全 文 ：第 33卷　增刊 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) Vol. 33 Suppl.
2005年 8月 Jour. of No rthw est Sci-Tech Univ . o f Ag ri. a nd Fo r. ( Na t. Sci. Ed. ) Aug. 2005
李属坏死环斑病毒怀柔分离物 ( PNRSV-HR)
外壳蛋白基因片断的克隆与序列分析
黄　冲1 ,李明福 2 ,张永江 2
( 1中国农业大学 植物病理学系 ,北京 100094; 2中国检验检疫科学研究院 动植物检疫研究所 ,北京 100029)
　　 [摘　要 ]　应用 RT-PCR方法检测了采自北京市怀柔区的樱桃叶片 ,将此 PCR扩增产物连接到 pMD18-T载
体上 ,通过转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞 ,克隆了含有目的片段的重组质粒 ,并进行序列测定和分析。 序列分析
结果表明 ,认为该分离物外壳蛋白基因片断与李属坏死环斑病毒的 NRSiz8株系的同源性最高 ,为 98% ,与德国分
离物 Ring 17的同源性达 99% ;通过进化关系分析 ,认为该分离物属于引起温和症状的 g roupⅡ ,认为该分离物的
第 5, 62, 81和 126位氨基酸也与 CH9血清型引起温和症状的保守的替换相同。
[关键词 ]　李属坏死环斑病毒 ( PN RSV ) ; RT-PCR;克隆 ;序列分析
[中图分类号 ]　 S436. 629　　　　 [文献标识码 ]　 A [文章编号 ]　 1671-9387( 2005) S0-0105-04
　　李属坏死环斑病毒 ( Prunus necro tic ring spot
vi rus, PN RSV )为雀麦花叶病毒科 ( Bromoviridae)
等轴不稳环斑病毒属 ( Ilarvirus )的一种病毒 ,是我
国二类进境检疫性有害生物。目前 ,该病毒已在我国
局部地区被发现 ,我国学者阮小凤等 [1, 2 ]、王国平
等 [3 ]在研究陕西、辽宁和山东的果树病害时发现并
检出了该病毒。该病毒主要危害李属和蔷薇属植物 ,
主要是一些核果类果树和花卉 ,如樱桃、桃、李、杏和
月季等 ,对我国核果类果树和花卉生产造成威胁。该
病毒危害樱桃的早期症状为 ,春季樱桃新发幼叶上
出现深棕色的坏死斑和线纹 ,在叶片展开后发展为
坏死斑脱落造成穿孔症状 ,使果树树势减弱、产量降
低、甚至死亡。
Howell等 [4 ]和 Crosslin等 [5 ]研究发现 ,李属坏
死环斑病毒有很多株系 ,主要表现在致病力差别上 ,
有的株系在寄主上不引起明显的症状 ,而有的株系
在幼叶期就表现明显症状。 Mink等 [6 ]根据 PN RSV
在樱桃上是引起温和斑驳症状还是造成皱缩花叶症
状 ,将 PN RSV的株系分为 M和 R两种致病型 ,而
根据血清反应 ,又可以把 PN RSV划分为 3种血清
型 ,即 CH3, CH9和 CH30。 Hammond等 [ 7]根据各株
系引起的症状类型将 PN RSV株系划分为 3个不同
的 组 ( g roupⅠ , g roupⅡ 和 g roupⅢ ) ,并 发现
PN RSV的外壳蛋白基因的核苷酸序列、编码的氨
基酸序列与该病毒的血清型和致病型之间存在一定
的关系 ,氨基酸在 PN RSV CH9血清型中的皱缩致
病型和温和致病型之间存在一些变化。
笔者于 2004-04对北京地区部分核果类果园进
行疫情调查 ,采集了大量样品并进行了血清学和分
子生物学检测 ,进而在北京怀柔地区发现了该病毒。
本研究克隆了该分离物的外壳蛋白基因片断 ,测序
并进行序列分析 ,明确了该分离物与该病毒其他株
系的关系 ,为其流行学研究奠定了基础。
1　材料与方法
1. 1　材　料
　　毒源为采自北京市怀柔区的感染李属坏死环斑
病毒的樱桃叶片 (中国检验检疫科学研究院动植物
检疫研究所保存 ) ,摩擦接种于黄瓜幼苗上得该病毒
的分离物 ,定为 PN RSV-HR,用双抗体夹心酶联检
测和 RT-PCR检测验证。
1. 2　李属坏死环斑病毒怀柔分离物外壳蛋白基因
片断的 RT-PCR扩增
1. 2. 1　引物设计合成　参照 GeneBank上已发表
的 PN RSV外壳蛋白序列设计引物 ,引物由北京赛
百盛公司合成。 正向引物为 5′-gg t ccc act cag ggc
tca ac-3′,反向引物为 5′-cgc aaa ag t g tc gaa a tc taa
[收稿日期 ]　 2005-07-08
[基金项目 ]　国家自然科学基金项目 ( 30270892)
[作者简介 ]　黄　冲 ( 1979- ) ,男 ,江苏徐州人 ,在读硕士 ,主要从事植物病毒学研究。 E-mail: h c33@ 163. com
