全 文 ：农 业 生 物 技 术 学 报 Jo u m a l o f A g r ie u lt u ar l B io et e h n o lo gy 199 9 , 7 (2 )
苹果属 (A臼了璐 ) 显性矮化主基因 D w 的 R A P D 分子标记 *
张开春 ’ 毕晓颖 ’ 李荣旗 ’ 景士西 ’ 吴禄平 ’ 尹淑萍 ’
( 1 北京市农林科学院林业果树研究所 , 北京 100 09 ;3 2 沈阳农业大学农学院果树系 , 沈阳 112 40 )
摘 要 : 以具兼性无融合生殖特性的优良苹果砧木平邑甜茶 (几妇usI hul 咒h
~
) 与主基因显性矮化资源
“扎按 7夕 《从 加“ 日白 ) 杂交所获得的实生后代中的有性杂种群体为试材 , 采用集群分析法共筛选 73 0 个
O讲orn 随机引物或引物组合 , 获得 2 个与 D w 墓因连锁的 RA P D 标记 , 分别是 F 04 一80 0 和 F 03 一 1150 , 且与
D w 基因的连锁距离分别是 1.4 0 c M 和 25 . 5 c M .
关健词 : 兼性无融合生殖 ; D w 基因; RA P D 标记
为了适合国际果品市场上的竞争要求和持续变化 , 各国竞相采用了矮化密植的集约化栽培制度 ,
其中矮化砧木的应用是该制度的重要措施之一 。 但是普通无性系矮化砧木采用的扦擂 、 压条等繁殖方
式容易造成病毒艾延 、 并且固地性差; 采用中间砧和组培繁殖则增加了生产成本 ; 种子繁殖方式因为
无法保持其固有的矮化性而不能采用 。 而无融合生殖型矮化砧木是解决这一问题的重要途径 。
19 1 年 , 我国发现了苹果属第一个主基因显性矮化资源扎矮 7 6 ` , I, 用其作父本或母本的杂交后代
均表现普通株与矮生株 1 :l 分离 , 且无中间类型 。 这一显性矮化主基因被定名为 D w 基因 。 自 19 92
年起 , 沈阳农业大学即利用该矮生资源 “扎矮 76 ” 与综合性状好的平邑甜茶杂交进行了无融合生殖矮
砧育种的研究工作 , 获得 5 株矮生后代 , 并采用 R A PD 技术鉴定出 4 0 株普通型杂种后代 3`1 。 为了提
高苹果无融合生殖矮化砧木育种效率 , 用分子标记技术预先选择 , 我们采用了 RA PD 技术 , 对苹果属
显性矮化主基因 D w 进行了分子标记的研究。
1 材料与方法
1
.
1 试材 19 6年春从沈阳农业大学果树园艺系育种圃 , 取平邑甜茶与 “ `扎矮 76 ” 及其杂种后代共
9 5 株的幼叶 , 分装于塑料袋中, 加冰后运到北京市林业果树研 究所备用 。
1
.
2 方法 D N A 提取 参见张开春等 ’ 21 从苹果韧皮部提取 D N A 的方法 , 取 0 . 5 c m , 的幼叶置于 1 . 6
m L 离心管中, 加入 4 0 0匹 提取缓冲液 ( 2 0 0 m m o l /L rT is 一 H C I p H s . o , 7 0 m m o l几 E o认 , 2 m o 一几 N ac l ,
2 0 m m of 几偏重亚硫酸钠) , 研磨至提取液混浊 , 组织变白后 , 加入 10 0 林L S%肌氨酸钠 , 混匀后 65 ℃
水浴 l h , 期间倒置 2 次 , 13 O00 mr/ in 离心 巧 m in , 上清液转入一新离心管 , 加入等体积氯仿一异戊醇
混合液 ( 24 : l) , 混合后 13 00 r /m in 离心 s m in , 将上层水相转入另一新离心管中, 加入 12/ 体积 10
m o lL/ N H沐 e 及等体积异丙醇 , 混合后一 2 0℃静置 30 m i n , 13 0 00 r/ m i n 离心 15 m i n , 7 0 % 乙醇洗 2 次 ,
室温干燥后溶于 5 0 林L TE ’ ( 10 m m o l几 rT i s 一H C I , 0 . 1 m m o l几 E DTA , pH S . O ) 中, NR as e 消化 l h
。
0
.
