全 文 ：第 4 期
收稿日期：2015－03－25
基金项目：贵州省特色重点学科建设基金项目（黔教高发［2011］208）；贵州省特色重点实验室建设基金项目（黔财教［2012］225）
作者简介：蒋向辉（1974－），男，湖南安化人，副教授，博士，主要从事药用植物成分研究，（电话）18785562409（电子信箱）jxfei789＠163．com。
第 55 卷第 4期
2016 年 2 月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 55 No.4
Feb.，2016
2
1
1
Jan
l． .
.
葛［Pueraria lobata（Willd．）Ohwi］又叫葛藤 ，为
豆科（Leguminosae）葛属（Pueraria DC．）植物［1］。 葛属
植物全世界约有 20 种 ［2］，我国主要种类有野葛、甘
葛藤、娥眉葛、食用葛、粉藤、云南葛、丽花葛等，其
中野葛、粉藤分布最广、产量也较高，是我国资源最
多的 2 个种［3］。 不同来源的葛无论是形态结构还是
活性成分都有差异，即使是同一种葛在不同的生长
条件下各方面也会产生差异。 陶娟等［4］对葛属植物
活性成分研究后发现，不同来源的葛其活性成分含
量高低呈现由北向南逐渐递减的趋势，同种葛的活
性成分含量也是表现为北方的相对较高、南方的相
对较低。 葛茎是我国湖南、湖北、贵州、江西等省的
常见蔬菜，葛根富含葛根素、葛根素木糖甙、大豆黄
酮、大豆黄酮甙及 β－谷甾醇、花生酸等多种活性成
分，还含有大量的淀粉，葛根有解表退热、生津止
渴、止泻的功能，并能改善高血压与糖尿病患者头
晕、头痛的症状［5］。 葛根毒性低、药源广、价格低，对
葛根开发新药和保健品具有良好的发展前景。
葛属植物基于形态学和 rDNA ITS分类的
一致性比较研究
蒋向辉 1，刘良科 2，佘朝文 2
（1．凯里学院化学与材料工程学院，贵州 凯里 556011；2．怀化学院生命科学系，湖南 怀化 418008）
摘要：试验以来自不同地区的葛属（Pueraria DC）植物 11 个种质作为材料，基于其叶色、茎粗、茎节长、茎
色、茎粗、茎被毛等 9 个形态性状进行形态学分类，并对 11 个种质的 rDNA ITS 序列进行克隆测序和序
列比较分析，采用 MEGA 6．0 软件构建 ITS 序列系统进化树。 结果表明，基于 ITS 序列和基于形态特征的
分类结果虽有一定的相似性，但仍存在较大的差异。 不同分类方法导致的结果差异可能与形态特征受其
生长条件、性状的选取等多方面因素的影响有关，而基于 rDNA ITS 序列的分类结果更为可靠。
关键词：葛属（Pueraria DC）；形态学；rDNA；ITS 序列；分类一致性
中图分类号：Q949 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2016）04－0939－04
DOI：10．14088 ／ j．cnki．issn0439－8114．2016．04．032
Study on Classification Consistency Based on Morphology and rDNA ITS
Sequences of Pueraria Species
JIANG Xiang－hui1，LIU Liang－ke2，SHE Chao－wen2
（1． College of Chemistry and Materials Engineering， Kaili University， Kaili 556011， Guizhou， China；
2． Department of Life Science， Huaihua University， Huaihua 418008， Hunan， China）
Abstract： 11 germplasms of Pueraria DC from different regions were classifed by morphological classification method based on
9 morphological characters including leaf color， stem thickness， internodes length， stem color， stem diameter， stem hair；
meanwhile， cluster analysis was conducted by MEGA 6．0 software based on rDNA ITS sequences of the 11 Pueraria species．
