全 文 ：本文于 2007-12-05收到。
刘洪章为通讯作者 , 电话:(0431) 84532885
17个苹果属野生植物种的 RAPD亲缘关系研究
张冰冰 1, 2 , 梁英海2 , 田彬彬 3 , 宋洪伟2 , 李　峰 2 , 刘洪章 1
(1吉林农业大学生命科学学院 , 长春 130118)(2吉林省农业科学院果树研究所)(3吉林农业大学园艺学院)
　　摘　要　采用 RAPD标记技术 , 对 17个苹果属野生植物种的亲缘关系进行了分析。对 RAPD标
记结果聚类分析表明 , 17个苹果属野生植物种的亲缘关系基本与前人的分类一致 , 只有山楂海棠 1个
种与前人的分类不一致 。
关键词　苹果属植物　RAPD　亲缘关系
　　世界苹果属植物因分类依据 、标准等不同
而产生了多个系统 [ 1 -3] , 如 RehderA.将世界
苹果属植物分为 5组 6系 , 而 2001年李育农
结合形态学和实验分类研究结果则将其分为 6
组 8系 [ 4] ;1956年我国植物分类学家俞德浚
将中国原产的苹果属植物分为 3组 5系 [ 5] , 而
李育农将其分为 4组 7系 [ 4] 。至今苹果野生资
源的分类基本上以形态学标记为主 , 细胞标记
和生化标记为辅 , 需要应用现代分子标记技术
如 RAPD、 SSR、 ISSR等技术 , 在基因水平上
综合研究苹果亲缘关系。本文采用 RAPD分子
标记技术研究苹果野生种 , 对前人研究结果进
行验证和初步探讨 , 为其提供分子水平依据 。
1　材料和方法
1.1　试验材料
供试的 17个苹果属 (Malus)野生植
物 [ 4]种取自国家果树种质公主岭寒地果树圃
(吉林省公主岭市)和国家果树种质苹果圃
(辽宁省兴城市), 详见表 1。试验中的 RAPD
随机引物 、 Taq酶 、琼脂糖等均购自北京天根
生物技术有限公司 。
表 1　供试的 17个苹果属野生植物种学名及来源
编号 名称 学名 来源 编号 名称 学名 来源
1 丽江山荆子 M.rockiSchneid 公主岭 10 陇东海棠 M.kansuensis(Batal.)Schneid. 兴城
2 湖北海棠 M.hupehensis(Pamp.)Rehd 兴城 11 三叶海棠 M.sieboldi(Regel.)Rehd. 兴城
3 毛山荆子 M.manshuricaKoehne 公主岭 12 小金海棠 M.xiaojinensisChengEtJiang 兴城
4 锡金海棠 M.sikkimensis(Wenzig)Koehne 兴城 13 变叶海棠 M.toringoides(Rehd.)Hughes. 兴城
5 山荆子 M.baccata(L.)Borkh. 公主岭 14 河南海棠 M.honanensisRehd. 兴城
6 滇池海棠 M.yunnanensisFrench.Schneid 公主岭 15 新疆野苹果 M.sieversi(Led.)Roem. 兴城
7 山楂海棠 M.komarovi(Sarg.)Rehd. 公主岭 16 东方苹果 M.orientalisUglitz. 兴城
8 垂丝海棠 M.halianaKoehne 兴城 17 森林苹果 M.sylvestris(L.)Mil. 兴城
9 褐海棠 M.fusca(Raf.)Schneid. 兴城
1.2　试验方法
基因组 DNA的提取采用 SDS提取法 [ 6] ,
在 1%的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA质量和浓
度 。PCR25μL反应体系分别加入:10 pM引
物 1 μL, 2 U/μLTaqDNA聚合酶 1U, 20 ng/
μL模板 DNA1 μL, 2.5 μLPCRbufer[其中
含 Tirs-HCl(pH8.0) 10 mmol/L, KCl50
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DOI :10.16626/j.cnki.issn1000-8047.2008.02.037
mmol/L, Mg2+ 2.0 mmol/L] , 0.2 mmol/L
dNTP0.5μL, ddH2O19.5 μL。
扩增反应在德国 Biometra公司生产的
