全 文 ：园艺学报，2015，42 (12)：2455–2468.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0468；http：//www. ahs. ac. cn 2455
收稿日期：2015–10–09；修回日期：2015–12–11
基金项目：国家星火计划项目（2012GA701014）；宁波市农业社会发展重点项目（2012C10010）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：wangzhl01@163.com；Tel：0574-88861001）
樱属植物种质资源系统鉴定方法的研究
付 涛，王志龙*，林 立，林乐静
（宁波城市职业技术学院，宁波市园林植物开发重点实验室，浙江宁波 315502）
摘 要：以 11株野生樱属植物为研究材料，观测其花、叶和果实等主要植物学特征，采用 SSR分子
标记技术分析其亲缘关系，采用 DNA条形码技术进行分子鉴定。形态学观测结果表明，编号为 1、3、4、
7、8和 9号的单株彼此间差异相对较小，果实均为紫黑色，但 1、4和 8号的萼筒为管状且 1和 4号的叶
柄覆有较多短绒毛；5、6和 11号彼此间差异相对较小，果实均为紫红色，但 6号萼片明显长于萼筒，11
号花柱上覆有较多绒毛；2和 10号在性状上显著异于其他植株。初步判断 1和 4号为毛叶山樱，3、7和
9号为山樱，6号为尾叶樱，11号为浙闽樱，10号可能为黑樱桃，2、5和 8号待定。SSR聚类分析结果
表明，形态上较接近的彼此间亲缘关系较近，同时推测出 5号可能是浙闽樱和尾叶樱的变种，8号可能亦
属于山樱。DNA条形码分析得出 ITS的种间变异程度较大，可作为鉴定樱属植物的标准条形码。聚类结
果与 SSR 聚类结果基本一致，序列比对后得出 8 号是山樱或山樱变种，5 号应该是浙闽樱和尾叶樱的变
种，由于 NCBI数据库信息缺失，故 2号无法鉴别出，可能是新种或变种，有待后续研究。此外研究还发
现，2和 5号可能是优良的变种，具有较高的观赏价值，后续有待进一步研究。
关键词：樱属植物；SSR；DNA条形码；物种鉴定
中图分类号：S 68；S 662 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）12-2455-14

Study on the Identification Method of a System of the Cerasus Plants
Germplasm Resources
FU Tao，WANG Zhi-long*，LIN Li，and LIN Le-jing
（Key Laboratory of Plant Development Ningbo and City College of Vocational Technology，Utilization of Ningbo，Ningbo，
Zhejiang 315502，China）
Abstract：Eleven plants（#1 to #11）of Cerasus were selected to study the botanical characters of
organs including flower，leaf and fruit. The genetic relationships and species identification were analyzed
through simple sequence repeat（SSR）molecular marker technique and DNA barcode technology. The
morphological result showed that there was little difference among #1，#3，#4，#7，#8 and #9. Their fruit
colors were all in purple-black，while calyx tube shapes of #1，#4 and #8 were tubular and petioles of #1
and #4 had more short hair. There was no difference in fruit color in #5，#6 and #11，which was purple-red.
But #6 had longer sepal than calyx tube，#11 had more short hair. In addition，the result indicated that #2
and #4 were significantly different from other traits in phenotype. We predicted that #1 and #4 were
Cerasus serrulata var. pubescen，#3，#7 and #9 were C. serrulata，#6 was C. dielsiana，#11 was

Fu Tao，Wang Zhi-long，Lin Li，Lin Le-jing.
Study on the identification method of a system of the Cerasus plants germplasm resources.
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C. schneideriana，#10 might be C. maximowiczii，while #2，#5 and #8 were uncertain. The results of SSR
clustering analysis showed that more similar in morphology，the closer genetic relationship these plants
had. #5 was supposed to be a variation of C. schneideriana or C. dielsiana and #8 might be C. serrulata.
DNA barcode analysis revealed that ITS sequence could be defined as a standard barcode in C.
identification because ITS sequences were various from species greatly. The ITS clustering results were
identical with SSR clustering. Sequence alignments proved #8 was C. serrulata or variation，#5 was
supposed to be the variation of C. schneideriana or C. dielsiana，but #2 was still unknown due to the lack
of information from NCBI database. Whether #2 is a new species or a variation requires further studies.
Moreover，#2 and #5 might be the variations with higher ornamental value. This research provided an
important reference for Cerasus identification，species classification and selection through morphological
classification，SSR molecular marker and DNA barcoding technology.
Key words：Cerasus；SSR；DNA barcode；species identification

樱属（Cerasus）植物在中国资源十分丰富，约 48个种及 8个变种（Li & Bruce，2003），远超
日本及其他国家，尤以野生资源为主。然而中国樱属植物种质资源研究尚处于起步阶段，很多野生
资源还未得到充分开发和利用。目前国内观赏类樱花大多从日本引种，但适应性较差，寿命短，而
且还容易感染病虫害，因此亟需培育出适应性和抗性较强的自主樱花品种。
樱属植物种间杂交容易，品种数量众多，而且有些品种性状差异较小，同物异名或同名异物现
象较为严重，传统形态分类很难快速准确将其区分。SSR分子标记具有多态性高、重复性好、共显
性遗传、技术简单和特异性强等优点，目前已成功地应用于品种鉴定、物种分类系统比较以及作为
构建遗传图谱的重要工具，此外还作为一种重要的辅助育种手段（Adam-Blondon et al.，2004；
Martinez et al.，2006；王华忠 等，2008）。近年来，DNA条形码技术在很多动物分类群中得到了成
功应用（Hebert et al.，2004；Hajibabaei et al.，2006；Yoo et al.，2006），细胞色素 C氧化酶Ⅰ基因
（简称 COI基因）已被作为动物通用条形码。但 COI基因在植物中的进化速率远慢于动物（Evans et
al.，2007），为了寻求一种通用的植物条形码，人们进行了积极探索，已经提出了多种条形码片段或
组合方案，但目前尚未达成明确、统一的共识（Kress et al.，2005；Newmaster et al.，2006；Lahaye
et al.，2008）。
浙江省是樱属植物天然分布区之一，拥有较为丰富的野生资源，根据《浙江植物志》记载，浙
江省内有浙闽樱、迎春樱、山樱、华中樱、钟花樱、黑樱桃等分布，其中绝大部分处于野生状态，
人工驯化品种极其稀少。
本研究中初步以 11株野生中国樱属植物为试验材料（部分植株具有长势较好、抗病性较强、花
期早、花期长、花色艳丽、花茂密等特性，具有较高的研究价值），对其进行植物学、分子生物学和
遗传学等方面的研究，旨在为中国樱属植物的快速鉴定提供一定的理论依据，同时也为新种（变种、
新品种）的鉴定提供一种较为准确的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
2010—2014年对浙江宁波奉化市四明山以及宁波鄞州区浙江万里学院校园内（东经 121.56，北
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表 1 DNA条形码引物名称及其序列
Table 1 Primer names and sequences of DNA barcoding
名称 Name 序列 Sequence（5′–3′）
ITS

ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATG
ITS5：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
Sbel Sbel-F：GCTCCACGAATATATGAGGCACATG
Sbel-R：TTCCATGAAATTTCCTTCATTGACCA
trnH-psbA trnH：CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
psbA：GTTATGCATGAACGTAATGCTC
纬 29.86）11株野生樱属材料（编号分别为 1 ~ 11号）进行了跟踪观察，于 2014年 3月下旬至 4月
中旬采集 1年生枝条前端健康无病害的幼叶，于冰盒中立即运回实验室–80 ℃保存，用于分子试验。
1.2 花、叶和果实等主要性状的观测
2010—2014年每年的 3至 6月定期对 11株野生樱属植物的花、叶片和果实等主要的植物学性
状进行详细的观测和记录，待果实成熟后，11份樱属植物各选果 50个测单果质量。
1.3 SSR扩增
参照崔鹏等（2013）所述的 CTAB法加以改良，用于樱属植物的 DNA提取，1.5%琼脂糖凝胶
电泳检测，Eppendorf 公司生产的 Bio-Photometr 核酸检测仪检测 DNA 浓度和纯度，根据计算所得
的 DNA浓度，将 DNA样品溶液用 TE稀释成 50 ng · μL-1。
采用 20 μL反应体系，其中含 Easy TaqTM DNA Polymerase for PAGE 10 μL（含有 Taq酶、dNTP
和优化的反应缓冲液），模板 DNA 1 μL（50 ng · μL-1），引物对各 0.8 μL（5 μmol · μL-1），ddH2O 7.4
μL。Easy TaqTM DNA Polymerase for PAGE以及Marker（Trans2k DNA marker）均购自 Trans Gen
Biotech公司，24对引物序列由上海生工合成。PCR扩增程序为：94 ℃预变性 4 min；94℃变性 30
s，50 ~ 60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，35个循环；最后 72 ℃延伸 7 min。PCR反应在 Eppendorf
Master cycler pros循环仪上进行。然后 PCR产物经变性处理后取 5 μL进行点样，6%聚丙烯酰胺凝
胶电泳，银染显色，胶干后用数码相机拍照保存。
1.4 DNA条形码
采用 50 μL反应体系，其中含 Easy TaqTM DNA Polymerase for PAGE 25 μL（含有 Taq酶、dNTP
和优化的反应缓冲液），模板 DNA 1 μL（50 ng · μL-1），引物对各 1.5 μL（5 μmol · μL-1），ddH2O 21 μL。
本课题组前期运用核基因序列 ITS、Sbel和叶绿体序列 rbcL、matk、trnH-psbA等对中国樱属 28个
植物进行了扩增、测序，发现 ITS、Sbel 和 trnH-psbA 变异程度较大，故本试验中选取 ITS、Sbel
和 trnH-psbA进行 PCR扩增，引物见表 1。ITS扩增程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，56 ℃
退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，35个循环；最后 72 ℃延伸 2 min。Sbel扩增程序：94 ℃预变性 2 min；
94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，32个循环；最后 72 ℃延伸 2 min。trnH-psbA扩
增程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，
58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，30个循环；
最后 72 ℃延伸 2 min。PCR反应在 Eppendorf
Master cycler pros循环仪上进行。直接取 5 μL
PCR 产物进行点样，进行琼脂糖凝胶电泳
（1.5%）。Marker为 Trans2k DNA marker。PCR
产物送到上海桑尼生物科技有限公司进行双向
测序。
1.5 数据分析
SSR分子标记数据处理：根据各分子标记在相同电泳迁移率（相同分子量片段）的有无，统计
得到所有位点的二元数据，有扩增带记为 1，无带记为 0。利用软件 NTSYSpc2.10e进行 Jaccard相
似性分析，并通过非加权配对算术平均法（UPGMA）进行聚类分析，建立亲缘关系图。
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DNA条形码数据处理：利用 Chromatogram 2.3软件进行测序峰图的查看和序列文本的提取；利
用DNAman软件进行多序列对比、修剪；利用BLAST在线搜索页（http：//blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast.
cgi? PROGRAM = blastn & PAGE_TYPE = BlastSearch & LINK_LOC = blasthome）对测序结果进行初
步搜索，确认测序准确性；利用MEGA 4.0软件进行系统发育树构建。
2 结果与分析
2.1 主要性状差异分析
11株樱属植物在花、叶和果实等主要性状上均存在一定差异，详见表 2 ~ 表 4及图 1。
由表 2 可知，1 和 4 号在花的性状上差异较小；2、3、7、8 和 9 号彼此间差异较小，但 2、8
号萼筒为管状，3、7、9号为长钟形；5、6和 11号差异较小；10号与其余差异均较大（图 1，A）。
由表 3可知，1、3、4、7、8和 9号在幼叶颜色、叶形等质量性状上差异较小（但 1和 4号叶
柄上覆有较多短绒毛），在叶长、宽、叶柄长等数量性状差异较大；2、5、6、10 和 11 号在幼叶颜
色、叶形等质量性状上差异也较小，在叶长、宽、叶柄长等数量性状差异也较大（图 1，B）。
由表 4可知，5、6和 11号成熟核果均为紫红色，果柄绒毛较多，且平均单果质量差异较小；1、
2、3、4、7、8、9和 10号成熟核果均为紫黑色，果柄绒毛较少（图 1，C），其中 2、4和 10 号平
均单果质量显著高于 1、3、7、8和 9号。
此外，据 2010—2014年观测可知，2、5、6和 11号长势较好，花期较早（浙江省 3月上旬），
且抗病性较强，其中 2号花期较长，5号花粉红色、较密集，均有较高的观赏价值。

