全 文 ：杠柳属植物中总甾体含量分析方法研究
范俊迈1 ,钟　菡 2 ,张　宏 2 ,胡晓荣1＊
(1.成都理工大学材料与化学化工学院 ,四川 成都 610059;2.四川师范大学生命科学学院 ,四川 成都
610068)
　　摘要　目的:建立一种简便测定杠柳属植物中甾体类成分含量的方法。方法:以薯蓣皂苷元作为对照品 ,对香
草醛比色法实验条件进行优化。结果:确定比色条件为挥干溶剂后加 5%香草醛-冰醋酸 0.2 mL和 65%浓硫酸 5
mL,于 70℃水浴保温 40 min;通过单因素实验确定样品的最佳提取条件为药材粉碎至 60目 ,按 1∶15料液比加入甲
醇 , 在 60℃下超声提取 2次 ,每次 10 min。薯蓣皂苷元对照品在 2.327 ～ 34.904 mg/L范围内有良好的线性关系(r
=0.9993),平均回收率为 99.1%, RSD值为 2.36%(n=6)。结论:采用香草醛比色法测定杠柳属植物中总甾体皂
苷含量操作简便 , 结果可靠。
关键词　甾体皂苷;杠柳属植物;香草醛比色法
中图分类号:R284.1　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2009)04-0545-03
收稿日期:2008-12-25基金项目:四川省教育厅重点项目(2005A098)作者简介:范俊迈(1983-),男,在读硕士研究生 ,研究方向:植物化学研究;Tel:13402805751。＊通讯作者:胡晓荣 , Tel:028-66090107, E-mail:zwyjs2006@yahoo.com.cn。
　　杠柳属植物属于萝摩科杠柳亚科 ,为藤状灌木 ,
我国产杠柳属植物大部分为药用植物 ,能祛风湿 、壮
筋骨 、强腰膝 ,治疗风湿关节炎 、筋骨痛等症 ,临床用
其总皂苷治疗慢性充血性心力衰竭。药理作用研究
表明 ,杠柳 、黑龙骨及青蛇藤茎皮或根皮中的总皂苷
均具有强心作用〔1〕 ,甾体类成分〔2〕如强心苷和 C21
甾体苷具有多种生理活性 ,如抗癫痫 、抗肿瘤 、抗生
育等〔3, 4〕 ,为杠柳属植物的主要药效成分 〔5, 6〕。已有
许多报道从杠柳属植物的根茎中分离出甾体类物
质 ,但对该属植物的总甾体类成分的含量分析方法
研究仍鲜有报道 ,经查阅文献 ,甾类成分的含量分析
方法主要有香草醛-硫酸法 、硫酸-甲醇法和磺基醋
酸汞试剂法等几种针对甾体母核的显色比色法 ,本
文比较了这几种方法的灵敏度及稳定性 ,建立了杠
柳属植物中甾体类成分的含量测定方法 ,并测定了不
同产地 、不同年份杠柳属植物茎叶中甾类成分含量。
1 　仪器与材料
UV-1700紫外-可见分光光度计 (日本岛津);
WK-1000A高速中药粉碎机(山东青州市精诚机械
有限公司);KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山
市超声仪器有限公司)等。
杠柳属植物样品黑骨藤 Periplocaforesti(购于
贵阳中药材市场)、青蛇藤 Periplocacalophyla(采于
四川西昌)、大叶青蛇藤 Periplocafloribunda(采于四
川绵阳)经四川师范大学生命科学学院植物学老师
于树华鉴定;薯蓣皂苷元对照品 (批号:1539-
200001)购于中国药品生物制品检定所 ,供含量测
定用;香草醛(成都科龙化工试剂厂);其它试剂均
为分析纯 ,水为蒸馏水。
2　方法与结果
2.1　显色方法的选择　精密吸取一定量的薯蓣皂
苷元对照品溶液于 3支洁净试管中 ,水浴挥干溶剂
后 ,分别加入硫酸甲醇(7∶3)溶液 5 mL、5%香草醛 -
冰醋酸 0.2 mL和 70%浓硫酸 5 mL、磺基醋酸汞试
剂(配制方法:称取 0.505 g黄色氧化汞 ,在 10 mL
