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doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2015． 07． 013
葛属 11 份种质基于核 rDNA ITS序列的亲缘关系分析
蒋向辉1，刘良科2，佘朝文2
(1．凯里学院化学与材料工程学院，贵州凯里 556011;2．怀化学院生命科学系，湖南怀化 418008)
摘要:在对葛属 11 份种质核 rDNA ITS序列克隆测序的基础上，用 MEGA 6． 0 软件对 11 份种质及其近缘种进行
聚类分析。结果表明，葛属 11 份种质的 ITS序列在长度和 G + C 含量上相差较大，长度变化在 669 ～ 765 bp 之间，最
大相差 96 bp，G + C含量在 52． 98% ～ 59． 89%，最大相差 6． 91%;藤县粉葛(Tengxian Pueraria thomsonii)、常德粉葛
(Changde Pueraria thomsonii)、武隆苦葛(Wulong Pueraria peduncularis)这 3 个种的 ITS序列特点相近，G + C 含量都在
53． 74%左右，长度小于 700 bp，在发育树上聚为 1 类，种质亲缘关系很近;合川粉葛(Hechuan Pueraria thomsonii)和蒙
自粉葛(Mengzi Pueraria thomsonii)ITS序列相似性较高，G + C含量与序列长度都相差不大，在发育树上聚为 1 类;通
道山葛(Tongdao Pueraria montana)聚为 1 类，与其他物种存在较远的距离;德兴宋氏超级粉葛(Dexing Soong Super
Pueraria thomsonii)与常宁野葛(Changning Pueraria lobata)ITS序列和 G + C含量一样，在发育树上聚为 1 类，但与会同
山葛(Huitong Shange)、大卫粉葛(Dawei Pueraria thomsonii)处于不同的分支上，亲缘关系相对较远。
关键词:葛属;ITS序列;亲缘关系;聚类分析
中图分类号:S567． 902． 4 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2015)07 － 0046 － 04
收稿日期:2014 － 07 － 31
基金项目:贵州省材料物理与化学特色重点学科建设基金(编号:黔
教高发［2011］208);贵州省特色重点实验室建设基金(编号:黔财
教［2012］225)。
作者简介:蒋向辉(1974—)，男，湖南安化人，博士，副教授，主要从事
药用植物成分研究。E － mail:jxfei789@ 163． com。
葛(Pueraria lobata)别称葛藤、葛麻叶，系豆科碟形花亚
科(Phaseolease)葛属植物，最先产于中国和日本的琉球地
区［1］，中国最早关于葛的记载是在《诗经》和《神农本草经》
上。世界上葛有 20 个种，我国有 12 个种，其中常被作为药用
的有 8 个种，我国除新疆维吾尔自治区、西藏壮族自治区和青
海回族自治区 3 个省份外，其他省份都有葛分布的相关报道，
产量高和资源比较丰富的种类有野葛与粉葛［2］。葛茎是我
国南方一些省(区)的一种常食蔬菜，葛根含异黄酮成分葛根
素、葛根素木糖苷、大豆黄酮、大豆黄酮苷及 β －谷甾醇、花生
酸，又含多量淀粉，有解表退热、生津止渴、止泻的功能，能改
善高血压、糖尿病病人的项强、头晕、头痛等症状［3］。葛根毒
性低、药源广、价格低，因此，加强对葛根的新药和保健品开发
具有良好的前景。
根据 2010 版《药典》规定，野葛和粉葛都可以作为葛的
正品使用，但它们是同科不同属的 2 种植物，有效成分含量差
异较大，在开发利用中对其来源的均一性难以保证，因此，采
用合适的标记对葛种质资源进行亲缘关系分析具有重要的意
义。葛属不同种之间形态差异较小，根据形态学来判定葛属
—64— 江苏农业科学 2015 年第 43 卷第 7 期
种质资源之间的亲缘关系存在较多的争议，目前，国内在分子
水平上鉴定葛属种质之间亲缘关系的研究报道尚少。本研究
基于 ITS序列对葛属 11 份种质进行聚类分析，在分子水平上
进一步鉴定葛属 11 份种质的亲缘关系，为葛属不同来源的种
质区分与鉴定提供参考。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