表 2 11株樱属植物花的主要性状差异
Table 2 The differences of main characters of the 11 samples of Cerasus plants flowers
材料
Material
花序
Inflorescence
花柄 Stalk 萼筒
Calyx
tube
花萼
Calyx
花柱 Style
苞片
Bract 长/cm
Length
绒毛
Villous
绒毛
Villous
与雄蕊相比
Compared with
stamen
1 伞形花序 Umbels 1.2 ~ 2.0 无
No
管状
Tubular
不反转
Not reverse
光滑无毛
Smooth and glabrous
等高
Same height
匙形
Cochlear
2 伞形总状花序或伞形花序
Umbellate raceme or umbels
1.5 ~ 2.0 较多
More
管状
Tubular
反转
Reverse
光滑无毛
Smooth and glabrous
略低
Slightly lower
匙形
Cochlear
3 伞形总状花序或伞形花序
Umbellate raceme or umbels
1.5 ~ 2.0 较多
More
长钟形
Long bell
不反转
Not reverse
光滑无毛
Smooth and glabrous
略低
Slightly lower
匙形
Cochlear
4 伞形总状花序或伞形花序
Umbellate raceme or umbels
1.5 ~ 2.0 无
No
管状
Tubular
不反转
Not reverse
光滑无毛
Smooth and glabrous
等高
Same height
匙形
Cochlear
5 伞形花序
Umbels
1.1 ~ 1.3 较多
More
钟形
Bell
反转
Reverse
光滑无毛
Smooth and glabrous
较高
Higher
匙形
Cochlear
6 伞形花序
Umbels
1.1 ~ 1.3 较多
More
钟形
Bell
反转
Reverse
光滑无毛
Smooth and glabrous
较高
Higher
匙形
Cochlear
7 伞形总状花序或伞形花序
Umbellate raceme or umbels
2.0 ~ 2.3 较多
More
长钟形
Long bell
不反转
Not reverse
光滑无毛
Smooth and glabrous
略低
Slightly lower
匙形
Cochlear
8 伞形总状花序或伞形花序
Umbellate raceme or umbels
0.8 ~ 1.0 较多
More
管状
Tubular
不反转
Not reverse
光滑无毛
Smooth and glabrous
略低
Slightly lower
匙形
Cochlear
9 伞形总状花序或伞形花序
Umbellate raceme or umbels
1.8 ~ 2.0 较多
More
长钟形
Long bell
不反转
Not reverse
光滑无毛
Smooth and glabrous
略低
Slightly lower
匙形
Cochlear
10 伞形总状花序
Umbellate raceme
1.5 ~ 1.8 较多
More
长钟形
Long bell
反转
Reverse
较多
More
较高
Higher
扇形
Sector
11 伞形花序
Umbels
0.8 ~ 1.0 较多
More
钟形
Bell
反转
Reverse
较多
More
较高
Higher
匙形
Cochlear

付 涛，王志龙，林 立，林乐静.
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表 3 11株樱属植物叶的主要性状差异
Table 3 The differences of main characters of the 11 samples of Cerasus plants blade
材料
Material
幼叶颜色
Young
leaf color
成龄叶Mature leaf 叶柄 Petiole
长/cm
Length
宽/cm
Width
形状
Shape
尖端
Tip
基部
Base
主脉颜色
Main veins
color
侧脉数
The number of
lateral veins
颜色
Color
长/cm
Length
1 绿色
Green
6.0 ~ 7.0 2.5 ~ 3.0 倒卵状椭圆形
Egg shaped
oval
渐尖
Gradually come
to a point
圆形
Circular
红色
Red
8 ~ 9对
8–9 pairs
红色
Red
1.5 ~ 2.0
2 绿色
Green
8.5 ~ 11.0 4.0 ~ 5.5 倒卵状椭圆形
Egg shaped
oval
渐尖
Gradually come
to a point
圆形
Circular
绿色
Green
9 ~ 10对
9–10 pairs
绿色
Green
2.0 ~ 2.5
3 绿色
Green
6.0 ~ 7.0 2.5 ~ 3.0 倒卵状椭圆形
Egg shaped
oval
尾尖
Suddenly come
to a point
圆形
Circular
红渐绿
From red
to green
7 ~ 8对
7–8 pairs
红色
Red
1.0 ~ 1.5
4 绿色
Green
7.0 ~ 9.0 4.0 ~ 5.0 倒卵状椭圆形
Egg shaped
oval
渐尖
Gradually come
to a point
圆形
Circular
红色
Red
5 ~ 7对
5–7 pairs
红色
Red
2.0 ~ 3.0
5 绿色
Green
7.0 ~ 8.0 3.5 ~ 4.0 椭圆形
Oval
渐尖
Gradually come
to a point
圆形
Circular
绿色
Green
9 ~ 10对
9–10 pairs
绿色
Green
0.8 ~ 1.0
6 棕褐色
Brown
8.0 ~ 12.0 4.0 ~ 6.0 椭圆形
Oval
尾尖
Suddenly come
to a point
圆形
Circular
绿色
Green
9 ~ 10对
9–10 pairs
绿色
Green
0.8 ~ 1.0
7 绿色
Green
7.0 ~ 10.0 4.0 ~ 5.5 长椭圆形
Long oval
尾尖
Suddenly come
to a point
钝形
Blunt
红色
Red
9 ~ 10对
9–10 pairs
红色
Red
2.0 ~ 2.5
8 绿色
Green
7.0 ~ 9.0 3.5 ~ 4.5 长椭圆形
Long oval
尾尖
Suddenly come
to a point
钝形
Blunt
红色
Red
7 ~ 10对
7–10 pairs
红色
Red
2.0 ~ 2.5
9 绿色
Green
5.0 ~ 7.5 3.0 ~ 3.5 长椭圆形
Long oval
尾尖
Suddenly come
to a point
钝形
Blunt
红色
Red
7 ~ 10对
7–10 pairs
红色
Red
1.5 ~ 2.0
10 棕褐色
Brown
9.0 ~ 15.0 4.0 ~ 6.0 倒卵状椭圆形
Egg shaped
oval
渐尖
Gradually come
to a point
钝形
Blunt
绿色
Green
8 ~ 10对
8–10 pairs
绿色
Green
1.5 ~ 2.0
11 棕褐色
Brown
7.0 ~ 11.0 4.0 ~ 6.0 倒卵状椭圆形
Egg shaped
oval
尾尖
Suddenly come
to a point
圆形
Circular
绿色
Green
9 ~ 11对
9–11 pairs
绿色
Green
1.0 ~ 1.5


