全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2002 , 29 (1) : 1～4
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2001 - 11 - 02 ; 修回日期 : 2002 - 01 - 15
基金项目 : 农业部重点科研计划“高新技术与基础研究”项目 (95 农 15 - 03) ; 辽宁省科委资助项目 (962332)
一个与苹果属显性矮生主基因 Dw 连锁的 RAPD 标
记
毕晓颖1 　吴禄平1 　安利佳2
(1 沈阳农业大学园艺系 , 沈阳 110161 ;　2大连理工大学生化工程研究所 , 大连 116012)
摘 　要 : 运用 RAPD 技术 , 采用集群分析法进行了苹果抗寒矮化种质资源扎矮 76 〔Malus baccata (L. )
Borkh. 〕显性矮生主基因 Dw 连锁的分子标记研究 。研究结果表明 , 扎矮 76 的矮生性状由显性单基因控
制 , RAPD 标记 OPE1521001 与 Dw 基因连锁 , 其连锁距离为 0. 69 cM。这为最终定位及克隆该矮生基因打下
基础。
关键词 : 苹果属 ; Dw 基因 ; RAPD 标记 ; 矮生
中图分类号 : S 661. 1 ; Q 786 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2002) 0120001204
随着苹果矮化密植集约化栽培的发展 , 迫切需要优良的矮化砧木和矮化品种。目前生产上应用的
矮化砧木和矮化品种的矮化性状由多基因控制 , 通过常规育种技术很难进行遗传改良。1991 年内蒙
古呼伦贝尔盟农科所发现一株普通山定子皱叶矮生突变株 , 定名为扎矮 76。进一步研究发现 , 该矮
生性状由显性矮生主基因 Dw 控制 , 这是世界上首次发现的极其珍贵的苹果矮生源〔1〕。该基因的分离
对了解苹果矮化机制及利用基因工程实现矮化砧木和矮化品种的遗传改良具有重大意义。为进一步研
究该基因 , 我们于 1998 年春以寒富 (富士 ×东光) 为母本 , 以扎矮 76 为父本进行杂交 , 获得了 Dw
基因分离群体。目的基因的克隆与分离往往依赖于与该基因连锁的分子标记。RAPD〔2〕技术是近年来
发展起来的分子标记方法 , 具有多态性水平高、不需预先知道模板 DNA 序列信息和 DNA 样品用量少
等优点。因此 , 本研究利用 RAPD 技术采用集群分离分析 (Bulked Segregant Analysis , BSA) 方法〔3〕筛
选与 Dw 基因连锁的分子标记 , 旨在为该矮生基因的定位与克隆打下基础。
1 　材料与方法
1. 1 　供试材料
试材为扎矮 76 [ Malus baccata (L. ) Borkh. ]、寒富与寒富 ×扎矮 76 杂种后代 , 其中普通型植株
117 株 , 矮生型植株 113 株。
1. 2 　研究方法
1. 2. 1 　苹果 DNA 提取 　苹果叶片 DNA 提取参照 Heymes〔4〕的简易 CTAB 法 , DNA 浓度用琼脂糖凝胶
电泳法测定 , 最后将模板浓度调至 15 ng/μL。
1. 2. 2 　PCR 扩增与产物检测 　PCR 扩增反应在 PE9700 型 DNA 扩增仪上进行。反应体积 20μL , 其中
Tris2HCl10 mmol/ L (pH 8. 0 ) , MgCl2 2. 5 mmol/ L , dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 0. 2 mmol/ L , 引物 0. 2
μmol/ L , 总 DNA 5～50 ng , 0. 5 UTaq DNA 聚合酶 ( TaKaRa) 。整个反应程序为 : 95 ℃预变性 5 min ,
94 ℃变性 30 s , 37 ℃退火 1 min , 72 ℃延伸 1 min 40 s , 扩增 45 个循环 , 最后 72 ℃延伸 5 min。扩增产
物在 1. 5 %琼脂糖凝胶中电泳 , 经 EB 染色在紫外灯下观察 , 记录多态性片段。
1. 2. 3 　Dw 基因分子标记研究 　根据植株形态将杂种分为普通型、矮生型两个集群。分别提取杂种
后代单株的基因组总 DNA , 采用 Michelmore 等的 BSA 方法〔3〕, 随机从矮生杂种和普通杂种中各取 10
株后代的 DNA 样品等量混合 , 构成一对矮生型和普通型近等基因池 , 对这两个混合的 DNA 进行 PCR