蒸馏水和 2 mL浓硫酸的冷混合液中捣研 ,直至溶
解。用 2∶1的浓硫酸和冰乙酸混合液将此溶液稀释
至 100 mL,静置 8h,收集上清液即为磺基醋酸汞试
剂)5mL, 60℃水浴加热 30 min,冷水浴冷却 ,在 200
～ 1 000 nm范围内扫描吸收曲线 ,见图 1。硫酸-甲
醇法 、磺基醋酸汞试剂法和香草醛-硫酸法的摩尔吸
收系数 ε见表 1。
　表 1 　各显色方法吸光系数比较
方法 λmax/nm
标液浓度 /(mol/L) 吸光度A 吸光系数 ε/(L/mol· cm)
香草醛-硫酸法 485 1.168×10-5 0.125 7.440×103
硫酸-甲醇法 325 1.168×10-5 0.059 3.512×103
磺基醋酸汞试剂法 510 1.168×10-5 0.046 2.738×103
　　由图 1可知硫酸 -甲醇法在 325nm处有明显吸
收峰 ,但样品空白曲线同时有一小吸收峰 ,存在样品
空白干扰 ,试剂空白无干扰;磺基醋酸汞试剂法扫描
曲线在 510 nm处有吸收 ,但峰形不明显 ,而香草醛 -
硫酸法扫描曲线在 485nm波长处有明显吸收峰 ,且
不存在试剂空白和样品空白的干扰 。由表 1可知香
草醛 -硫酸法吸光系数值最大 ,灵敏度最高 ,所以选
择用香草醛-硫酸法测定杠柳属植物中总甾体的含
量 ,且同时确定测定最大吸收波长为 485 nm。
·545·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 4期 2009年 4月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2009.04.029
图 1　各方法显色后样品溶液的扫描曲线
2.2 　显色反应条件的选择　本文考察了硫酸浓
度 、反应温度和反应时间对样品测定的影响 。选择
硫酸浓度时 , 实验考察了 50%、55%、 60%、 65%、
70%、75%、80%各浓度的硫酸 ,结果表明 65%浓硫
酸最为合适 ,吸收峰尤为明显 ,故选择 65%浓硫酸;
选择温度时 ,实验考察了 60、 70、80℃三个温度水
平 ,扫描样品吸收曲线 ,结果 70℃与 80℃加热的样
品曲线基本一致 ,在 485 nm处的吸收峰比 60℃时
稍高 ,所以选择 70℃为显色反应温度;选择反应时
间时 ,实验考察了不加热 ,加热 10、20、30、40、50 min
共 6个时间水平 ,在 485nm波长处测定吸光度值 ,
结果 40 min达到最高 ,选择反应 40min。
根据以上实验 ,确定显色反应的最佳条件为:水
浴挥干溶剂后 ,加 0.2mL5%香草醛-冰醋酸溶液及
5mL65%浓硫酸 , 70℃加热 40 min,冷水浴冷却。
2.3 　标准曲线　精密吸取薯蓣皂苷元标准溶液
(121.00 mg/L)0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.5 mL于洁
净试管中 , 挥干溶剂后加 5%香草醛-冰醋酸 0.2
mL,再加 65%浓硫酸 5 mL,水浴加热 40 min后冷
却 ,用甲醇同法制备空白 ,在 485 nm波长处测定吸
光度值 。以薯蓣皂苷元浓度 C为横坐标 ,吸光度 A
为纵坐标绘制标准曲线。经计算薯蓣皂苷元标准曲
线的回归方程为:A=0.03539C-0.02824, r=
0.9993,薯蓣皂苷元在 2.327 ～ 34.904 mg/L范围内
具有良好的线性关系 。
2.4 　样品溶液的制备
2.4.1　提取溶剂:考察水 、甲醇 、50%乙醇 、95%乙
醇 、无水乙醇 、氯仿 、乙酸乙酯 7种溶剂 ,结果表明甾
体成分在甲醇中溶出量最多 ,平均值为 35.80mg/L
