全 文 ：枇杷属植物隶属于蔷薇科苹果亚科，目前描
述枇杷属植物种质资源原产于中国的有21种类
（包括种、变种和变型）[1]。栽培枇杷为枇杷属植物
中的一个种，即普通枇杷。栽培枇杷目前还存在不
少问题，如性状表现单一，果实可食率低，成熟期
集中，不耐贮运；多用本砧，根系弱小，根冠比过小
等。枇杷的童期长、基因组高度杂合，遗传背景较
为复杂，常规育种效率低[2，3]。因此，广泛搜集枇杷
属植物资源，通过分子标记等分子生物学手段开
展枇杷属植物、蔷薇科枇杷近缘属植物的亲缘关
系以及功能基因的分离和克隆等研究，挖掘重要
的枇杷基因资源，进行枇杷种质创新，对育成枇杷
新品种有重要意义。
RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA）
即随机扩增多态性分析技术是由 Williams和
Welsh等于20世纪90年代逐步改进的一种分子
第 13卷 第 5期 莆 田 学 院 学 报 Vol.13 No.5
2006年 10月 Journal of Put ian UniversityOct. 2006
文章编号：1672-4143（2006）05-0030-05中图分类号：S667.3；Q943 文献标识码：A
枇杷属植物 RAPD 反应体系的优化与应用
吴锦程 1，杨向晖 2，林顺权 2
（1.莆田学院 环境与生命科学系，福建 莆田 351100；2.华南农业大学 园艺学院，广东 广州 510642）
关键词：枇杷属；RAPD；优化
摘 要：采用CTAB—蛋白酶K法提取了48份枇杷种质的DNA，以西班牙枇杷品种Ullera为模板DNA，对
枇杷属植物RAPD反应体系进行优化研究，结果表明：25!L反应体系中，TaqDNA聚合酶、Mg2+、引物、模板
DNA和dNTPs等5种主要成分的适宜浓度或用量分别是：Mg2+为2.0mmol/L，TaqDNA聚合酶为1.0U，引物
为0.25mol/L，dNTPs为0.100— .125mmol/L，模板DNA为25—30ng。利用该优化体系对48份枇杷种质进行
RAPD随机扩增，经琼脂糖电泳获得了清晰的扩增图谱。
Optimization on RAPD Analysis System and Its Preliminary
Application of Genus Eriobotrya Plants
WU Jin-cheng1,YANG Xiang-hui2,LIN Shun-quan2
(1.Environment and Life Science Department, Putian University, Putian 351100, China；
2.College of Horticulture, South China Agriculture University, Guangzhou 510642, China)
Key words：Eriobotrya；Random Amplified Polymorphic DNA(RAPD)；optimization
Abstract：Genomic DNA was extracted from 48 germplasm ofEriobotryaby CTAB—Proteinase method.
The optimal reaction of RAPD in GenusEriobotryawas studied forE. japonica(Thunb.)Lindl.cv. Ullera,
Theresults indicated that the optimum concentration of five important components i.e.Mg2+, primer,TaqDNA
Polymerase,dNTPs and template DNA in 25#Lreaction system of RAPD were2.0mmol/L,1.0U，0.25$mol/L,
0.100— .125 mmol/L and 25—30 ng respectively. Through above optimal PCR system, The 48 germplasm of
Eriobotryawe e amplified and obtained clear amplification profile.
收稿日期：2006-09-06
基金项目：福建省科技厅资助重点课题（2002I023）
作者简介：吴锦程（1965-），男，福建莆田人，副教授。
第5期 吴锦程，等：枇杷属植物RAPD反应体系的优化与应用
代号 种或品种 来源 代号 种或品种 来源
Code Speciesorcultivar Origin Code Speciesorcultivar Origin
1 华宝2号E.japonicaLindl.cv.HuabaoNo.2 湖北Hubei 25软条白砂E.japonicaLindl.cv.Ruantiaobaisha浙江Zhejiang
2 华宝3号E.japonicaLindl.cv.HuabaoNo.3 湖北Hubei 26冠玉E.japonicaLindl.cv.Guanyu 江苏Jiangsu
