全 文 ：桃属植物 RAPD反应体系的优化
宗成文 , 　曹后男＊ , 　赵成日 , 　朴日子 , 　朱 波
(延边大学农学院 园艺系 , 吉林 龙井 133400)
摘要:以`Yuuzora 、珲春桃 、有明及其F1 杂种群体为试材 ,对桃属植物的 RAPD反应体系进行
优化 , 结果表明:25 μL 总反应体积中含模板 DNA 10 ～ 200 ng , 引物 20 pmol , dN TP
150 μmol/L ,MgCl2 1.5 mmol/L ,国产 Taq DNA聚合酶1 unit ,10×反应缓冲液2.5μL ,其余用
重蒸馏水补充.热循环条件为:预变性 94 ℃,5 min ,变性 94 ℃, 1 min ,退火 36 ℃, 1 min ,延伸
72 ℃,2 min ,共 50个循环;72 ℃最终延伸5 min.应用优化后的反应体系获得的 RAPD指纹图
谱带型清晰 、重复性好.
关键词:桃属植物;RAPD;反应体系;优化
中图分类号:S602.3 ,S662.1　　文献标识码:A　　文章编号:1004-7999(2005)03-0153-06
20世纪 80年代以来 ,分子标记技术在作物遗传育种领域得到了广泛应用.目前 ,在果
树上应用较多的 RAPD(Random amplified polymorphic DNA)技术是由美国杜邦公司的
Willams等[ 1]和加利福尼亚生物研究所的Welsh 等[ 2]在 1990年同时推出的.RAPD 技术是
根据 PCR(Polymerase chain reaction)原理 ,以任意序列 10碱基寡核苷酸片段为引物 ,以待扩
增DNA 为模板 ,通过 PCR仪进行 DNA 片段随机合成.合成的 DNA 片段经电泳分离和溴
化乙锭染色 ,在紫外光下就可以看到新合成的不同大小的 DNA 片段形成的带 ,带的多态性
反映了模板 DNA 相应区域的多态性.RAPD标记的特点是多态性较高 ,信息量大;模板用量
少 ,对DNA 的质量要求不高;操作简便快速 ,效率高 ,可以实现自动化;成本相对较低 ,不需
使用放射性同位素 ,安全性高.迄今为止 ,国内外对 RAPD 在果树上的应用研究主要是在品
种鉴定 、分类研究 、系谱分析 、遗传图谱构建 、特殊性状的基因标记等方面 ,涉及绝大多数果
树种类[ 3～ 5] .
RAPD技术对反应条件比较敏感 ,重复性较差 ,且受 PCR仪型号 、药品 、环境条件等影
响[ 6] .许多研究表明 ,采用优化的反应体系可获得重复性好 、稳定性高的 RAPD 谱带[ 7～ 9] .
因此 ,在进行 RAPD 分析时 ,首先要摸清其在供试材料上的最佳反应条件 ,建立起具有高度
重复性的反应体系.本研究拟以一些桃属植物为试材 ,找出适合桃 RAPD分析的反应体系.
1　材料与方法
1.1　供试材料
供试材料为珲春桃和`Yuuzora ,珲春桃×有明亲本及其 15 株 F 1 杂种.于 6 月上旬采
集完全展开的幼嫩叶片 ,在液氮中将其研磨成粉末 ,放入-70 ℃的低温冰箱中保存备用.
第 27卷　第 3期
2005年 9月 　 　　　　　 延　边　大　学　农　学　学　报Journal of Agricultural Science Yanbian University 　　　　　Vol.27 No.3　Sep.2005
收稿日期:2005-06-25　　　基金项目:国家自然科学基金资助项目(30160054)
作者简介:宗成文(1974—), 男 ,吉林珲春人 , 延边大学农学院园艺系讲师 ,在读博士.曹后男为通讯作者 ,
Tel:0433-3264624 , E-mail:hncao@ybu.edu.cn.
DOI :10.13478/j.cnki.jasyu.2005.03.001
1.2　试验方法
1.2.1　基因组 DNA的提取及定量稀释
DNA 的提取采用 CTAB 法[ 10] .提取的基因组 DNA 用 Hitachi U-3010 紫外可见分光
光度计测定其 OD 260 值 ,计算 DNA 原液浓度 C ,其公式为 C=OD260×50×稀释倍数.将
DNA 用 TE缓冲液[ Tris-HCl 10 mmol/L(pH=8.0), EDTA 1 mmol/ L(pH=8.0)]稀释成
10 ～ 100 ng/μL ,保存于-20 ℃的冰箱中备用.