表 4 11株樱属植物果实的主要性状差异
Table 4 The differences of main characters of the 11 samples of Cerasus plants fruit
材料
Material
成熟果实颜色
Mature drupe colour
果柄 Peduncle 平均质量/g
Average quality 颜色 Colour 绒毛 Villous
1 紫黑色 Black-purple 红色 Red 较少 Less 0.28
2 紫黑色 Black-purple 绿色 Green 较少 Less 0.70
3 紫黑色 Black-purple 黄绿色 Green and yellow 较少 Less 0.41
4 紫黑色 Black-purple 黄绿色 Green and yellow 较少 Less 0.61
5 紫红色 Aubergine 黄绿色 Green and yellow 较多 More 0.45
6 紫红色 Aubergine 绿色 Green 较多 More 0.48
7 紫黑色 Black-purple 红色 Red 较少 Less 0.42
8 紫黑色 Black-purple 黄绿色 Green and yellow 较少 Less 0.35
9 紫黑色 Bblack-purple 红色 Red 较少 Less 0.28
10 紫黑色 Black-purple 黄绿色 Green and yellow 较少 Less 0.72
11 紫红色 Aubergine 绿色 Green 较多 More 0.45

Fu Tao，Wang Zhi-long，Lin Li，Lin Le-jing.
Study on the identification method of a system of the Cerasus plants germplasm resources.
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图 1 11株（1 ~ 11）樱属植物花（A）、叶（B）和果实（C）
Fig. 1 Flowers（A），leaves（B）and fruits（C）of the 11 samples of Cerasus plants（1–11）


通过查阅《浙江植物志》等相关资料，结合形态观测，对 11株野生樱树植物进行了初步判定：
1和 4号为毛叶山樱，3、7和 9号为山樱，6号为尾叶樱，11号为浙闽樱，10号可能为黑樱桃，2、
5和 8号由于形态差异较大，故暂不能判定。
樱属植物在自然条件下不存在生殖隔离现象，且樱花多数种花期重叠极易产生自然杂交种，
这样就造成了种内变异较大，即使是同一地区的相同樱花也会存在着明显的差异，要准确地对其
进行归类、划分，还需结合其遗传物质 DNA，如分子标记技术或 DNA 条形码技术等进行分析和
研究。
2.2 DNA提取质量检测和 SSR引物的筛选
樱属植物叶片中多糖含量极其丰富，使得提取的 DNA纯度不高，影响提取 DNA的质量。采用
这种改良后的 CTAB 法提取的基因组 DNA 呈白色透明状，质量较高，经核酸检测仪检测表明，
OD260/OD280值均在 1.7 ~ 1.9之间，纯度较高，符合后续分析的要求。
根据核酸检测仪检测样品溶液浓度，再将 DNA样品溶液用 TE缓冲溶液稀释成 50 ng · μL-1备
用。
采用优化好的 PCR反应体系进行 SSR引物最佳退火温度的筛选（图 2）。在最佳反应体系和最
适退火温度的条件下进行 PCR反应，获得高质量的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，以利于数据的统计，减
少试验误差。

付 涛，王志龙，林 立，林乐静.
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图 2 部分引物最佳退火温度的筛选
Fig. 2 The best annealing temperature screening of part primers

2.3 SSR聚类分析
根据 SSR 扩增结果（表 5，图 3），利用 NTSYSpc2.10e 软件进行 Jaccard 相似性系数分析，计
算出它们之间的遗传相似系数，其范围在 0.3577 ~ 0.8780之间（表 6）。

表 5 12对引物的碱基序列及扩增结果
Table 5 Sequence and amplification efficiency of 12 pairs of primers
引物
Primer
来源
Origin
序列
Sequence（3′–5′）
扩增总
带数
Total band
number
多态性条
带数
Polymorphic
band number
多态性位点
百分率/%
Percentage of
polymorphic
loci
AM287842 C. Jamasakura EST-SSRs F：ATGATGCTACCACAAGGGACTCGT
R：GTTTAGCTGCACATACGCTTTTACCTCC
4 4 100
DY638687 C. jamasakura EST-SSRs F：ACACTCGGATCATAGAAATCTCCG
R：GTTTCCTGAAACCCTGTTGTCGAAT
10 5 50
DY640364 C. jamasakura EST-SSRs F：ACAACTCTTTCTGGGTTCATTGCT
R：GTTTAAAACTCGTATGCTTCCCAAGGGT
6 6 100
DY640849 C. jamasakura EST-SSRs F：ACACTCGGATCATAGAAATCTCCG
R：GTTTCCTGAAACCCTGTTGTCGAAT
12 12 100
M6a P. persica（peach）cDNA F：AGAAGGGCAAGCCCAAGTGC
R：TGCAAAGCCAGAGCCCACAA
13 13 100
M13b P. persica（peach）cDNA F：AAGTGTGGGAGTCGGTGTCG
R：GCTCAATTTCGCTGCTTCCT
7 6 85.7
PceGA25 Sour cherry genomic DNA F：GCAATTCGAGCTGTATTTCAGATG
R：CAGTTGGCGGCTATCATGTCTTAC
3 3 100
PMS2 Sweet cherry genomic DNA F：CACTGTCTCCCAGGTTAAACT
R：CCTGAGCTTTTGACACATGC
6 6 100
UDP96-005 P. persica（peach）genomic DNA