3 华宝5号E.japonicaLindl.cv.HuabaoNo.5 湖北Hubei 27白玉E.japonicaLindl.cv.Baiyu 江苏Jiangsu
4 华宝7号E.japonicaLindl.cv.HuabaoNo.7 湖北Hubei 28白梨E.japonicaLindl.cv.Baili 福建Fujian
5 龙泉1号E.japonicaLindl.cv.LongquanNo.1四川Sichuan 29乌躬白EE.japonicaLindl.cv.Wugongbai 福建Fujian
6 泸洲6号E.japonicaLindl.cv.LuzhouNo.6 四川Sichuan 30解放钟E.japonicaLindl.cv.Jiefangzhong 福建Fujian
7 泸洲8号E.japonicaLindl.cv.LuzhouNo.8 四川Sichuan 31长红3号E.japonicaLindl.cv.ChanghongNo.3福建Fujian
8 801-1E.japonicaLindl.cv.801-1 四川Sichuan 32早钟6号E.japonicaLindl.cv.ZaozhongNo.6 福建Fujian
9 大五星E.japonicaLindl.cv.Dawuxing 四川Sichuan 33太城4号E.japonicaLindl.cv.TaichengNo.4 福建Fujian
10黄金块E.japonicaLindl.cv.GoldenNugget 美国USA 34禾车本E.japonicaLindl.cv.Hecheben 福建Fujian
11PeluchesE.japonicaLindl.cv.Peluches 西班牙Spanish 35森尾早生E.japonicaLindl.cv.Moriowase 日本Japan
12BlancaE.japonicaLindl.cv.Blanca 西班牙Spanish 36白茂木E.japonicaLindl.cv.Shiromogi 日本Japan
13AixaraE.japonicaLindl.cv.Aixara 西班牙Spanish 37普通枇杷(野生)E.japonicaLindl.(wild) 广东Guangdong
14MarcE.japonicaLindl.cv.Marc 西班牙Spanish 38大花枇杷E.cavaleriei 云南Yunnan
15UleraE.japonicaLindl.cv.Ulera 西班牙Spanish 39香花枇杷E.fragrans 云南Yunnan
16CrisantoAmadeoE.japonicaLindl.cv.CrisantoAmadeo 西班牙Spanish 40窄叶枇杷E.henryi 云南Yunnan
17AlgerieE.japonicaLindl.cv.Algerie 西班牙Spanish 41麻栗坡枇杷E.malipoensis 云南Yunnan
18JavierinE.japonicaLindl.cv.Javierin 西班牙Spanish 42洛阳青E.japonicaLindl.cv.Luoyangqing 浙江Zhejiang
19BiancoE.japonicaLindl.cv.Bianco 西班牙Spanish 43四季枇杷E.japonicaLindl.cv.Siji 云南Yunnan
20Italiano-1E.japonicaLindl.cv.Italiano-1 意大利Italy 44山里本E.japonicaLindl.cv.Shanliben 福建Fujian
21光荣本E.japonicaLindl.cv.Guangrongzhong 安徽Anhui 45茂木E.japonicaLindl.cv.Mogi 日本Japan
22大红袍E.japonicaLindl.cv.Dahongpao 浙江Zhejiang 46梅花霞E.japonicaLindl.cv.Meihuaxia 福建Fujian
23夹脚E.japonicaLindl.cv.Jiajiao 浙江Zhejiang 47香钟11号E.japonicaLindl.cv.XiangzhongNo.11 福建Fujian
24硬条白砂E.japonicaLindl.cv.Yingtiaobaisha浙江Zhejiang 48晚钟E.japonicaLindl.cv.Wangzhong 福建Fujian
标记技术[4-5]，由于该技术具有操作简便、成本低、样
品需要量少、无放射性污染、引物具有普遍适应性、
灵敏度高等突出优点，目前被广泛应用于园艺作物
品种鉴定、亲缘关系分析以及起源与进化的研究[6-
15]。但RAPD的引物为10个碱基或更短的寡核苷
酸片段，在退火温度下引物与模板的互补结合不很
稳定，这种随机扩增容易受到诸多因素的影响，如
引物与dNTPs用量、MgCl2的浓度等都会影响扩
增式样。为获得重复性好、条带清晰的扩增式样，对
RAPD体系的优化显得十分重要，本实验对枇杷
属植物RAPD反应体系的优化进行研究以期为枇