UNO-Ⅱ型 PCR扩增仪上进行。反应程序为:
94 ℃预变性 4分 , 94 ℃变性 45秒 , 37 ℃退
火 45秒 , 72 ℃延伸 90秒 , 循环 35次 , 72℃
5分 。
扩增产物在 1.5%琼脂糖凝胶上电泳 ,
λDNAmarker为 EcoRⅠ +HindⅢ。溴化乙锭
染色 , 电泳恒压 110 V, 2小时 。电泳仪为北
京市六一仪器厂生产 , 型号为 DYY-6C。紫
外透射反射仪上观察拍照。 2次重复扩增 , 统
计 DNA带。有电泳带记为 1, 无电泳带记为
0。作 0, 1矩阵图 , 利用 DPSv3.01软件的类
平均法 (UPGMA)构建聚类树状图 。
2　结果与分析
2.1　DNA扩增结果
从 120个随机引物中筛选出 10个 RAPD
引物对 17份试材进行了 RAPD标记分析 , 共
在 147个位点上扩增出条带 , 平均每个引物扩
增出 14.7个位点 , 多态性位点 144个 , 平均
多态性为 97.96% (表 2)。 10个引物在 17份
材料中共扩增出 34个特异位点。扩增出 DNA
带的大小在 500 ～ 8 000bp。引物 OPU-3扩增
的 RAPD产物图谱如图 1。
表 2　10个 RAPD引物对 17个苹果属野生植物种的扩增结果
引物 序列 扩增带数(多态性代数)
多态百分率
(%) 引物 序列
扩增带数
(多态性代数)
多态百分率
(%)
OPA1 CAGGCCCTTC 16 (16) 100 OPB8 GTGACGTAGG 13 (13) 100
OPA2 TGCCGAGCTG 13 (12) 92.31 OPB20 GTTGCGATCC 14 (14) 100
OPA4 AATCGGGCTG 15 (14) 93.33 OPR3 ACACAGAGGG 13 (12) 92.31
OPA 16 AGCCAGCGAA 16 (16) 100 OPU3 CTATGCCGAC 18 (18) 100
OPA 18 AGGTGACCGT 15 (15) 100 OPX6 ACGCCAGAGG 14 (14) 100
2.2　亲缘关系聚类
据扩增结果对供试的 17个苹果属植物种
进行聚类 , 结果如图 2所示 , 按 0.70阈值下 ,
将 17个苹果属植物种分为Ⅴ类 , 与前人分类
结果有相异之处 。
第 Ⅰ类 , 有丽江山荆子 、 山荆子 、湖北海
棠 、毛山荆子 、 锡金海棠 、 垂丝海棠等 6个苹
果属植物种 , 属山荆子组 , 这与李育农 [ 4] 、
Rehder[ 1]分类结果一致 。
第Ⅱ类 , 只有三叶海棠 1个种 , 与山荆子
组亲缘关系较近 , 较支持 Rohinson[ 7] 、 梁国
鲁 [ 8]将三叶海棠归属山荆子组的建议 。但前
苏联作物研究所 [ 4]的生化性状分析建议将三
叶海棠列为一个独立系 。
第Ⅲ类 , 有新疆野苹果 、东方苹果 、森林
苹果等 3个苹果属植物种 , 属苹果组塞威士苹
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果系 , 这与李育农 [ 4] 、 Rehder[ 1]分类结果一
致 。
　　第Ⅳ类 , 由滇池海棠 、小金海棠 、陇东海
棠 、变叶海棠 、 河南海棠 、 褐海棠等 6个植物
种组成 , 这与李育农 [ 4] 、 Rehder[ 1]分类结果一
致 。
第Ⅴ类 , 只有山楂海棠 1个种 , 与花楸苹
果组陇东海棠系 [ 1, 4] 的其它种亲缘关系甚远 ,
而李育农 、 Rehder将山楂海棠列入花楸苹果
组陇东海棠系。在前人分类学的基础上 , 结合
山楂海棠形态特征 、 酶谱研究[ 4] , 建议重新
考虑山楂海棠分类地位。
由于仅筛选出 10个多态性和差异性较好
引物用于苹果种 RAPD分子标记 , 加之苹果属
植物种起源与演化的复杂性 , 上述结果供分类
参考。建议使用 SSR、 ISSR等多种分子标记
继续研究苹果野生种亲缘关系 。
参考文献
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8　梁国鲁 , 李晓林.中国苹果属植物染色体研究.植物分类
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