F：GTAACGCTCGCTACCACAAA
R：CCTGCATATCACCACCCAG
18 18 100
UDP96-018 P. persica（peach）genomic DNA F：TTCTAATCTGGGCTATGGCG
R：GAAGTTCACATTTACGACAGGG
8 8 100
UDP97-403

P. persica（peach）genomic DNA

F：CTGGCTTACAACTCGCAAGC
R：CGTCGACCAACTGAGACTCA
16 16 100
UDP98-411 P. persica（peach）genomic DNA F：AAGCCATAAACTCAGCACTC
R：CCAAAAACCAAAACCAAAGG
20 20 100
总计 Total 123 117
平均
Average
10.25 9.75 94.6


Fu Tao，Wang Zhi-long，Lin Li，Lin Le-jing.
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图 3 部分引物的 SSR扩增图
Fig. 3 SSR amplification using part of the random primers


表 6 11份樱属植物 SSR分析的遗传相似系数
Table 6 Genetic similarity coefficient of 11 samples of Cerasus plants based on SSR analysis
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1 1.0000
2 0.4146 1.0000
3 0.6667 0.4390 1.0000
4 0.8455 0.4715 0.7073 1.0000
5 0.5610 0.7236 0.4228 0.5366 1.0000
6 0.4390 0.6667 0.4309 0.4309 0.7805 1.0000
7 0.7886 0.4959 0.7317 0.7642 0.4797 0.3577 1.0000
8 0.6992 0.5203 0.7236 0.8049 0.5041 0.3984 0.7317 1.0000
9 0.7967 0.5528 0.7724 0.7398 0.5041 0.4146 0.8780 0.7886 1.0000
10 0.5528 0.6992 0.4797 0.5285 0.7642 0.7724 0.4553 0.4797 0.4959 1.0000
11 0.5285 0.7398 0.4715 0.5203 0.8537 0.7967 0.4797 0.4878 0.5203 0.8130 1.0000


由遗传相似系数进行 UPGMA 聚类分析，构建了 11 株樱属植物的遗传关系图（图 4）。其中 7
和 9号遗传相似系数最大，为 0.8780，6和 7号遗传相似系数最小，为 0.3577，在遗传相似系数为
0.48处，11份樱属植物可分为 2大类群。
第一类包括 1、4、7、9、8和 3号，在 0.718处 3号被分离出来；在 0.758处 8号被分离出来；
最后 7和 9号聚在一起；1和 4号在 0.846处彼此被分开；第二类包括 2、5、11、6和 10号，在 0.706
处 2号被分离出来；在 0.785处 10号被分离出来；在 0.790处 6号被分离出来，最后 5和 11号在
0.853处彼此分离。
结合前面的形态鉴定，SSR分析结果与形态观测结果基本一致，形态上较接近的彼此间亲缘关
系较近。5 和 6、11 号亲缘关系最近，故推测出 5 号可能是浙闽樱或尾叶樱的变种；同理，推测 8
号可能也属于山樱种系；但 2号依然难以判定。
付 涛，王志龙，林 立，林乐静.
樱属植物种质资源系统鉴定方法的研究.
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图 4 基于 SSR结果构建的 11份樱属植物的 UPGMA聚类分析
Fig. 4 UPGMA dendrogram of the 11 samples of Cerasus plants based on SSR results


2.4 DNA条形码分析
为了进一步鉴定和确认形态分类学和 SSR标记分析结果，采用 DNA条形码技术对 11株樱属植
物进行相关研究。
图 5是核基因 ITS、Sbel和叶绿体基因 trnH-psbA在 11份野生樱属植物中 PCR产物的琼脂糖凝
胶电脉图。结果显示，ITS、Sbel和 trnH-psbA均能得到 1条明亮的主条带，测序结果先经过 DNAman
软件进行初步的序列比对，去除序列两端不准确序列（一般 50 bp内），获得准确、长度一致的序列
用于后续分析。


图 5 DNA条形码电泳图
Fig. 5 DNA barcode electrophoresis figure

之后通过MEGA的 Sequence Data Explorer功能比对序列信息（图 6，仅列出 ITS），发现 ITS
在 11个樱属植物中变异程度较大，有 35个变异位点，而 Sbel和 trnH-psbA变异程度很小，Sbel仅
有 2个差异位点，trnH-psbA仅有 1个差异位点。
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图 7 基于 ITS、trnH-psbA、Sbel序列构建的 NJ 树
Fig. 7 NJ tree based on ITS，Sbel and trnH-psbA sequences

