杷种质资源的分子生物学研究提供技术支持。
1材料与方法
1.1材料
试材取自华南农业大学枇杷种质资源圃，包括
大花枇杷、香花枇杷、窄叶枇杷和麻栗坡枇杷4种
野生枇杷及普通枇杷的44个品种，详见表1。取一
年生枝条上新叶刚露尖未展叶或刚展叶时摘取健
康嫩叶为取样最佳时期 （叶片转绿时取样已晚，所
提取的DNA质差量少）放入自封塑料袋（气温高、
路程远时应置于冰壶内）并及时带回实验室，于水
中用手轻轻擦洗以除去杂质及部分绒毛 （不可伤
叶），再用蒸馏水冲洗2次，吸水纸吸干后备用或放
入-70℃冰箱保存待用。实验所采用的Mg2+、dNTPs
和10×ReactionBufer、TaqDNA聚合酶由上海生
物工程公司生产；琼脂糖由Spanish分装；DNA分
子量标准 !DNA/EcoRI+HindⅢ由华美生物工程
公司生产；OperonTechnologies公司的10个寡核
苷酸随机引物由上海博亚（BioAsia）公司合成。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取
基因组DNA的提取参照刘月学等方法略作
修改[16]，具体如下：取新鲜枇杷嫩叶或冰冻叶片
（一定在未解冻之前研磨）0.2—0.4g置研钵内，加
入适量PVP（约0.2—0.3g）和液氮，在液氮中迅速
将嫩叶研磨成粉末，将液氮中的粉末转入预冷的
2.0mL灭菌离心管中（动作一定要快，因枇杷嫩叶
富含多酚类物质，于空气中极易氧化褐变），加入1
表1 供试枇杷属植物种类或品种及其来源
Tab1.GenusEriobotryaPlantsspeciesorcultivarandorigination
31
莆 田 学 院 学 报 2006年 10月
浓度梯度序号 MgCl2 TaqDNA聚合酶 引物 模板DNA dNTPs
Codeofconcentrationgrades /mmol·L-1 TaqDNAPolymerase/U Primer/!mol·L-1 TemplateDNA/ng /mmol·L-1
1 0.5 0.4 0.05 5.0 0.050
2 1.0 0.6 0.10 10.0 0.075
3 1.5 0.8 0.15 15.0 0.10
4 2.0 1.0 0.20 20.0 0.125
5 2.5 1.2 0.25 25.0 0.150
6 3.0 1.4 0.30 30.0 0.175
7 3.5 1.6 0.35 35.0 0.200
mL预热（65℃水浴）的3%CTAB提取缓冲液，同
时加入 20L蛋白酶 K（10mg/mL），充分混匀后
于65℃水浴保温50—60min，水浴保温期间颠倒
摇动离心管2—3次使提取液与样品粉末充分反
应。经8000r/min离心5min，吸取上清液于另一
2mL离心管并加入等体积氯仿/异戊醇（24:1，
V/V）轻轻混匀，12000r/min离心10min。吸取其上
清液转入另一2mL离心管，加入10#LRNase（10
mg/ml），于恒温箱37℃中放置1h。加入等体积冷
冻异丙醇和1/4体积5mol/L的NaCl混匀，于-20
℃下放置2h后经12000r/min离心2min，弃去上
清液并收集沉淀 （即 DNA），用 70%乙醇漂洗
DNA沉淀2—3次（1h/次），于乙醇中长期保存，或
室温风干30min后，溶于50$L的TE缓冲液中。
1.2.2 RAPD反应体系及PCR扩增反应
以西班牙枇杷品种Ulera的DNA为模板（20
ng/%L）， 引 物 为 Z09 （碱 基 序 列 为
CACCCCAGTC）设计了单因素七梯度的组合实验
进行RAPD体系的优化（表2）。当进行某一因素
水平实验时，其它因素均固定在第4个浓度梯度。
体系优化后以Z09为引物对48份枇杷种质进行
RAPD扩增。
PCR 反 应 采 用 Bio-Rad公 司 生 产 的
icyclerTM基因扩增仪，其反应程序为：94℃预变
性 5min，94℃变性 40s，38℃退火 1min，72℃延
伸1min，共45个循环，最后72℃延伸10min。
0.5×TBE、5V/cm、1.4%琼脂糖凝胶电泳 120—150
min，0.5&g/mL溴化乙锭（EB）染色。在Bio-Rad公司
生产的GelDoc2000凝胶成像系统采集图象与分析。
2结果与分析
2.1Mg2+浓度对RAPD扩增结果的影响
Mg2+浓度是PCR反应的重要因素之一。Taq
DNA聚合酶对Mg2+浓度极为敏感，它是Mg2+依
赖性酶；同时Mg2+影响引物与模板的双链杂交体
的解链与退火温度，特别对PCR反应的特异性和
扩增片段的产率影响较大[17]。实验结果显示：Mg2+
浓度在0.5—1.5mmol/L时几乎没有扩增产物，而
Mg2+浓度在1.0—2.5mmol/L之间扩增出的条带
呈增加趋势，其中以2.0mmol/L的Mg2+扩增出的
条带清晰；但Mg2+浓度超过2.0mmol/L时扩增出
的条带开始变得模糊 （图 1A）。因此，以 2.0
mmol/LMg2+浓度的RAPD扩增效果最好。
2.2 引物浓度对RAPD扩增结果的影响
RAPD引物采用的 7个浓度为 0.05、0.10、