1.2.2　RAPD 反应
1)基本反应条件　首先确立基本反应条件 ,即 PCR反应总体积 25 μL ,其中含模板 DNA
10 ng , 引物 10 pmol , dNTP 150μmol/ L , MgCl2 1.5 mmol/L , Taq DNA聚合酶 1 unit , 10×反应
缓冲液 2.5μL ,以重蒸馏水补充至 25μL.以此为基本反应条件 ,对反应体系中的模板DNA 、引
物、dNTP、MgCl2 、Taq DNA 聚合酶分别设置不同梯度并进行优化 ,确定最适值.
2)热循环条件　PCR反应在 DB 80240-33型 PCR仪上进行 ,扩增程序为:94 ℃预变性
5 min;94 ℃变性 1 min , 36 ℃退火 1 min ,72 ℃延伸 2 min ,共 50个循环;72 ℃最终延伸 5 min.
3)　凝胶制备及点样　在微型胶床上放好梳子 ,准备制胶.用 TBE 缓冲液配置一定量
的 1.4%琼脂糖 ,电炉加热熔化后加入 10 mg/mL溴化乙锭(EB),最终浓度为 0.5 μg/mL.
凝胶固定后 ,轻轻拔出梳子 ,凝胶上出现加样孔后 ,用移液器加入 10 μL 含 6×加样缓冲液
的 DNA 样品于样孔中.
4)　电泳　点样后 ,用 DYY-Ⅲ型电泳仪进行电泳 ,电泳缓冲液为 0.5×TBE(pH=8.2),
在 3 ～ 4 V /cm恒压下电泳 3 ～ 4 h ,用GDS-8000凝胶成像系统照相 ,进行 RAPD分析.
2　结果与分析
根据建立的基本反应体系 ,对反应体系中模板 DNA 、引物 、dNTP 、MgCl2 、Taq酶浓度或
用量设不同处理 ,选择最适反应体系.
2.1　模板浓度对扩增效果的影响
　　图 1　模板 DNA浓度对 RAPD扩增效果的影响(A:`Yuuzora 、珲春桃 DNA ,引物 OPA04;
B:有明 、珲春桃 DNA ,引物 OPA01)
　　Fig.1　The effects of template DNA concentration on RAPD-PCR amplification.(A:`Yuuzora ,
`Hunchuntao DNA , primer OPA04;B:`Yumyong , `Hunchuntao DNA ,primer OPA01)
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　　将`Yuuzora 、珲春桃 DNA 从 5 ～ 25 ng 设 5 个浓度梯度 ,用引物 OPA04 进行扩增
(图 1-A).可以看出 ,这几个浓度梯度间的扩增效果无明显差异 ,均可获得清晰的扩增谱
带.为进一步探讨 DNA 浓度对扩增效果的影响 ,又以有明 、珲春桃为模板 ,从 40 ～ 400 ng 设
10个浓度梯度 ,用引物OPA01进行扩增(图 1-B).结果表明:DNA 40 ～ 400 ng 扩增效果无
明显差别 ,带的样式也没有明显变化 ,仅在 350 ng 以上时缺失了 1 600 bp带 ,说明桃 RAPD
反应对模板 DNA 浓度不太敏感(模板 DNA 用量采用 10 ～ 200 ng).
2.2　引物浓度对扩增效果的影响
以` Yuuzora DNA为模板 ,将引物OPA04、S17设置不同的浓度梯度进行扩增(图 2).可以
看出 ,引物浓度对反应影响较大 ,引物浓度较低时(1 , 5 pmol)没有扩增出条带或缺失大部分
带 ,引物量在 10～ 20 pmol时带型清晰 ,但在 10 , 15 pmol时也缺失了部分小片段带.引物量在
20 pmol时扩增产生的带型清晰 ,重复性好.因此 ,本研究以 20 pmol的引物量为最适值.