图 6 ITS序列对比图
Fig. 6 Sequence comparison on ITS


运用 MEGA 4.0 软件，基于 K2-P 距离模
型进行 ITS + trnH-psbA + Sbel序列的 NJ树构
建（图 7），结果显示，1、3、4、7、8和 9号
聚类在一起，其中 3和 8号由于序列无差异而
难以被区分。5、6 和 11 号聚类在一起，2 和
10 号单独聚类。聚类结果与 SSR 结果大体一
致，间接证明 SSR结果是比较准确可信的。
利用BLAST在线搜索页（http：//blast. ncbi.
nlm. nih. gov/Blast. cgi?PROGRAM = blastn &
PAGE_TYPE = BlastSearch & LINK_LOC =
blasthome）对 ITS序列进行比对，此外结合前
期对中国 28种樱属植物（浙闽樱、迎春樱、毛
叶山樱、山樱、钟花樱、黑樱桃、尾叶樱、大
叶早樱、华中樱、野生早樱、微毛樱等）的测
序结果，以序列相似度 ≥ 98%为候选物种。
同样运用MEGA 4.0软件，构建 ITS序列的 NJ树（图 8），1、3、4、7、8和 9号与毛叶山樱相
似度最高，而与山樱（基因 ID：AF145382）相似度较低（< 98%），可能是因为浙江地区山樱与毛
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樱属植物种质资源系统鉴定方法的研究.
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叶山樱差异较小，而与其他地区的山樱差异较大造成的；5、6 和 11 号与浙闽樱、尾叶樱、迎春樱
和钟花樱（序列均未公布）差异较小；2和 10号单独聚为一类。
最终结合形态学和 SSR结果得出 1和 4号为毛叶山樱，3、7和 9号为山樱，6号为尾叶樱，11
号为浙闽樱，由于 8与 3号序列无差异且与山樱组被聚类在一起（但 8号外观上与山樱差异较大），
因此可以确定 8号也为山樱或是山樱的 1个变种。
5 号与浙闽樱、尾叶樱、迎春樱和钟花樱序列相似度均较高，但形态上与浙闽樱、尾叶樱相似
性较高，因此在目前试验条件下可以确定 5号为浙闽樱或尾叶樱的变种。
10 号与 NCBI 数据库比对结果显示，序列最高相似度仅为 98%（黑樱桃基因 ID：KJ649430，
相似度为 98%），可能由于地理位置的差异，造成其 ITS 序列产生了较大变异，但结合形态依然能
够确定其为黑樱桃。
2 号与 NCBI 数据库比对结果显示，序列最高相似度仅为 97%，结合形态依然不能够确定其为
何物种，可能是由于 NCBI数据库有关中国野生樱属植物 ITS序列信息不全面造成的，但也不排除
2号可能是 1个变种（新种），后续需进一步研究。


图 8 基于 ITS序列构建的 NJ 树
Fig. 8 NJ tree based on ITS sequences
3 讨论
SSR分子标记已成为一种检测种质多样性和分析种质亲缘关系的有效方法。目前，SSR分子标
记已在一些重要的农作物如水稻（庄杰云 等，2006）、小麦（郝晨阳 等，2005）、玉米（王凤格 等，
2003）、大豆（文自翔 等，2009）和李（陈红和杨迤然，2014）、枣（麻丽颖 等，2012）、葡萄（温
景辉 等，2011）等果树上广泛应用。Downey 和 Iezzoni（2000）用酸樱桃和甜樱桃的引物对 66 个
黑樱桃基因型作指纹图谱分析；Cantini等（2001）用桃、甜樱桃和酸樱桃的 10对 SSR引物绘制了
59份四倍体酸樱桃种质资源指纹图谱，以便后人利用这些指纹图谱进行品种鉴定，进而确定品种的
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纯度和种类。Suzanne和 Amy（2000）用来源于桃、酸樱桃和甜樱桃的 8对 SSR引物对来自厄瓜多
尔、密歇根和墨西哥的黑樱桃进行遗传多样性研究，发现来自厄瓜多尔的黑樱桃与来自墨西哥的亲
缘关系比来自密歇根的近，且发现这些 SSR引物在李属植物间具有很强的通用性；张琪静等（2008）
用从樱桃、桃及杏筛选的引物对 19份甜樱桃和 2份草原樱品种进行遗传多样性分析，并探究了供试
材料之间的亲缘关系。可见 SSR 引物可在同属不同种或相近的物种间具有通用性（Arnold et al.，
2002）。本试验中从近期开发的樱属 EST-SSR引物及相关樱属植物研究报道的 24对 SSR引物（多
为桃的引物）中筛选出 12对引物，初步探讨了 SSR标记在樱属植物中的亲缘关系鉴定，该 12对引
物扩增的条带丰富，多态性条带检出率高，能有效地将所有样品进行区分。
EST-SSR 是从功能基因组研究表达序列标签中获得的一类 SSR 标记，该类 SSR 标记分布于功
能基因内部较为保守的转录区，参与基因编码，序列较为保守，因此 EST-SSR 在物种间具有较好
的通用性（Saha et al.，2004）。前人研究认为 gSSR与 EST-SSR在遗传关系分析及分子水平上遗传
多样性评价的研究结果是一致的，均能反映个体或群体间的遗传差异和亲缘关系，但 gSSR 多态性
通常比 EST-SSR要高（Chabane et al.，2005；La et al.，2005；Varshney et al.，2005）。本试验中选
择了 4对 EST-SSR引物、2对 cDNA引物和 6对 gSSR引物对 11份野生樱属植物进行 SSR分析。
通过比较分析发现，gSSR位点扩增出等位基因数明显高于 EST-SSR和 cDNA，6个 gSSR的多态性
条带总数为 71个，范围为 3 ~ 20，平均值约为 12，而 6个 EST-SSR（含 cDNA）的多态性条带总数
为 46个，范围为 4 ~ 13，平均值约为 8，结果表明 gSSR 比 EST-SSR（含 cDNA）所获得的多态性
指数高。在选择材料相同情况下，多态性指数越高，该位点鉴别力就越强。但 EST-SSR 扩增结果
比 gSSR 更稳定，能降低条带判读的难度，同时也更能反映出个体或群体的遗传变异。因此，在利
用 SSR分子标记进行亲缘关系的分析过程中可将 gSSR和 EST-SSR进行混合搭配使用，建立几组较
为常用的 SSR核心引物组合。本研究中将 6对 EST-SSR引物（含 cDNA）和 6对 gSSR引物进行搭
配使用，结果比较真实地反映了 11株野生中国樱属植物彼此间的亲缘关系的远近，为该 11株植物
的鉴定提供了重要的依据（结合形态学观测），同时今后可供直接依据该 12对引物对樱属植物进行
遗传多样性、种质鉴定等方面的研究。
DNA条形码是利用标准的基因片段对物种进行快速鉴定的一种新技术（Hebert et al.，2003），
该技术弥补了传统形态分类学的不足之处，此外还能够在新种或隐存种的发现、分类学修订以及资
源利用等生物多样性研究方面提供新的思路和研究工具（Agnarsson & Kuntner，2007），可以说 DNA
条形码是对传统形态分类学的一个强有力的补充（Schindel & Miller，2005）。本研究结果表明，可
能由于 11份樱属植物亲缘关系相对较近，Sbel和 trnH-psbA序列差异性很小，而 ITS却相对变异程
度较大，适合作为樱属植物标准条形码用于研究。本试验中山樱和毛叶山樱 ITS序列相似度很高，
甚至完全一样；浙闽樱、尾叶樱、迎春樱和钟花樱序列相似度也很高，因此单纯依赖 ITS序列很难
将其全部区分开来，若用多组合序列，可以基本区分开来，但成本较高，且相对费时、费力，不利
于实际应用，但可以作为形态学分类的一个非常可靠的辅助工具。本试验的结果表明，山樱、毛叶
山樱以及浙闽樱、尾叶樱、迎春樱、钟花樱物种分化较晚，属于近期分化出的物种，其 ITS序列进
化较慢，因此，单纯依靠 ITS序列很难将其区分开来，必须借助于形态学分类技术才能将其有效的
区分开来。在分类学研究日趋增加的今天，DNA条形码技术已成为植物分类的一种重要的分子辅助
工具，此外对新种（变种）等的发现也十分有效，如本试验发现 2和 5号具有优良的观赏价值，可
能是两个变种，有待后续进一步深入研究。
付 涛，王志龙，林 立，林乐静.
樱属植物种质资源系统鉴定方法的研究.
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4 结论
本研究中结合形态学分类、SSR 分子标记技术和 DNA 条形码技术，可以十分有效地对樱属植
物进行快速、准确的鉴定，最终得出 1和 4号材料为毛叶山樱，3、7、8和 9号为山樱，6号为尾叶
樱，10号为黑樱桃，11号为浙闽樱，5号为浙闽樱或尾叶樱的变种，2号可能是一个新种或变种，
有待进一步确认。此外，研究还发现 2和 5号具有较高的观赏价值，值得进一步深入研究。本试验
结果对樱属植物的物种鉴定、分类以及为新品种的选育具有重要的参考价值。