0.15、0.20、0.25、0.30、0.35’mol/L，从图 1B可以
看出引物浓度对扩增结果有一定的影响，反应体
系中含有 0.10—0.30(mol/L引物均能扩增出产
物，但含0.05)mol/L和0.35*mol/L引物未能扩
增出产物。从扩增的效果来看，引物浓度在0.10—
0.35+mol/L范围内浓度越高扩增出的条带有减少
和变弱的趋势，以0.25,mol/L引物扩增出的条带
最为清晰，因此引物用量应以0.25-mol/L较适宜。
2.3dNTPs浓度对RAPD扩增结果的影响
dNTPs用量不当将影响PCR扩增效果，浓度
过高将导致聚合酶错误的掺入，浓度过低又会影
响合成效率[17]。结果可以看出：dNTPs对RAPD反
应浓度适用范围较宽，除 0.050mmol/L浓度的
dNTPs外其他均扩增出条带，当dNTPs浓度大于
0.125mmol/L时，浓度越大扩增出的条带呈减少和
变弱的趋势，其中以0.125mmol/LdNTPs扩增出
的条带清晰 （图1C），故取dNTPs浓度为0.125
mmol/L为最佳。
2.4DNA模板浓度对RAPD扩增结果的影响
DNA模板的含量是制约扩增得率和特异性
表2RAPD反应体系中5种成分用量
Tab.2 DiferentamountoffivecomponentsinRAPDreactionsystem
32
第5期 吴锦程，等：枇杷属植物RAPD反应体系的优化与应用
泳道1—7的5种组分与表2一致：A为不同Mg2+浓度；B为不同引物浓度；C为不同dNTPs浓度；D为不同DNA模
板浓度；E为不同TaqDNA聚合酶浓度；M为标准分子量。
ThefivecomponentsofLine1—7isthesameasTable2:A:DiferentMg2+ concentration;B:Diferentprimer
concentration;C:DiferentdNTPsconcentration;D:DiferenttemplateDNA concentration;E:DiferentTaqDNA
Polymeraseconcentration;M:DNAMarker.
的一个重要因子，模板含量过低，分子碰撞的机率
低而导致扩增产物无或不稳定；模板含量过高则
会增加非特异性产物的扩增[17]。DNA模板浓度除
5ng扩增的条带稍弱外，10—35ng的 DNA模板
均能扩增出稳定的条带，但以30ng的DNA模板
扩增结果较好（图1D）。
2.5TaqDNA聚合酶对RAPD扩增结果的影响
25!LRAPD反应体系中含 0.5—1.6UTaq
DNA聚合酶均能扩增出产物；其中以1.0UTaq
DNA聚合酶扩增效果较好，条带相对清晰，而除
此之外其他浓度梯度的 TaqDNA聚合酶扩增效
果较差，条带相对模糊（图1E）。采用25LRAPD
反应体系中含1.0UDNA聚合酶扩增效果好，成
本低。
综上所述，在 25#L的反应体系中，Mg2+为
2.0mmol/L，TaqDNA聚合酶为 1.0U，引物为
0.25$mol/L，dNTPs为 0.1—0.125mmol/L，DNA
模板浓度25—30ng时能得到很好的扩增式样。
采用该优化体系对枇杷属下48份种质进行
了扩增，可以得到条带清晰重复性好的扩增式样
（图2），说明优化后的体系完全可用于枇杷属种质
的RAPD分析。
3讨论
由于单链引物随机结合在基因组众多反向重
复序列上，反应结果的重复性差，在大基因组植物
表现尤为明显；Tm值低的随机引物易受外界条件
的影响（如Mg2+浓度）；因此建立稳定性和重复性
较好的RAPD反应体系为该技术在枇杷遗传育种
领域如分类、系统与进化、遗传多样性、遗传图谱
构建和基因定位等应用提供技术支持。关于
RAPD优化反应体系的建立在许多物种上均有报
道，但不同物种间反应体系存在一定差异[18-21]。潘
新法和孟祥勋等应用RAPD分子标记对16个普
通枇杷品种进行品种鉴定和遗传多样性分析[13-14]。
33
莆 田 学 院 学 报 2006年 10月
陈义挺等先后应用RAPD分子标记技术研究了普
通枇杷和3个野生枇杷的亲缘关系[11-12]，上述研究
没有涉及或涉及少数野生枇杷种质。而本研究涉
及到4种野生枇杷以及来自6个不同国家48份
普通枇杷品种，取材范围较广。Taq酶用量是PCR
反应的关键因子，Taq酶用量过大易产生非特异
性扩增产物并增加成本；Taq酶用量过小，降低扩
增产物的合成效率，影响多态性的检出率和扩增
结果的重复性与忠实性[17]。Mg2+浓度是影响Taq
聚合酶活性的主要因子，不同物种对Mg2+浓度的
要求不同，Mg2+浓度范围大多在1.5—3.0mmol/L
之间，也有高达7.5mmol/L的报道[22]，本实验结果
是Mg2+浓度范围在0.5—1.5mmol/L几乎无扩增
产物，2.0—3.5mmol/L扩增条带均较清晰，且以
3.5mmol/L的 Mg2+浓度扩增效果最佳；DNA模
板、引物和dNTPs的3种成分适宜用量范围较宽，
采用不同引物得到的优化体系会有所差异。
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