图 2　引物浓度对 RAPD扩增效果的影响(DNA `Yuuzora ,引物OPA04 、S17)
　　　　　　Fig.2　The effects of primer concentration on the amplification of RAPD-PCR
(DNA `Yuuzora ,primer OPA04 , S17)
2.3　dNTP浓度对扩增效果的影响
以 DNA `Yuuzora 为模板 , OPA04 为引物 , 将 dNTP 浓度设 50 , 100 , 150 , 200 , 300
μmol/L 5个处理进行扩增(图 3).可以看出 , dNTP浓度为 200 , 300μmol/L时缺失大分子量
的带 , 100 μmol/L 时带的重复性不好 , 50 μmol/ L 时则没有扩增出条带 ,只有浓度为 150
μmol/L时带型清晰 ,重复性好.因此 ,本研究的 dNTP浓度以 150 μmol/ L为最适值.
图 3　dNTP浓度对`Yuuzora 桃(引物 OPA04)扩增效果的影响
　　　　　　　　　Fig.3　The effects of dNTP concentration on the RAPD-PCR amplification
of `Yuuzora (primer OPA04)
155　第 3期 宗成文 ,等:桃属植物 RAPD反应体系的优化
2.4　MgCl2浓度对扩增效果的影响
将 MgCl2浓度设 1.0 , 1.5 , 2.0 , 2.5 , 3.0 mmol/ L 5 个处理 ,以`Yuuzora DNA 为模板 ,
OPA04为引物进行扩增(图 4).可以看出 ,MgCl2 浓度对扩增结果的影响较大 ,浓度为 1.0 ,
2.5 mmol/L时谱带不完整 ,缺失大部分带 ,浓度为 3.0 mmol/L 时未能扩增出谱带 ,浓度为
1.5和 2.0 mmol/L时扩增效果较好 ,但相比之下 MgCl2 浓度为 1.5 mmol/ L时的扩增图谱
清晰 ,重复性好.因此本研究的 MgCl2 浓度以 1.5 mmol/L为最适值.
图 4　MgCl2浓度对`Yuuzora 桃(引物 OPA04)扩增效果的影响
　　　　　Fig.4　The effects of MgCl2 concentration on the RAPD-PCR amplification
of `Yuuzora (primer OPA04)
图 5　Taq DNA聚合酶浓度对`Yuuzora 桃(引物 OPA04)扩增效果的影响
　　　　　　Fig.5　The effects of Taq DNA Polymerase concentration on the RAPD-PCR
ampli fication of `Yuuzora (primer OPA04)
2.5 Taq DNA聚合酶浓度对扩增效果的影响
将国产 、进口 Taq DNA 聚合酶用量设 0.5 , 1.0 , 1.5 , 2.0 , 2.5 unit 5 个处理 , 以
`Yuuzora DNA 为模板 ,OPA04为引物进行扩增(图 5).可以看出 ,国产 、进口 Taq DNA 酶
的扩增效果没有差异 , Taq DNA 聚合酶的量在 1.0 , 1.5 , 2.0 unit 时带型清晰 , 0.5 unit 时不
能扩增出完整的带 , 2.5 unit 时带型变模糊 ,且缺失大部分带.综合考虑扩增效果和分析成
本 ,本试验选用国产 Taq 聚合酶 ,以 1.0 unit 为最适值.
综合上述试验结果 ,得出桃 RAPD-PCR的最适反应体系(表 1), 25μL 总反应体系中 ,
模板DNA 10 ～ 200 ng ,引物 20 pmol , dNTP 150μmol/ L ,MgCl2 1.5 mmol/ L ,国产 Taq DNA
聚合酶 1 unit , 10×反应缓冲液 2.5 μL ,其余用重蒸馏水补充.
156 延　边　大　学　农　学　学　报 第 27卷　
表 1　优化后的 RAPD反应体系
Table 1　The RAPD reaction system after optimization
反应成分
Component
浓度
Concentration
最适值
Optimum value
模板 DNA/ng Template DNA 5 ,(10),15 , 20 ,25 ng
40 ,60 , 80 ,100 ,150
200 ,250 ,300 ,350 ,400 10 ～ 200
引物/pmol Primer 1 , 5 ,(10),15 ,20 20
dNTPs/(μmol/ L) 50 ,100 ,(150),200 ,300 150
MgCl2/(mmol/ L) 1.0 ,(1.5), 2.0 , 2.5 , 3.0 1.5
Taq DNA 聚合酶/unit Taq DNA polymerase 0.5 ,(1.0), 1.5 , 2.0 , 2.5 1.0
2.6　优化后反应体系的扩增效果
采用优化后的反应体系 ,用引物 OPA04 对珲春桃、有明及其 15 株 F1 杂种进行扩增
(图 6).可以看出 ,扩增谱带清晰 ,重复性较好.这说明优化后的反应体系适于桃 RAPD反应.