试验所用材料为葛属不同来源的 11 种种质(表 1)。
表 1 供试材料及来源
编号 类群名称 采集地 ITS 序列登录号
1 通道山葛(Tongdao Pueraria montana) 广东佛山 JX2334982
2 常德粉葛(Changde Pueraria thomsonii) 湖南常德 JX2334993
3 藤县粉葛(Tengxian Pueraria thomsonii) 广西藤县 JX2335003
4 合川粉葛(Hechuan Pueraria thomsonii) 重庆合川 JX2335012
5 蒙自粉葛(Mengzi Pueraria thomsonii) 云南蒙自 JX2335024
6 德兴宋氏超级粉葛(Dexing Soong Super Pueraria thomsonii) 江西德兴 JX2335035
7 大卫粉葛(Dawei Pueraria thomsonii) 湖南长沙 JX2335043
8 藤县山葛(Tengxian Pueraria montana Merr) 湖南通道 JX2335052
9 武隆苦葛(Wulong Pueraria peduncularis) 重庆武隆 JX2334984
10 会同山葛(Huitong Shange) 湖南会同 JX2335242
11 常宁野葛(Changning Pueraria lobata) 湖南常宁 JX2334564
1． 2 试验方法
采用改良的 CTAB 法提取葛属 11 份种质基因组 DNA。
用于扩增的 ITS 序列引物参照 White 等设计的 ITS 通用引
物［4］，上游引物为 ITS5:GGAAGGTAAAAGTCAAGG，ITS4:
TCCTCCGCTTATTGATATGC。扩增程序:94 ℃预变性 3 min;
94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，36 个循环;72 ℃延伸 5 min。
PCＲ产物回收采用长沙安比奥生物试剂有限公司生产的
DNA回收试剂盒，将回收产物与 pMD 18 － T 质粒相连，重组
质粒转化进入大肠杆菌(E． coil)DH5α(菌株来自湖南大学
生物学院);获得重组菌斑，采用长沙安比奥生物试剂有限公
司生产的质粒提取试剂盒提取重组质粒，在双酶切鉴定后送
上海生物工程有限公司进行测序，测得序列经比对确认，将序
列在 GENEBANK上登录，获得登录号。根据获得的序列，以
NCB网站已有的甘薯［Ipomoea batatas (L．)Lam．］ITS 序列
为外类群，利用 MEGA 6． 0 软件，分别采用 MP 法、NJ 法和
UPGMA法 3 种方法对 11 份种质及其近缘种进行聚类分析。
2 结果与分析
2． 1 ITS序列分析
一般情况下，每个物种 DNA 中 G + C 的含量是特定的，
能够反映属种之间的亲缘关系，DNA中 G + C含量越高，其变
异也越小;亲缘关系越近，不同物种之间 DNA 中 G + C 含量
的差别越小［5］。由表 2 可见，11 份种质 ITS 序列 G + C 含量
有很大的差异，G + C含量在 52． 98% ～ 59． 89%之间，最大相
差 6． 91 百分点，其中大卫粉葛 G + C 含量相对最高，ITS1 序
列中G + C含量为 54． 08% ～64． 05%，ITS2 序列中 G + C 含量
为 51. 69% ～64． 19%，ITS1 序列 G + C 含量比 ITS2 序列变化
稍大;序列长度波动范围也较大，大小在 669 ～ 765 bp，相差
96 bp，其中，通道山葛的 ITS序列相对最长;德兴宋氏超级粉
葛和常宁野葛 G + C 含量和序列长度相同，G + C 含量为
54. 58%，序列长度为 731 bp;常德粉葛和蒙自粉葛 G + C 含
量和序列长度相似。从序列长度来看，ITS1 序列的变异范围
在 242 ～ 331 bp之间，ITS2 序列的变异范围在 178 ～ 279 bp，
5． 8S序列相对保守，序列长度在 169 bp左右。
2． 2 系统发育分析
由表 3 可见，葛属 11 份种质和外类群植物甘薯的遗传距
离为 0． 002 ～ 0． 792，藤县粉葛与武隆苦葛、德兴宋氏超级粉
葛与常宁野葛、藤县山葛与会同山葛的遗传距离均最小，为