扩增筛选引物 , 扩增产生多态性的引物可能是与 Dw 基因相关的 RAPD 引物 , 再以杂种后代群体中每
个单株的 DNA 做模板用该引物进行扩增 , 分析 RAPD 标记在矮生型和普通型后代的共分离情况。利
用 Mapmaker 3. 0 软件分析 RAPD 标记与 Dw 基因连锁关系及遗传距离。
1. 2. 4 　RAPD 片段的克隆和测序 　用 Geneclean DNA 回收试剂盒 ( Takara) 回收 RAPD 片段 , 然后用
PGEM2T载体 (Promega) 对回收片段进行克隆 , 重组质粒DNA 使用Big Dye Kit (Pharmacia) , 按操作指
导在 ABI377 型测序仪上进行测序。
2 　结果与分析
　　寒富与扎矮 76 杂交种子萌发后共获杂种后代
230 株 , 其中普通型植株 117 株 , 矮生型植株 113
株 , 经 X2 测验符合 1∶1 分离比例 , 说明该矮生性
状由显性矮生主基因 Dw 控制 , 这一结果和孟庆
炎〔1〕利用扎矮 76 ×M9 所获得的结论一致。
以矮生型与普通型苹果的近等基因池 DNA 为
模板 , 选用 Operon 公司的 202 个随机引物进行
RAPD 分析 , 引物 OPE15 在矮生型近等基因池中
扩增出一条特异谱带 OPE1521001 , 在普通型近等
基因池中不存在。进一步研究表明 , OPE1521001
在携带 Dw 基因的父本 (扎矮 76) 扩增出 OPE152
1001 , 而母本 (寒富) 不存在 , 在杂种后代中随
机选取 9 株矮生型和 7 株普通型植株进行初步连
锁分析 , 矮生型植株的 RAPD 谱带均出现 OPE152
1001 , 普通型植株均未出现该带 (图 1) 。最终用
引物 OPE15 对 144 株后代 (矮生型 80 株 , 普通型
64 株) 进行 RAPD 扩增 , 矮生型后代中除一株未
出现该带 , 其余均出现 OPE1521001 谱带 ; 普通型
后代均未出现该带 (见表 1) 。测序结果表明 , 该
片段长 1001bp (图 2) 。该片段碱基序列见图 3。根
据上述结果认为 , OPE1521001 为矮生型植株的特
异性 RAPD 标记 , 144 株后代中仅有一株重组株 ,
OPE1521001 与 Dw 基因紧密连锁 , OPE1521001 与
显性矮生主基因 Dw 之间的连锁距离为 0. 69 cM。
图 1 　引物 OPE15 扩增矮生型与普通型苹果
近等基因池的 DNA多态性
M. Marker (λDNA/ EcoR Ⅰ+ Hind Ⅲ)
1. 矮生型 ; 2. 普通型
Fig. 1 　Amplification patterns of dwarf and normal
bulks with primer OPE15
M. Marker (λDNA/ EcoR Ⅰ+ Hind Ⅲ) ; 1. Dwarf Bulk ;
2. Normal Bulk
表 1 　OPE1521001 与株型在寒富×扎矮 76 后代中的共分离分析
Table 1 　Cosegregation for Dw and RAPD marker in the
Hanfu ×Zhaai 76 progeny
株型
Phenotype
株数
No. plants
OPE1521001
存在
Presence
不存在
Absence
组率
Recombination
frequency( %)
矮生型 80 79 1
Dwarf 0. 69
普通型 64 0 64
Normal
图 2 　引物 OPE15 对扎矮 76、寒富及 F1 单 DNA扩增结果
1. 扎矮 76 ; 2. 寒富 ; 3～7. F1 矮生型后代 ; 8～17. F1普通型后代　M. Marker (λDNA/ EcoR Ⅰ+ Hind Ⅲ)
Fig. 2 　Amplification patterns of Zhaai 76 , Hanfu and their F1 individuals with primer OPE15
1. Zhaai 76 ; 2. Hanfu ; 3 - 7. Dwarf F1 individuals ; 8 - 17. Normal F1 individuals ;
M. Marker (λDNA/ EcoR Ⅰ+ Hind Ⅲ)
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图 3 　Dw 基因的 RAPD 标记 OPE1521001 的 DNA序列