(RSD值为 1.43%, n=3),平行样结果较为稳定 。
2.4.2　提取方式:用甲醇作溶剂 ,常规回流提取平
均值为 25.93 mg/g(RSD值 2.62%, n=3),超声波
提取平均值为 35.80 mg/g(RSD值 1.43%, n=3),
结果表明 ,超声提取平均值更高 ,故选择用超声提取
方式 。
2.4.3　超声提取条件:本实验考察了提取次数 、料
液比 、温度 、单次提取时间及药材粒度 5个因素对甾
类成分溶出量的影响 ,结果表明黑骨藤药材提取 2
次即可 ,第三 、四 、五次甾体皂苷溶出量几乎很少;料
液比选择 1∶15合适 ,料液比更大时提取率略有下降
并趋于稳定;温度影响的总体趋势是 ,温度越高 ,总
甾体皂苷溶出率越高 ,但由于甲醇的沸点(64.5℃)
较低 ,温度太高易挥发 ,所以没有进行更高温度的考
察 ,选择 60℃为适宜的提取温度;单次提取时间超
过 10 min时 ,总甾体皂苷溶出量基本趋于稳定 ,故
选择 10min为最佳提取时间;药材粉碎至 60目以上
时 ,总甾体皂苷溶出量基本趋于稳定 ,更细粒度对甾
类成分的溶出度无明显影响 ,所以药材粒度选择 60
目即可。
根据以上实验 ,确定样品溶液制备的方法为:药
材粉碎至 60目 ,甲醇超声提取 ,料液比 1∶15,温度
60℃,提取 2次 ,每次 10min,提取液过滤后甲醇定
容即得样品溶液。
2.5　精密度试验　精密吸取标准品溶液(121.00
mg/L)0.2、0.5、1.0 mL,按 “2.2”项下同法显色 ,同
1d内平行做 6个样 ,分别测定样品吸光度值 ,考察
日内精密度;精密吸取标准品溶液 (121.00 mg/L)
0.2、0.5、1.0 mL,按 “2.2”项下同法显色 ,测定吸光
度值 ,平行做 6 d,考察日间精密度 。结果 RSD值均
低于 5%,该方法精密度较好 ,符合含量分析要求。
2.6　稳定性试验　精密吸取标准品溶液(121.00
mg/L)0.2、0.5、1.0 mL,按 “2.2”项下同法显色 ,测
定 0、1、2、4、8、12、24、48h吸光度值。低中高浓度 3
个样品在 12h内吸光度 RSD值分别为 2.41%、
3.28%、2.21%,在 24 h内 RSD值分别为 2.25%、
5.88%、6.22%,样品在 12h内稳定性较好 。
2.7　重现性试验　精密称取一定量的药材 , 按
“2.4”项下同法制备样品溶液 ,测定含量 ,平行做 3
·546· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 4期 2009年 4月
个样品。 3个平行样品的提取率分别为 4.33%、
4.12%、3.98%,平均值为 4.14%, RSD值 4.24%,
符合含量分析要求。
2.8 　加样回收率试验　精密称取一定量的药材 ,
再精确加入适量的薯蓣皂苷元对照品溶液(含量为
121.00 mg/L)0.4mL,按 “2.4”项下同法制备样品溶
液并显色测定其含量 ,平行做 3个样品。平均加样
回收率为 100.57%, RSD值为 2.05%,结果符合含
量分析要求 ,见表 2。
　表 2 　加样回收率试验结果
样品含量 /μg 加样量 /μg 测得量 /μg 回收率 /% 平均值 /% RSD/%
55.95 48.4 47.51 98.20
55.95 48.4 49.12 101.50 100.57 2.05
55.95 48.4 49.39 102.00
2.9 　含量测定　各品种各年份样品甾体类成分含
量测定结果见表 3。
　表 3 　样品含量测定结果(n=3)
品种 采样年份 含量 /(mg/g) 平均值 RSD/%
黑骨藤 2004 26.38
2005 33.52
2006 56.98