　　　　　图 6　优化后的反应体系对珲春桃 、有明及其 F1 群体扩增效果的影响
M:分子量标记 ,左为 200 bp DNA Ladder ,右为 Lambda DNA/HindⅢ Marke
H为珲春桃 ,Y为有明 ,1 ～ 15为杂种代号.
　Fig.6　The effects of optimized reaction system on Hunchuntao(H),Yumyong(Y)and their F1 hybrids.
M:molecular mark;DNA ladder was on the left , Lambda DNA/Hind Ⅲ marker was on the right;
H:Hunchuntao;Y:Yumyong;1-15:hybrids marks.
3　小结与讨论
RAPD反应的影响因子较多 ,主要有模板 DNA 质量与浓度 、引物的种类与浓度 、DNA
聚合酶 、缓冲系统 、Mg2+ 、dNTP 、扩增程序与 PCR仪型号等许多因素.本试验主要研究了果
树 RAPD 反应体系中报道较多的几个因素:1)关于模板浓度对反应的影响.一般认为在每
个 PCR反应中 , 5 ～ 500 ng(100倍)的DNA 能提供好的结果[ 6] .汪小全等在研究银杉的遗传
多样性时 ,认为模板浓度在相当大的范围内不影响扩增结果[ 8] .Weising 等推荐 DNA 模板
浓度为 5 ～ 10 ng/50μL为最佳.本研究结果表明:5 ～ 400 ng/25 μL(80倍)对扩增结果无明
显影响.鉴于这些结果的差异 ,分析认为 RAPD反应最佳的模板浓度范围取决于研究的类
群与模板纯度 ,而在研究一个新类群时应先确定该类群的最适 DNA 模板浓度范围.2)引物
浓度对扩增结果影响较大 ,浓度太低容易出现部分带的缺失.3)不同厂家 ,不同商标的 DNA
聚合酶常常给出不同的 RAPD 产物 ,应注意不要中途更换酶 ,否则不能重复原来的试验结
果.RAPD反应中酶的用量大都为每反应 0.5 ～ 1 unit ,用量过多会产生非特异性扩增.4)
157　第 3期 宗成文 ,等:桃属植物 RAPD反应体系的优化
Taq DNA 聚合酶需 Mg2+激活 ,因此 RAPD反应应确定最佳 Mg2+浓度.dNTP是 PCR的原
料 ,RAPD反应常用 100 ～ 200 umol/ L ,浓度太低则产率太低 ,而浓度太高易发生错配.
综上所述 ,影响 RAPD 反应的因素很多 ,每一环节的操作不当均可导致扩增结果不能
重复.通过严格控制反应条件 ,可获得较稳定的结果.因此 ,为了增加 RAPD 分析结果的稳
定性和重复性 ,必须建立最优反应体系.
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The optimization of RAPD-PCR reaction system of Amygdalus plants
ZONG Cheng-wen , 　CAO Hou-nan＊ , 　ZHAO Cheng-ri , 　PIAO Ri-zi , 　ZHU Bo
(Horticulture Department , Agricultural college of Y anbian Universi ty , Longjing Ji lin 133400 , China)
Abstract:The `Yuuzora , Hunchuntao , Yumyong and their F1 hybrids were used to optimize
the reaction system of Amygdalus .The result indicated that:in 25 μL total reaction volume of
RAPD-PCR contained 10 ～ 200 ng template DNA , 20 pmol primer , 150 μmol/ L dNTP ,
1.5 mmol/L MgCl2 , 1 unit domestic Taq DNA polymerase , 10 times buffer 2.5μl , others com-
plement with ddH2O.The thermal cycle condition was:initial denaturation at 94 ℃ for
5 minutes;denaturation at 94 ℃ for 1 minutes , annealing at 36 ℃ for 1 minutes , elongation at
72 ℃ for 2 minutes , 50 cycles;final elongation at 72 ℃ for 5 minutes.
Key words:Amygdalus;RAPD;reaction system;optimize
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