0． 002，相互间的亲缘关系最为接近;其次是常德粉葛与武隆
苦葛，遗传距离为 0． 004;遗传距离最大的是蒙自粉葛与番
薯，达到 0． 792，这两者的亲缘关系相对最远。
2 ． 2 ． 1 基于葛属植物 ITS序列构建的MP系统发育树 以
表 2 不同种质 ITS序列长度和 G +C含量
编号 物种
ITS
长度(bp)G + C含量(%)
5． 8S长度
(bp)
ITS1
长度(bp) G + C含量(%)
ITS2
长度(bp) G + C含量(%)
1 通道山葛 703 57． 79 169 291 61． 51 243 61． 32
2 常德粉葛 685 53． 72 168 272 57． 35 279 55． 20
3 藤县粉葛 700 53． 43 170 270 56． 30 232 55． 17
4 合川粉葛 669 54． 41 169 269 59． 48 231 54． 55
5 蒙自粉葛 687 52． 98 169 275 56． 73 231 54． 98
6 德兴宋氏超级粉葛 731 54． 58 168 247 62． 35 237 52． 74
7 大卫粉葛 738 59． 89 168 242 64． 05 229 64． 19
8 藤县山葛 765 56． 86 168 247 60． 73 236 60． 17
9 武隆苦葛 673 54． 09 170 331 54． 08 232 55． 17
10 会同山葛 750 57． 60 168 246 61． 38 236 60． 17
11 常宁野葛 731 54． 58 168 247 62． 35 178 51． 69
—74—江苏农业科学 2015 年第 43 卷第 7 期
表 3 葛属不同种质与外类群植物的遗传距离
编号
遗传距离
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1
2 0． 084
3 0． 082 0． 005
4 0． 110 0． 037 0． 035
5 0． 278 0． 222 0． 215 0． 175
6 0． 204 0． 221 0． 224 0． 240 0． 388
7 0． 084 0． 110 0． 112 0． 141 0． 323 0． 189
8 0． 084 0． 099 0． 101 0． 130 0． 300 0． 131 0． 058
9 0． 084 0． 004 0． 002 0． 037 0． 217 0． 226 0． 114 0． 103
10 0． 082 0． 097 0． 099 0． 128 0． 300 0． 129 0． 056 0． 002 0． 101
11 0． 204 0． 221 0． 224 0． 240 0． 388 0． 002 0． 189 0． 131 0． 226 0． 129
12 0． 546 0． 568 0． 569 0． 594 0． 792 0． 674 0． 564 0． 586 0． 572 0． 583 0． 674
注:1 为通道山葛;2 为常德粉葛;3 为藤县粉葛;4 为合川粉葛;5 为蒙自粉葛;6 为德兴宋氏超级粉葛;7 为大卫粉葛;8 为藤县山葛;9 为武
隆苦葛;10 为会同山葛;11 为常宁野葛;12 为甘薯。
甘薯 ITS序列为外类群，用软件 Clustal X1． 8 对供试的 14 份
种质和甘薯的 ITS进行两两比对和多重比对，空位按缺失处
理，ITS 序列总长度为 853 bp，总变异位点数为 429，占
50. 3%，信息位点数为 199，占 23． 3%。采用自助引导法测试
系统发育树，重复 1 000 次，判断每个分支的信誉度，选择最
简约树。由图 1 可见，葛属 11 种植物大致分为 2 支，一个分
支有藤县粉葛、武隆苦葛、常德粉葛、合川粉葛、蒙自粉葛、通
道山葛 6 种植物构成;另一分支由大卫粉葛、德兴宋氏超级粉
葛、常宁野葛、藤县山葛、会同山葛 5 种植物构成，分别获得
68%和 43%的自展支持率。第 1 分支又分化为 2 个分支，即
藤县粉葛、武隆苦葛、常德粉葛、合川粉葛、蒙自粉葛构成一
支，通道山葛单独构成另一支，自展支持率分别为 94% 和
100%;第 2 支也分化出 2 个分支，德兴宋氏超级粉葛、常宁野
葛、藤县山葛、会同山葛构成一支，大卫粉葛单独构成另一支，
获得的自展支持率分别为 64%和 43%;广西藤县粉葛与重庆