2007 68.41
46.32
0.82
2.12
0.15
1.75
青蛇藤 2004 52.36
2005 43.27
2006 56.75
2007 41.54
2008 73.86
53.56
3.84
1.70
0.63
4.24
0.84
大叶青蛇藤 2007 51.48 51.48 4.22
3　讨论
3.1　显色反应条件的选择 　采用香草醛试剂显
色 ,反应温度和反应时间是影响吸光度的两个重要
因素 ,加热完及时用冷水浴冷却必不可少 ,否则对结
果影响较大。
3.2　样品溶液制备提取条件的选择　在考察超声
波提取条件单因素时 ,药材粒度对总甾体皂苷的溶
出量影响最为明显 ,应该首先考察该因素。在考察
其他因素时 ,因为所用的药材都是同一粒度 ,所以单
因素曲线总体还是能反映出影响趋势。
3.3　样品测定结果　含量测定结果发现 ,不同品
种药材总甾体皂苷含量差别不明显 ,不同年份的药
材甾类含量差异较大 ,含量差别无明显规律。所以
对杠柳属植物进行甾类含量分析尤显重要 ,本方法
可准确测定杠柳属植物中总甾体含量。
参 考 文 献
[ 1] 梅全喜 .现代中药药理与临床应用手册 [ M] .北京:中
国中医药出版社 , 2008:652-653.
[ 2] MasahikoKimura, KojiHayashi, HiromiNarita, etal.
StudiesontheConstituentsofAsclepiadaceaePlants[ J] .
Chem.Pharm.Bul., 1982, 30(11):3932-3941.
[ 3] 吴立军 .天然药物化学(第 4版)[ M] .北京:人民卫生
出版社 , 2003:312-349.
[ 4] 谭仁祥.植物成分分析 [ M] .北京:科学出版社 , 2002:
415-418.
[ 5] 张援虎 , 王锋鹏 .杠柳属植物化学成分研究进展 [ J] .
天然产物研究与开发 , 2003, 15(2):157-161.
[ 6] 张援虎 , 杨亚婷 , 陈东林 , 等 .黑龙骨化学成分的研究
[ J] .中草药 , 2006, 37(3):345-347.
售 《现代中药药理与临床应用手册 》一书
由广州中医药大学附属中山市中医院中药药理实验室梅全喜教授主编的《现代中药药理与临床应用手册》一书由中国中
医药出版社正式出版 。该书全书 210万字 , 共分 28章 ,总论 7章 , 各论 21章 , 收载药物 523种。本书以现代药理学的理论及
研究结果为基础 , 按中药传统功效分类方法进行分类编写 , 其主要内容是介绍常用中药的药理作用及临床应用 , 对传统的祖
国统一国医药学理论也做了少量的试探性阐述。以突出药理作用为主旨 ,对每味药药理作用作了较为详细和深刻的阐述 ,在
阐述药理作用时注重揭示传统中药的功效与现代药理作用之间的联系 , 对与传统中药功效有关联的药理作用都进行了比较
详细的阐述。现代中药的应用不少是以现代药理作用为基础的 , 本书亦将临床应用部分作为一个重点进行了介绍。 本书收
载的资料主要是现代资料 , 尤以近 10年资料为多 , 近期资料收至 2008年 3月底。在内容上力求反映近年来国内 、外在中药药
理研究方面取得的新成果 、新进展 ,具有新颖性。本书不仅适用于从事中药科研 、生产 、经营和应用人员以及中医 、西医 、中西
医结合专业人员使用 ,对于大中专中医院校的教学而言 , 该书同样是一本详实 、实用 、高质量的参考书。
该书定价 138元 ,有需要者请汇款至:528400广东省中山市南安路二号 ,中山市中医院药学部高玉桥药师收 ,免收邮费。
·547·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 4期 2009年 4月