Fig. 3 　DNA sequence of OPE1521001
3 　讨论
目前 , 研究与目标性状连锁的分子标记多采用近等基因系法和 BSA 法。由于近等基因系需要多
代回交才能获得 , 周期很长 , 对于个体大、童期长的果树来说更加困难〔5〕。Michelmore 等提出的集群
分析法 (BSA) 很好地解决了这一问题。BSA 法的原理是将群体按目标性状分离分为两个集群 , 再采
用分子标记技术寻找两集群间的多态性 , 进而获得与目标基因相连锁的分子标记。在对 Dw 基因连锁
分子标记分析时 , 我们也采用了此方法。本研究表明BSA 法是一种快速而有效的筛选与 Dw 基因连锁
的分子标记的方法。
本试验所获得的 Dw 基因连锁分子标记 OPE1521001 , 比以往的 14. 0 cM〔6〕更近了许多。一般进行
染色体步移要求的分子标记与目的基因间的遗传距离要小于 1cM , 因而 , 该分子标记的获得 , 为最终
进行 Dw 基因的克隆打下了良好的基础。
参考文献 :
1 　孟庆炎. 苹果属中发现抗寒矮化种质资源. 中国果树 , 1991 , (3) : 42
2 　Williams J G K, Kubelik A R , Livak KJ , et al . DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids
Research , 1990 , 18 (22) : 6531～6535
3 　Michelmore R W , Paran I , Kesseli R V. Identification of markers linked to disease2resistance genes by bulked segregant analysis : A rapid method to
detect markers in specific genomic Regions by using segregating populations. Proc. Natl . Acad. Sci . USA , 1991 , 88 : 9828～9832
4 　Haymes K M. Mini2prep method suitable for a plant breeding program. Plant Molecular Biology Reporter , 1996 , 14 (3) : 280～284
5 　Martin G B , Williams J G K, Tanskley S D. Rapid ientification of markers linked to pseudomonas persistence gene in tomato by using random primers
and near isogenic lines. Proc. Natl . Acad. Sci . USA , 1991 , 88 : 2236～2340
6 　张开春. 苹果属 ( Malus) 显性矮化主基因 Dw 的 RAPD 分子标记. 农业生物技术学报 , 1999 , 7 (2) : 15～18
31 期 　　　　　　　　　毕晓颖等 : 一个与苹果属显性矮生主基因 Dw 连锁的 RAPD 标记 　　　　　　　　　　
A RAPD Marker Linked to a Dominant Dwarf Gene in Apple
Bi Xiaoying1 , Wu Luping1 , and An Lijia2
(1 Shenyang Agriculture University , Shenyang 110161 ;　2 Dalian University of Technology , Dalian 116012)
Abstract : Randomly Aplified Polymorphic DNA (RAPD) was employed to detect a molecular marker linked to
the dominant dwarf gene in apple. A RAPD marker OPE1521001was proved to be linked to the dwarf gene. The ge2
netic distance is 0. 69 cM. This work has provided a basis for locating and cloning Dw gene in the future.