It was found that the result of cluster analysis and morphological classification method had some similarities while the differ-
ences were obvious． The research suggested that the differences between different classification methods might be related to
the morphological traits which could be affected by growth conditions， as well as the character selected； thus the classifica-
tion result based on rDNA ITS was more reliable．
Key words：Pueraria DC； morphology； rDNA； ITS sequences； classification consistency
湖 北 农 业 科 学 2016 年
表 1 供试材料及来源
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
名称
广东合水粉葛
湖南常德粉葛
广西藤县粉葛
重庆合川粉葛
云南蒙自粉葛
江西德兴超级粉葛
湖南大卫粉葛
湖南通道山葛
重庆武隆苦葛
湖南会同山葛
湖南常宁野葛
来源
广东省佛山市
湖南省常德市
广西壮族自治区藤县
重庆市合川区
云南省蒙自市
江西省德兴市
湖南省长沙市
湖南省通道县
重庆市武隆县
湖南省会同县
湖南省常宁市
学名
Pueraria thomsonii Benth．
P． thomsonii
P． thomsonii
P． thomsonii
P． thomsonii
P． thomsonii
P． thomsonii
P． montana （Lour．）Merr．
P．peduncularis （Grah． ex Benth．） Benth．
P． montana
P． lobata （Willd．）Ohwi
ITS 序列登录号
JX2334982
JX2334993
JX2335003
JX2335012
JX2335024
JX2335035
JX2335043
JX2335052
JX2334984
JX2335242
JX2334564
物种遗传多样性是物种进化的基础，物种遗传
多样性研究最初主要集中在形态特征方面的描述、
鉴别与分类，迄今为止，形态性状的共性与差异仍
是植物分类的主要依据。 形态性状标记主要分为 2
类：单基因决定的质量性状与多基因决定的数量性
状。 基于形态标记的遗传多样性具有简便、快速、花
费少等优点，但其不足是这些性状的遗传机制较为
复杂，遗传率低，且环境条件对其影响较大，导致观
测标准不一致，标记同源性难以把握，不能完全满
足遗传多样性分析的需要。 20世纪 80年代以来，随
着分子生物学和分子克隆技术的发展，一系列基于
DNA 序列变异的遗传多样性检测方法应运而生 ［6］，
研究表明，ITS 序列与其保守性序列相比，其变异相
对较快，信息位点和变异位点较为丰富，将其用于
被子植物进化与类群分析，可以有效区分科、亚科、
族、属之间的系统发育关系［7］。鉴于此，试验对葛属的
11 个种质以形态学为基础进行初步分类的同时，根
据它们的 rDNA ITS 序列特征进行比较分析， 构建
了系统发育树，试图将形态标记与 DNA分子标记结
合起来对葛属物种进行遗传多样性分析，以期为葛
属物种的分类鉴定与亲缘关系分析提供依据。
1 材料与方法
1．1 材料
试验所用材料为葛属 11 个不同来源的种质，
相关信息见表 1。
1．2 方法
1．2．1 形态学分析 对不同来源的葛属种质进行
形态学描述，筛选出物种间既有共性、又有差异的 9
个形态学性状叶色、叶大小、茎粗细、茎节长短、节
间膨大、茎颜色、芽粗细、茎被毛密度、茎被毛颜色；
参照郭先锋等 ［8］的方法对性状进行赋值处理，采用
MEGA 6．0 软件对 11 份种质进行聚类分析，并绘制
树状图。
1．2．2 ITS 序列克隆与序列分析 采用 CTAB 法提
取供试物种基因组 DNA。 用于扩增的 ITS序列引物
参照 White 等 ［9］设计的 ITS 通用引物，其序列的上
游引物为 ITS5：GGAAGGTAAAAGTCAAGG，下游引
物为 ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。 扩增程序