References
Adam-Blondon A F，Roux C，Claux D，Butterlin G，Merdinoglu D，This P. 2004. Mapping 245 SSR markers on the Vitis vinifera genome：A tool
for grape genetics. Theoretical and Applied Genetics，109 (5)：1017–1027.
Agnarsson I，Kuntner M. 2007. Taxonomy in a changing world：Seeking solutions for a science in crisis. Systematic Biology，56 (3)：531–539.
Arnold C，Rossetto M，McNally J，Henry R J. 2002. The application of SSRs characterized for grape（Vitis vinifera）to conservation studied in
Vitaceae. American doumal of Botany，89 (1)：22–28.
Cantini C，Iezzoni A F，Lamboy W F，Boritzki M，Struss D. 2001. DNA fingerprinting of tetraploid cherry germplasm using simple sequence repeats.
Journal of the American Society for Horticultural Science，126 (2)：205–209.
Chabane K，Ablett G A，Cordeiro G M，Valkoun J，Henry R J. 2005. EST versus genomic derived microsatellite markers for genotyping wild and
cultivated barley. Genetic Resources and Crop Evolution，52 (7)：903–909.
Chen Hong，Yang Yi-ran. 2014. Genetic diversity and relationship of plum resources in Guizhou analysed by ISSR markers. Journal of Fruit Science，
31 (2)：175–180. (in Chinese)
陈 红，杨迤然.2014. 贵州李资源遗传多样性及亲缘关系的 ISSR分析.果树学报，31 (2)：175–180.
Cui Peng，Li bo，Wu Yue-yan，Zhou Wei-jun. 2013. Genetic diversity of table grape varieties in southern China by ISSR markers. Journal of Nuclear
Agricultural Sciences，27 (9)：1270–1275. (in Chinese)
崔 鹏，李 波，吴月燕，周伟军. 2013. 南方鲜食葡萄品种遗传多样性的 ISSR分析. 核农学报，27 (9)：1270–1275.
Downey S L，Iezzoni A F. 2000. Polymorphic DNA markers in black cherry（Prunus serotina）are idenitified using sequences from sweet cherry，
peach，and sour cherry. Journal of the American Society for Horticultural Science，125 (1)：76–80.
Evans K M，Wortley A H，Mann D G. 2007. An assessment of potential diatom“barcode”genes（cox1，rbcL，18S and ITS rDNA）and their
effectiveness in determining relation-ships in Sellaphora（Bacillariophyta）. Protist，158 (3)：349–364.
Hajibabaei M，Janzen D H，Burns J M，Hallwachs W，Hebert P D N. 2006. DNA barcodes distinguish species of tropical Lepidoptera. Proc Natl Acad
Sci USA，103 (4)：968–971.
Hao Chen-yang，Wang Lan-fen，Zhang Xue-yong，You Guang-xia，Dong Yu-chen，Jia Ji-zeng，Liu Xu，Shang Xuan-wu，Liu San-cai，Cao Yong-sheng.
2005. Genetic diversity in Chinese modern wheat varieties revealed by microsatellite markers. Science in China：Series C Life Sciences，35 (5)：
408–415. (in Chinese)
郝晨阳，王兰芬，张学勇，游光霞，董玉琛，贾继增，刘 旭，尚勋武，刘三才，曹永生. 2005. 我国育成小麦品种的遗传多样性演变.
中国科学 C辑，35 (5)：408–415.
Hebert P D N，Cywinska A，Ball S L，de Waard J R. 2003. Biological identifications through DNA barcodes. Proc Biol Sci，270 (1512)：313–321.
Hebert P D N，Penton E H，Burns J M，Janzen D H，Hallwachs W. 2004. Ten species in one：DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical
skipper butterfly Astraptes fulgerator. Proc Natl Acad Sci USA，101 (41)：14812–14817.
Kress W J，Wurdack K J，Zimmer E A，Weigt L A，Janzen D H. 2005. Use of DNA barcodes to identify flowering plants. Proc Natl Acad Sci USA，
102 (23)：8369–8374.
La R M，Kantety R，Yu J K，Sorrells M E. 2005. Nonrandom distribution and frequencies of genomic and EST-derived microsatellite markers in rice，
wheat，and barley. BMC Genomics，6 (1)：23.
Fu Tao，Wang Zhi-long，Lin Li，Lin Le-jing.
Study on the identification method of a system of the Cerasus plants germplasm resources.
2468 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (12)：2455–2468.