7
% 琼脂糖电泳和 D u 一 10 OL 型紫外分光光度计检测 , 并调整 D N A 含量至 10 n留林L 左右。
采用 M i e h e lm o er R W 等 ( 19 9 1) 的 B u lk e d s e g er g an t A n a ly s i s ( B s A ) 方法 “ , , 分别提取杂种后代
单株的基因组总 D N A , 随机从矮生杂种和普通杂种中各取 10 株后代的 D N A 样品 , 分别等量混合
D N A
, 构成 2 个 D N A 库 , 即 D w 库和 dw 库 。
CP R 反应在 Id ha o eT e h n o l o群 公司生产的 A i r T h emr o 一C y e l e r 16 0 5 型毛细管 p C R 仪上进行 , 采用
10 林L 反应体积 : 含 10 m m o lL/ rT i s一 H C I (p H S . 3 ) , 5 0 m m o l几 K C I , Z m m o lL/ M g C 12 , o . o l m g/ m L 明胶 ,
0
.
2 m m o l几 dN T p (每种) , 5 陀 牛血清蛋白 , 7 . 5 n g 10 一m e r 随机引物 , 1U aT g D N A 聚合酶 , 10 n g 基
* 该研究受北京市科技新星计划和北京市果树逆境生理实验室资助
张开春 : 男 , 3 岁 , 博士 , 副研究员
收稿 日期 : 19 9 8一 10一 0 5
农 业 生 物 技 术 学 报 199年
因组总 DN A。 反应程序为前 2 个循环 9 3℃ 0 3 5、 6 3℃ 3 5 5、 72 ℃ 70 5, 斜率 l ; 随后 4 8 循环仅将变性
时间缩短为 10 5 , 其它不变 ; 最后 7 2 ℃延伸 5 m in 。 双引物 R A P O 4`1 扩增是任意选用 2 个 OP e or n 10 -
m er 随机引物 , 每引物用量 .3 75 n g , 余同单引物扩增 。 R A PD 扩增产物电泳采用 1 . 5% 琼脂糖凝胶 , 澳
化乙锭 (E B ) 染色 , AT E 电泳缓冲液 , 4一 S V c/ m 电压下电泳后 , 紫外灯上观察 , Pol aor id 6 7 胶片照像 。
1
.
3 数据分析 按 B CI 群体 , 采用 M A PM A K E R 软件分析计算连锁遗传距离 。
2 结果与分析
采用 B S A 方法共筛选了 O ep or n 随机单引物 52 0 个 , 分别是 A 组到 Z 组的每组 2 0 个引物 ; 筛选
双 引物对 2 10 个 , 分别是 D 组 + A l l 、 D 组 + A 12 、 D 组 + A 13 、 D 组 + A 14 、 D 组 + A 16 、 D 组 +
A 1 8
、
D 组 + A 19 、 D 组 + A 2 0 、 S 组 + O() l 、 S 组 + O() 2 共 2 0 0 个及 A 17祀0 2 、 A 17祀 12 、 A 17+F 0 7 、
A 1 7+ F 12
、
C 0 2祀 12 、 C 0 2 + FO7 、 C 0 2 + F 12 、 C 12+ F0 7 、 C 一2+ r 12 、 F0 7+ F 12 共 10 个引物对 ; 总计筛选
73 0 个引物或引物组合 。 其中 73 个引物或引物组合未扩增或扩增不良, 剩余的 65 7 个引物或引物组合
扩增出 3 92 3 条 RA P D 谱带 , 平均扩增出 .5 4 条谱带。 重复结果表明 , 在集群间有 1 个引物具多态性 ,
扩增出 13 条多态性谱带 , 分别是 A 12一 12 0 0 , A Zo 一4 5 0 , J o s 一30 0 , B o 7一4 5 0 , B o 7 一50 0 , r o 3 一 r一5 0 ,
F0 4
一
80()
,
G o l
一
550
,
M 18
一
3 2 0
,
M 18
一
3 5 0
,
O() 4
一
50 0
,
Qo g
一
6 0 0
,
A 17 r l Z
一
l 20()
。 以父母本 D N A 为模