为：94℃预变性 4 min；94℃变性 45 s，55℃退火 45 s，
72 ℃延伸 45 s，36 个循环；最后 72 ℃延伸 5 min。 采
用长沙安比奥生物试剂有限公司的 DNA 回收试剂
盒进行PCR 产物回收，继而将回收产物与 pMD18－
T 质粒在 16 ℃下连接 12 h，获得重组质粒后转化至
大肠杆菌（Escherichia coil）菌株 DH5α 中，菌株来
自湖南大学生物学院。 在获得重组菌斑后，采用长
沙安比奥生物试剂有限公司的质粒提取试剂盒提
取重组质粒，进一步经双酶切鉴定后，将质粒送上
海生工生物工程技术服务有限公司测序，测得序列
经 NCBI网站比对确认后，将序列在 Gen Bank 上登
录，获得登录号。 以 NCB网站提供的甘薯［Ipomoea
batatas（L．）Lam．］ITS 序列为外类群，采用 MEGA 6．0
软件对 11份种质进行聚类分析。
2 结果与分析
2．1 植物学性状比较
供试葛属种质的 9 个形态学性状比较情况见
表 2，叶片形态学比较情况见图 1。 从表 2 可见，11
个不同来源的种质其茎杆都比较粗壮，颜色主要有
绿色、黄绿色和淡绿色。从图 1可见，11个种质叶上
被毛疏密各不相同，颜色以白色、黄褐色和淡绿色
为主；叶片互生，叶型主要为卵圆型，叶片颜色以绿
色、淡黄色和黄绿色为主；小叶主要有三裂、两裂 2
种类型，下裂深浅差异较明显。 其中，广东合水粉葛
叶色黄绿，被茸毛少且短，三出复叶，小叶全缘；湖
南常德粉葛叶黄褐色，叶片较细且窄，三出复叶，小
940
第 4 期
叶多三裂且较深，叶柄较长，叶尖端较长且均匀；广
西藤县粉葛叶片绿色，被白色茸毛，但较少，三出复
叶，小叶多三裂且裂浅；重庆合川粉葛叶淡绿色，三
出复叶，叶缘三裂，叶片宽大肥厚，叶背面有少量绿
茸毛；云南蒙自粉葛叶绿色微泛黄，叶大而肥厚，小
叶两裂，叶尖，叶柄细长，基部膨大明显；江西德兴
超级粉葛叶大呈盾形，绿色，不带齿，叶面少毛，叶
柄长；湖南大卫粉葛叶黄绿色，叶片较宽大，三出复
叶，小叶全缘，被黄褐色茸毛，叶柄较长，叶脉明显；
湖南通道山葛叶极具特色，卵圆形，浓绿色，三出复
叶，很少下裂，被毛少；重庆武隆苦葛羽状复叶，具 3
小叶，小叶斜卵形，三裂，且裂深；湖南会同山葛叶
卵圆形，淡绿色，叶柄粗短，被毛少，叶脉明显；湖南
常宁野葛叶淡绿色，宽大，被毛少，三出复叶，小叶
有时两裂，有时三裂，叶脉明显，主脉粗。 由此可见，
葛属不同种质的叶片形态差异明显。
2．2 植物学性状聚类分析
供试葛属 11 个种质基于植物形态学的 MP 聚
类图见图 2。 从图 2 可以看出，11 个葛属材料之间
遗传距离相距较远，以相对遗传距离 15 为界，可将
11 个种质分为 4 个组，分别与以上不同的形态类型
相对应，如湖南常德粉葛、广西藤县粉葛、重庆合川
粉葛、重庆武隆苦葛、湖南常宁野葛可聚为一组，其
中有 3 种属于粉葛， 其性状表现变化不是很大；广
东合水粉葛、湖南通道山葛、湖南会同山葛可聚为
一组，湖南通道山葛、湖南会同山葛都属于山葛，且
都来源于湖南省，由于在同一小范围地区内受气候
环境影响变化不大，导致遗传性状变化很小，所以
性状极其相似；云南蒙自粉葛、江西德兴超级粉葛、
湖南大卫粉葛都各为一组，可能是由于来源不同的
地域，地理间隔较远，气候温差、土壤成分、日照长
短差异较大影响了粉葛的植物学性状所致。
2．3 葛属 11个种质基于 rDNA ITS 序列的亲缘关
系分析
基于 rDNA ITS 序列构建的葛属植物 MP 系统
发育树见图 3。 从图 3 可以看出，湖南常德粉葛、广
西藤县粉葛、重庆合川粉葛、云南蒙自粉葛、重庆武
隆苦葛聚在了一起，亲缘关系较近，可归为一类。 湖
南常宁野葛、江西德兴超级粉葛聚在了一起，亲缘
关系最近，可归为第二类。 广东合水粉葛、湖南大卫
粉葛、湖南通道山葛、湖南会同山葛与其他葛相距
较远，可各自成为一类。
表 2 不同来源葛的植物学性状
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
名称
广东合水粉葛
湖南常德粉葛
广西藤县粉葛
重庆合川粉葛
云南蒙自粉葛
江西德兴超级粉葛
湖南大卫粉葛
湖南通道山葛
重庆武隆苦葛
湖南会同山葛
湖南常宁野葛
叶色
黄绿色
黄褐色
绿色
淡绿色
黄绿色
绿色
黄绿色
绿色
绿色
淡绿色
淡绿色
叶大小
小
小
小
较大
大
大
较大
小
大
较大
大
茎粗细
较粗
较粗
粗
粗
粗
粗
细
细
粗
粗
粗
茎节长短
长
长
较长
长
长
短
长
长
长
长
长
茎被毛颜色
白色