Lahaye R，van der Bank M，Bogarin D，Warner J，Pupulin F，Gigot G，Maurin O，Duthoit S，Barraclough T G，Savolainen V. 2008. DNA barcoding
the floras of biodiversity hotspots. Proc Natl Acad Sci USA，105 (8)：2923–2928.
Li C L，Bruce B. 2003. Flora of China. Vol. 9. Beijing：Science Press：404–420.
Ma Li-ying，Kong De-cang，Liu Hua-bo，Wang Si-qi，Li Ying-yue，Pang Xiao-ming. 2012. Construction of SSR fingerprint on 36 Chinese jujube
cultivars. Acta Horticulturae Sinica，39 (4)：647–654. (in Chinese)
麻丽颖，孔德仓，刘华波，王斯琪，李颖岳，庞晓明. 2012. 36份枣品种 SSR指纹图谱的构建. 园艺学报，39 (4)：647–654.
Martinez L E，Cavagnaro P F，Masuelli R W，Zuniga M. 2006. SSR-based assessment of genetic diversity in South American Vitis vinifera varieties.
Plant Science，170：1036–1044.
Newmaster S G，Fazekas A J，Ragupathy S. 2006. DNA barcoding in land plants：evaluation of rbcL in a multigene tiered approach. Can J Bot，84
(3)：335–341.
Saha M C，Mian M A，Eujayl I，Zwonitzer J C，WangL J，May G D. 2004. Tall fescue EST-SSR marker with transferability across several grass
species. Theoretical and Applied Genetics，109 (4)：783–791.
Schindel D E，Miller S E. 2005. DNA barcoding a useful tool for taxonomists. Nature，435 (7038)：17.
Suzanne L D，Amy F Z. 2000. Polymorphic DNA markers in black cherry（Nserotina）are identified using sequences from sweet cherry，peach，
and sour cherry. Journal of the American Society for Horticultural Science，125 (1)：76–80.
Varshney R，Graner K A，Sorrells M E. 2005. Genic microsatellite markers in plants：Features and applications. Trends in Biotechnology，23 (1)：
48–55.
Wang Feng-ge，Zhao Jiu-ran，Guo Jing-lun，Liu Long-zhou. 2003. Series of research on establishing DNA fingerprinting pool of Chinese new maize
cultivars. Journal of Maize Sciences，11 (1)：3–6. (in Chinese)
王凤格， 赵久然，郭景伦，刘龙洲. 2003. 中国玉米新品种 DNA指纹库建立系列研究Ⅰ. 玉米品种纯度及真伪鉴定中 SSR技术标准实
验体系的建立. 玉米科学，11 (1)：3–6.
Wang Hua-zhong，Wu Ze-dong，Wang Xiao-wu，Fang Zhi-yuan. 2008. Analysis of the genetic diversity in different types of sugar beets by SRAP and
SSR markers. Acta Agronomica Sinica，34 (1)：37–46. (in Chinese)
王华忠，吴则东，王晓武，方智远. 2008. 利用 SRAP与 SSR标记分析不同类型甜菜的遗传多样性. 作物学报，34 (1)：37–46.
Wen Jing-hui，Shen Hai-lin，Zou Li-ren，Chen Lei，Liu Hong-zhang. 2011. Analysis of genetic relationship among 20 Vitis germplasm resources by
SSR markers. Journal of Fruit Science，28 (5)：782–786. (in Chinese)
温景辉，申海林，邹利人，陈 蕾，刘洪章. 2011. 20份葡萄种质亲缘关系的 SSR分析. 果树学报，28 (5)：782–786.
Wen Zi-xiang，Zhao Tuan-jie，Ding Yan-lai，Gai Jun-yi. 2009. Genetic diversity，geographic differentiation and evolutionary relationship among
ecotypes of Glycine max and G. soja in China. Chinese Science Bulletin，54 (23)：4393–4403. (in Chinese)
文自翔，赵团结，丁艳来，盖钧镒. 2009. 中国栽培及野生大豆的遗传多样性、地理分化和演化关系研究. 科学通报，54 (21)：3301–
3310.
Yoo H S，Eah J Y，Kim J S，Kim Y J，Min M S，Paek W K，Lee H，Kim C B. 2006. DNA barcoding Korean birds. Mol Cells，22 (3)：323–
327.
Zhang Qi-jing，Zhang Xin-zhong，Dai Hong-yan，Gu Da-jun，Yan Gui-jun，Li Chun-min，Zhang Zhi-hong. 2008. Development of fingerprinting
key and analysis of genetic diversity with SSR marker for sweet cherry cultivars. Acta Horticulturae Sinica，35 (3)：329–336. (in Chinese)
张琪静，张新忠，代红艳，谷大军，闫桂军，李春敏，张志宏. 2008. 甜樱桃品种 SSR指纹检索系统的开发及遗传多样性分析. 园艺学
报，35 (3)：329–336.
Zhuang Jie-yun，Shi Yong-feng，Ying Jie-zheng，E Zhi-guo，Zeng Rui-zhen，Chen Jie，Zhu Zhi-wei. 2006. Construction and testing of primary
microsatellite database of major rice varieties in China. Chinese J Rice Sci，20 (5)：460–468. (in Chinese)
庄杰云，施勇烽，应杰政，鄂志国，曾瑞珍，陈 洁，朱智伟. 2006. 中国主栽水稻品种微卫星标记数据库的初步构建. 中国水稻科学，
20 (5)：460–468.