板扩增 , 发现这些多态性谱带均来源于父本 “扎矮 76 ” 。
分别用这些多态性引物 , 扩增部分或全部杂种后代单株的 D N A 样品 , 检验这些多态性 D N A 谱带
与 wD 基因的共分离情况
, 结果发现多态性 ND A 片段 B o 7
一
450 与 B 0 7一 50 , F 0 3一 1 150 , F04 一80 ,
0 4
一
8 0 0
,
0Q 9
一
6 0 0 在供试群体 中的遗传分离情况均符合 1 :l 分离比例 (表 l ) 。 假设它们与 D w 基因
独立分离 , 其 X , 值分别为 1 9 . 9 7 * * 、 19 . 10 * * 、 一1 . 3 4 * * 、 2 3 . 5一* * 、 9 . 0 4 * 、 一7 . 8 5 * ’ , 均超过了产习 . 0 5 或
=P .0 ol 的显著水平 , 说明它们与 D w 基因存在共分离现象。 采用 M A p M A K ER 计算机软件分析连锁关
系 , 发现 F 04 一 80 0 (图 ) 、 Fo 3 一 1 15 0 与 D w 基因的连锁遗传距离分别为 I 4 e M 和 25 . 5 e M , L o D 值分别
为 5 . 7 4 和 2 . 5 1 , F 0 4一 8 0 0 与 FO3一 1 15 0 间的 L O D 值为 3 . 16 。
表 l 多态性 R A P D s 的遗传分析
aT b le l G e n e ti e se g er g at i o n o f op ly mo 印h ie RA P D s
标记
观察值
十 : 一
理论值
+ : 一
观察值 理论位
D w 十 : D w 一 : d w + : d w 一 D W十 : D w 一
2 1 : 7
3 3 : 3 3
4 : 2 :
2 7 ) : 2 7 )
2 7 ) : 2 7
.
5
补 2
1 1 : 2
7
.
5 : 7
.
5
10 ) : 10
.
1 1
.
5 : 1 1
.
: d w + : d w 一
2 0 : 2 0
20 : 2 0
7 5 : 7
.
5
5 : 10
5 : 8
: 10
: 8
2 2 : 6 2 7
.
0 : 2 7刀 : 18 : 18
19
.
97 二
19
.
10 * *
1 1
.
34 * *
2 3
.
5 1二
9
`以 .
17
.
8 5 . *
3:71814234 0二18178230540
1725引5132048B 0 7一 4 50
B 0 7
一
51洲)
F0 3
·
115 0
F04
.
8(洲)
O M
.
8《X )
《淇)9一 6 0()
4 7乃 : 4 7 )
4 7乃 : 4 7 )
巧刀 : 1 5, 0
2 0 5 : 2 0 5
19 5 : 1 9 5
4 5刀 : 4 5 .0
注 : + : 阳性 , 一 : 阴性 , l〕从 r: 矮生 , d w : 非矮生 , D w + : 矮生有特异谱带 , D w 一 : 矮生无特异谱带,
d w +: 非矮生有特异谱带 , d w 一 : 非矮生无特异谱带, * : 5%水平显著 , * * : l%水平显著。
4 讨论
集群分析法 ( B ul ked se ger g a n t A na lys is ) 的原理是将 目标性状有分离的群体分成 2 组 , 混合基因组总 ND A
, 构建两个对比 ND A 库 (P 0 1)
, 从而使 ND A 库内目标基因表现型一致而其它性状曾随机的杂合状态 , 再采用分子标记技术寻找两库间的多态性差异位点, 进而获得与目标基因相连锁的分子
标记 。 这种方法的诞生打破了以前只能用近等基因系快速寻找目标基因连锁标记的限制 , 为快速筛选
大量 目标基因的分子标记提供了方法 。 我们的研究也证明了 B S A 法是一种快速而有效的筛选 D w 基因
的方法 。 在 B S A 方法中, 为了保证 D N A 混合样品中的每一份都能得到有效的扩增, 一般使用 10 个个
体构建 D N A 库 。 但是 , 由于显花植物基因组约在 5 .0 、 1护M b 之上 , 有功能的基因约在 x3 l o ` 个左右 ,