黄褐色
白色
淡黄色
红褐色
黄褐色
黄褐色
淡黄色
黄褐色
白色
黄褐色
茎被毛密度
稀
密
较密
密
较密
较密
较密
稀
密
稀
稀
茎颜色
淡黄色
黄褐色
绿色
淡绿色
淡绿色
绿色
黄绿色
绿色
绿色
绿色
黄绿色
节间膨大
不明显
明显
明显
明显
不明显
明显
不明显
不明显
明显
不明显
明显
芽粗细
细
较粗
粗
较粗
粗
粗
粗
细
粗
细
粗
1．广东合水粉葛；2．湖南常德粉葛；3．广西藤县粉葛；4．重庆合川粉
葛；5．云南蒙自粉葛；6．江西德兴超级粉葛；7．湖南大卫粉葛；8．湖南
通道山葛；9．重庆武隆苦葛；10．湖南会同山葛；11．湖南常宁野葛。
图 1 葛属 11 个种质叶片形态学比较
图 2 葛属的 11 个种质基于形态学的 MP 聚类图
重庆合川粉葛
重庆武隆苦葛
广西藤县粉葛
湖南常德粉葛
湖南常宁野葛
湖南大卫粉葛
江西德兴超级粉葛
广东合水粉葛
湖南通道山葛
湖南会同山葛
云南蒙自粉葛
0 5 10 15 20 25
蒋向辉等：葛属植物基于形态学和 rDNA ITS 分类的一致性比较研究 941
湖 北 农 业 科 学 2016 年
图 3 基于 rDNA ITS 序列构建的葛属 11 个种质的
MP 系统发育树
广西藤县粉葛
重庆武隆苦葛
湖南常德粉葛
重庆合川粉葛
云南蒙自粉葛
广东合水粉葛
湖南大卫粉葛
江西德兴超级粉葛
湖南常宁野葛
湖南通道山葛
湖南会同山葛
甘薯
2．4 形态学和 rDNA ITS分类的一致性比较研究
从形态学和 rDNA ITS 分类的比较分析可以看
出，湖南常德粉葛、广西藤县粉葛、重庆合川粉葛、
重庆武隆苦葛在 2 种方法中都能聚为一组，并且前
3 种都属于粉葛，其性状变化不是很大，重庆武隆苦
葛与粉葛不仅形态相近，且在遗传上差异较小，2 个
种之间亲缘关系相近。 湖南常宁野葛与江西德兴超
级粉葛在遗传上有一定的相似性，但形态上差异较
大，可能与生长环境的生态因素有一定的关系。 总
的来说，基于分子水平上的分类结果与基于形态学
性状的分类结果之间有较大的相似性，但也存在一
定的差异，这种差异可能与性状受环境与基因 2 个
因素共同的影响有关。 不过基于形态学性状的聚类
结果受环境的影响较大，而采用分子水平的分类是
以能够稳定遗传的 DNA 序列为基础， 因此分子水
平聚类结果比形态学结果更可信。
3 小结与讨论
依据形态学特征对葛的分类鉴定不仅与葛的
生长时期、生长环境等客观因素有关，而且形态学
性状的判断和选取受主观因素的影响很大，因此基
于形态学性状特征对葛进行分类分析和鉴定存在
很大的局限性，尤其是对于某些形态学特征极为不
明显或相近的葛，就很难准确的进行分类。 有学者
在研究基于形态学和分子生物学分类比较时发现，
在形态上相似的情况下， 内部结构也有较大的区
别，如杨祝良 ［10］对我国部分鹅膏菌标本与欧美相似
种的标本进行比较研究后，发现二者虽在外部形态
上有相似之处， 但在内部结构上存在较大差异，并
且在分子生物学方面也同样存在较大的差异。
本试验结果也表明，基于传统形态特征的分类
与基于 rDNA 的 ITS 序列分类结果有很大的差异。
如基于 ITS 序列构建的葛属 11 个种质的 MP 系统
发育树表明，湖南常德粉葛、广西藤县粉葛、重庆合
川粉葛、云南蒙自粉葛、重庆武隆苦葛亲缘关系较
近；而根据葛属的 11 个种质形态学聚类图，它们中
的云南蒙自粉葛关系比较远。另外，从基于 ITS序列
构建的葛属植物 MP 系统发育树可知， 广东合水粉
葛、湖南大卫粉葛、湖南通道山葛、湖南会同山葛与
其他葛相距较远， 且相互之间也存在很大差异；而
根据形态学的 MP 聚类图，广东合水粉葛、湖南通道
山葛、湖南会同山葛可聚为为一组；这说明形态学
性状的选取有待于改进，应更全面、更准确地选取
性状。 在不具备分子生物学相关条件的情况下，对
植物的分类鉴别主要是借助植物学形态特征之间
的共性与差异来区分， 而形态学特征具有易变、模
糊和易混淆等多方面的缺陷，在分类过程中常带有
一定的主观性和局限性。现在以 rDNA的ITS序列为
基础的分类与鉴别研究越来越多，如基于形态特征
和 ITS 序列对 7 个鹅膏菌属菌株的分类鉴定 ［11］、
rDNA 的 ITS 序列在被子植物系统与进化研究中的
应用［7］、ITS 序列鉴定西红花与其易混的中药材 ［12］、
基于 ITS序列的东亚当归属植物的分类学研究［13］等
等；上述研究表明，基于分子生物学层面的分类更
科学、更可靠，虽然还有许多需要完善的地方，但这
是物种分类发展的主要方向。
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