武隆苦葛、江西德兴宋氏超级粉葛与湖南常宁野葛、重庆合川
粉葛与云南蒙自粉葛的亲缘关系相对最近。
2． 2． 2 基于葛属植物的 ITS序列构建的 NJ系统发育树 由
图 2 可见，NJ系统发育树各分支自展支持率略高于 MP系统
发育树，其可信度比 MP 法相对更高;葛属 11 种植物也大致
分为 2 支，除湖南大卫粉葛单独聚为 1 支外，其他物种聚为 1
支，其中，其他 10 份葛属植物又分化出 2 个分支，藤县粉葛、
武隆苦葛、常德粉葛、合川粉葛、蒙自粉葛、通道山葛 6 个物种
聚在一个分支，德兴宋氏超级粉葛、常宁野葛、藤县山葛、会同
山葛 4 个物种聚在另一个分支。
2． 2． 3 基于葛属植物 ITS序列构建的 UPGMA系统发育树
由图 3 可见，从外类群甘薯出发分出 2 个大支，除云南蒙自粉
葛单独为 1 支外，其他 10 种葛属植物聚为 1 支，其中，后者又
分化出 2 支，江西德兴宋氏超级粉葛、湖南常宁野葛 2 种聚为
1 支，其他 8 种葛属植物聚为 1 支;8 种葛属植物又可以分出
2 小支，会同山葛、藤县山葛、大卫粉葛、通道山葛聚为 1 小
支，会同山葛与藤县山葛的距离较近，与大卫粉葛次之，与通
道山葛聚相对较远，合川粉葛、藤县粉葛、武隆苦葛、常德粉葛
聚为 1 小支，武隆苦葛与常德粉葛距离最近，与藤县粉葛次
之，与合川粉葛相距较远。
3 结论与讨论
基于 ITS 序列分析和聚类分析认为，藤县粉葛、常德粉
葛、武隆苦葛这 3 种的 ITS 序列特点相近，G + C 含量都在
53． 74%左右，长度小于 700 bp，种质亲缘关系很近;合川粉葛
和蒙自粉葛 ITS序列相似性较高，且 G + C 含量与序列长度
都相差不大，在 MP发育树上聚为 1 类，而通道山葛与其他物
种存在较远的距离;德兴宋氏超级粉葛与常宁野葛的 ITS 序
列和 G + C含量一样，在 NJ发育树中，两者聚为 1 类，同时与
会同山葛、大卫粉葛处于不同的分支上，相互间亲缘关系较
远。而从 UPGMA系统发育树中发现，合川粉葛和蒙自粉葛
并不聚为 1 类，两者的距离相隔很远，与 MP发育树聚类有所
不同，需要进一步探讨。
植物属内种间ITS序列长度比较保守，相差的碱基数并
—84— 江苏农业科学 2015 年第 43 卷第 7 期
不大［6］。马小军等研究发现，分别产自黑龙江和朝鲜的栽培
人参，其 ITS区间序列完全一致，与产自湖北的栽培人参 ITS
序列只有 3 个碱基的差异［7］;陈随清等对 7 种不同栽培类的
山茱萸 ITS序列进行比较发现，有 4 个种的 ITS 序列完全一
致，剩余的 3个种仅有微小差异［8］;申彦晶等对 9 个居群的白
木香 ITS序列进行比较发现，有6个居群 ITS序列完全一致，其
余 3个居群 ITS序列有 6个位点的变异［9］。本试验结果表明，
葛属类群 11份种质其 ITS序列在长度和 G + C 含量上相差较
大，长度变化在 669 ～765 bp之间，最大相差 96 bp，G + C 含量
在 52． 98% ～59． 89%，最大相差 6． 91 百分点。被子植物中的
序列长度也相对保守，一般不超过 700 bp，但由于该序列变异
速度较快，能够提供较充足的讯息位点与变异位点，而较多的
信息位点可以提高分子系统研究的准确性。大量研究表明，
ITS序列是对被子植物进行系统进化研究较为理想的分子标
记，且对属内物种的系统进化研究也有重要的参考价值［10］。
本试验应用 3 种不同的系统发育树构建方法。最大简约
法(MP)假设物种的进化过程是最简约的，在有很多选择的
时候，进化最少的分支是可靠性最好的系统发育分支，该方法
用于近缘植物类群的分析，一般情况下都能给出较准确的简
约数，但对进化时间较早的类群，简约法就会得出不准确的结
果。邻接法(NJ法)是使用原始数据距离矩阵的双对比来构
建系统发育树的，具有简洁直观、结果稳定等优点，但不足的
是，在原始数据转变为距离矩阵时，可能会丢失某些数据信
息。采用不周聚类法(UPGMA 法)获得的发育树，可以真正
反映物种间的进化关系［11］，但在某些情况下，UPGMA法会随
着拓扑结构序列输入顺序的不同，系统发育树而发生变化，往
往很难断定哪种进化树较为接近真实关系。因此，在对葛属
11 份种质进行亲缘关系分析时，应综合 3 种聚类方法计算获
得的结果才能更为可靠。
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