃ 5min，共 30个循环。
PCR扩增：(1)第一轮扩增参数：94 ℃ 30s， 65℃ 30s，72 ℃ 80s.
(2)以后每轮循环温度递减 0.7℃，扩增 12轮 .
(3)接着按下列参数扩增 23轮：94℃ 30s，55℃ 30 s，72℃ 80s.
3 讨 论
⑴酶切和连接通常有两步法和一步法 , 理论上
只要内切酶和连接酶反应温度和缓冲液合适 , 两种
方法都可进行。一般情况下，由于所用的限制性
内切酶和连接酶要求的最适温度有所差别，所以
酶切和连接两个反应一般是分开进行。本研究采
用北京鼎国生物技术有限责任公司 AFLP试剂盒
(Pst I/Mse I型进行分析 )，应用一步完成的方法，
有效的精简操作过程，避免了不必要的操作失误，
也节省了时间，取得了很好的效果，人心果采用
酶切—连接一步完成的方法 [6]也收到很好的效果 .
⑵引物的筛选直接影响到扩增效果，扩增的
条带数过多或过少都不利于多态性的分辨和检测。
进行引物筛选时，选用了 3+3的引物组合，从图
谱可以看出扩增效果较好，带纹清晰，分辨率高，
多态性比较理想。本次试验从 64对引物组合中筛
选出了 6对引物组合，能够全面客观的反映出 56
份样品的遗传多样性和亲缘关系。
⑶本试验中所表现出的极高多态性比率是一
个值得商榷的问题，人心果、紫丁香也有这种现
象［6-7］。过高的多态性比率往往包含有假多态性
条带，这可能与物种本身有关，取样方法和分析
统计方法也会影响到多态性比率，今后研究中应
注意这个问题。
参考文献：
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[ 本文编校：邱德勇 ]