[通讯作者 ]　李明福 ( 1965- ) ,男 ,江苏扬中人 ,副研究员 ,主要从事植物检疫与植物病毒学研究。 E-mail: limf9@ sina. com
DOI : 10. 13207 /j . cnki . jnwaf u. 2005. s1. 029
a tc-3′,用经 DAS-ELISA检测阳性的 PN RSV毒源
验证表明该引物的特异性强。
1. 2. 2　 cDN A的合成　参考文献 [8～ 11]的方法。
用 Invi t ro gen的 Trizol试剂盒提取样品叶片总
RNA。 反转录体系 20μL, RN A模板 1μL, 10
mmol /L dN TP 1μL, DEPC-H2O 10μL, 20μmol /L
反向引物 2μL, 70℃ 5 min,冰上放置 5 min,加入
M-M LV反转录酶 5倍 Buf fer 4μL, 200 U /μL M-
MLV反转录酶 1μL, 40 U /μL RNA酶抑制剂 1
μL, 42℃ 1 h。
1. 2. 3　外壳蛋白基因片断的 RT-PCR扩增　反应
体系为上述 cDN A产物 2μL, 10倍 PCR缓冲液 (含
Mg
2+ ) 2μL, dN TP 0. 6μL,引物各 0. 5μL, 2 U /μL
Taq酶 1μL, DEPC-H2O 13. 4μL。 反应条件为 94
℃变性 10 min, 94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 1 min,
30个循环 , 72℃延伸 8 min。用 1%琼脂糖凝胶电泳
RT-PCR扩增产物。
1. 3　外壳蛋白基因片断的克隆和序列分析
利用北京三博志远生物技术有限责任公司的琼
脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片断。将回收的 DNA
连接到 pMD18-T载体上 ,转化大肠杆菌 DH5α感
受态细胞 ,经蓝白斑筛选阳性菌落 ,用 PCR鉴定所
得重组质粒。
将经 PCR验证阳性的菌落在 LB液体培养基
上培养 , 37℃ 300 r /min振荡培养约 12 h至对数生
长期 ,取 1 mL培养物进行核酸序列测序 ,序列测定
由上海博亚生物技术有限公司完成。 用 BLAS T进
行序列分析。
2　结果与分析
2. 1　 RT-PCR扩增
　　用 1%琼脂糖凝胶电泳 RT-PCR扩增产物 ,样
品中扩增出约 452 bp的目标条带 ,与根据引物设计
的片断大小一致 ,而健康材料中未扩增出相应大小
的片段 (图 1)。
2. 2　重组质粒的筛选与鉴定
从转化平板上挑取 3个白色菌落进行 PCR验
证 ,结果 1, 3两个泳道均在约 452 bp位置出现条
带 ,表明这两个菌落含有插入片断 ,从而可以推断
PCR产物已插入质粒载体中 (图 2)。
图 1　 RT-PCR产物检测电泳图
M. DNA mark er; 1.健康对照 ; 2.樱桃叶片样品
Fig . 1　 Aga rose gel electropho r esis
o f RT-PCR produc ts
M. DN A marker; 1. Health cont rol; 2. Ch erry leaf
图 2　重组质粒电泳图
M. DN A mark er; 1, 3.重组质粒
Fig . 2　 Aga ro se gel electr ophor esis
o f recombinant pla smids
M. DN A marker; 1, 3. Th e recombinant plasmids;
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2. 3　序列测定与分析
对重组质粒的插入片段进行测序 ,结果为:
1　　　 TGGTCCC ACT　 CAGGGC TCAA　 CAGAGGGCAG　 CGAATAACCC　 GAATAGAAGC　 CCGAATAGGG
61 CT TCGAGTGG TACCGGACCA GTGGTCCGAC CACAGCCGGT CGTGAAGACC ACC TGGACCG
121 TGAGAGGTCC GAATGTGCCT CCCCGAATTC CTAAGGGGTT T GT AGCACAC AATCACCGAG
181 AGGTGACGAC GACAGAGGCA GTGAAGTACT TGAGT AT AGA CT TCACGACC ACTCTCCCTC
241 AGTTGATGGG TCAGAATT TG ACCC TATTGA CTGTT AT AGT CCGAATGAAC TCT ATGAGTT
301 CGAATGGTTG GATTGGGATG GTGGAGGACT ATAAGGTGGA ACAACCTGAT GGTCCGAATG