Key words : Apple ; Dwarf gene ; RAPD marker
收稿日期 : 2001 - 08 - 15 ; 修回日期 : 2001 - 12 - 15
基金项目 : 国家科委“九五”攻关课题资助。3 现工作单位莱阳农学院
铵态氮促进水培番茄膜质过氧化产物形成
孙朝晖 3 　程 　斐 　赵玉国 　李式军
(南京农业大学园艺学院 , 南京 210014)
NH+4 2N Accelerated Lipid Peroxidation Materials in Tomato Leaves in Nutrient Solution Cul2
tivation
Sun Zhaohui , Cheng Fei , Zhao Yuguo , and Li Shijun
( Horticultural College of Nanjing Agricultural University , Nanjing 210014)
关键词 : 番茄 ; 氨中毒 ; 丙二醛 ; 活性氧
中图分类号 : S 641. 2 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2002) 0120004201
1 　材料与方法
以‘申粉三号’番茄为试材 , 以 KNO3 67 g、MgSO4 49. 2 g、KH2PO4 17. 8 g、Ca (NO3) 2 70. 8 g、H2O 200 L 营养液
配方育出六叶一心的无土苗。将番茄苗定植到水培槽中。设 30 %、50 %和 70 % NH +4 2N 浓度处理 , 营养液配方分别为 :
(1) Ca (NO3 ) 2 70. 8 g、NH4NO3 60. 8 g、NH4H2PO4 15. 4 g、MgSO4 49. 2 g、K2SO4 69. 6 g、H2O 200 L ; (2) Ca (NO3 ) 2
11. 48g、NH4NO3 32 g、NH4 H2PO4 15. 4 g、MgSO4 49. 2 g、K2SO4 69. 6 g、CaCl2 32. 2 g、H2O 200 L ; (3) Ca (NO3 ) 2 44. 28
g、NH4H2PO4 15. 4 g、(NH4) 2SO4 73. 9 g、MgSO4 49. 2 g、K2SO4 69. 6 g、H2O 200 L。以上营养液微量元素配方均以园试
配方为标准。以育苗所用 100 % NO3 - 2N 处理为对照。每处理 24 株。试验在光照培养室中进行 , 空气湿度 80 %左右 ,
光强约 280μmol·m - 2·s - 1 , 每天光照 12 h , 昼温 25～30 ℃, 夜温 15 ℃左右 , 隔 45 min 后通气 25 min。定植后第 1、3、
6、9 天分别取各处理的叶片 , 每次 6 株 , 进行 MDA 和 O -·2 含量的测定。
2 　结果与分析
50 %和 70 % NH+4 2N 处理后第 3 天叶片MDA 含量就比起始高 , 并持续明显上升 ; 营养液中NH +4 2N 浓度越高 , 叶片
中 MDA 含量也越高 ; 30 % NH+4 2N 处理在第 3 天 MDA 含量较起始高 , 但第 6 天开始保持在较稳定的水平。0 和 30 %
NH+4 2N 处理 O -·2 始终保持在较低水平 , 而 50 %和 70 % NH+4 2N 处理 O -·2 水平在短时间内就有较大幅度上升 , 随时间推
移 , 不断升高。
已证明植物对 NH+4 2N 的吸收为被动扩散过程 , 这可导致番茄对 NH +4 2N 过度吸收而在体内大量积累。这种积累过
程是与活性氧产生速率的增加和膜脂过氧化产物 MDA 的大量产生同步的 , 随之而来的是叶绿体结构遭到破坏 , 光合
强度下降 , 因此 , NH+4 2N 引起膜脂过氧化可能是氨中毒发生的根本原因。本试验中 30 % NH +4 2N 处理活性氧含量随时
间推移没有升高 , 而 MDA 含量却上升 , 这一结果是否预示着 NH +4 2N 还可以引发其他膜质过氧化启动因子的产生或者
NH+4 2N 本身可以直接导致膜质过氧化 , 还是在活性氧测定过程中误差造成 , 仍需继续研究。
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