361 CCCTGTCCAG GAAGGGGTTC TTGAAGGACC AACCGAGAGG T TGGCAGT TC GAACCTCCTT
421 CCGAT TT AGA TT TCGACAC T TTTGCG。
　　序列分析结果表明 ,该分离物外壳蛋白基因片
断与该病毒的 NRSiz8株系的同源性最高 ,为 98% ,
与德国分离物 Ring 17的同源性达 99% ;通过进化
树分析 ,该分离物属于引起温和症状 g roupⅡ
( PV96) ,该分离物的第 5, 62, 81和 126位氨基酸也
与 CH9血清型引起温和症状的保守的替换相同。
3　讨　论
自 1998年我国学者报道国内发现李属坏死环
斑病毒以来 ,国内对该病毒的研究工作也相继展开。
目前 ,已开展了该病毒检测方法的研究 ,农业部也组
织了对该病毒的疫情调查。 但目前我国对该病毒的
株系情况研究较少 ,马云霞 [ 12]对该病毒的平谷分离
物和昌黎分离物进行了序列分析。比较发现 ,同为北
京地区 ,两个分离物属于不同组、不同血清型 ,引起
的症状也不同。 平谷分离物属于 Hammond所划分
的引起严重症状的 g roupⅠ ,而本研究发现怀柔分
离物属于引起温和症状的 g roupⅡ ;平谷分离物的
第 1, 5, 62, 81和 126位氨基酸也与 CH9血清型引
起严重症状的保守的替换相同 ,而本研究中怀柔分
离物与引起温和症状的保守的替换相同 ,说明北京
地区所发现的该病毒分离物属于两个不同的株系 ,
尚有待进一步深入研究。
李属坏死环斑病毒可以种传、花粉传播 ,作为我
国进境检疫性病毒 ,其检疫地位到底如何 ,目前尚存
在争议 ,本研究通过外壳蛋白基因片段克隆序列分
析发现 ,北京怀柔地区的分离物不同于平谷地区发
现的分离物 ,北京地区 PNRSV分别属于两个不同
的组 ,说明其不是同源 ,而是来自不同地区 ,极可能
来自不同的引种地。这些分离物分别来自何地 ,目前
尚不清楚 ,有必要进行跟踪调查 ,并对该病毒的流行
学特征进行深入研究 ,为检疫决策及其防除奠定基
础。
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The cloning and sequence analysing of the CP gene f rom huairou
isolate of Prunus necro tic ring spo t virus
HUANG Chong
1
, LI Ming-f u
2
, ZHANG Yong-jiang
2
( 1 Department of Plant Pathology ,China Agricultural Universit y ,Beij ing 100094,China;
2 Instituteof Animal and Plant Quarantine ,CAIQ,Chaoyang ,Beijing 100029,China)
Abstract: The leaves of cherry w ere sampled f rom Huairou, Beiiing and detected by RT-PCR amplifica-
tion. The PCR product w as cloned in pMD18-T vecto r, and transfo rmed to the DH5α. The recombinant
plasmid w as analy sed w ith Sanger method. The result show ed that the CP-gene sequence had basic harmo-
nization w ith tha t of st rain N RSiz8 ( 98% homology) and isolate Ring 17 ( 99% homology ) . The phylog e-
netic t rees suggest tha t PN RSV-HR belong s to g roup Ⅱ ( the mi ld patho type, defined by Hammond) of
PN RSV, and the 5th, 62th, 81th, and 126th amino acid o f the isolate are same to the CH9 sero type.
Key words: Prunus necro tic ringspo t vi rus, PN RSV; RT-PCR; clone; sequence analysis
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