全 文 ：第 35卷　第 3期 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) Vol. 35 No. 3
2007年 3月 Journal of No rthw est A& F Univer sity ( Nat. Sci. Ed. ) Ma r. 2007
梨属植物 RAPD反应体系的建立与优化
马艳芝1, 2 ,王向东 3 ,张玉星 1
( 1河北农业大学园艺学院 ,河北 保定 071001; 2唐山师范学院 生物科学技术系 ,河北唐山 063000;
3唐山市农业科学研究院 ,河北唐山 063000)
　　 [摘　要 ]　以鸭梨、杜梨为材料 ,对梨属植物 DN A的提取及 RAPD反应体系进行了系统优化 ,建立了梨属植
物最佳反应体系及参数。结果表明 ,适当提高抗氧化、抗酚类物质的浓度 ( 2% β-巯基乙醇 , 2% PVP-40, 20 mmol /L
Na2 S2O5 ) ,提取的基因组 DNA纯度较高 ;反应体系中含有 Mg2+ 2. 0 mmo l /L , dNT Ps浓度 200μmol / L,引物 0. 4
μmol /L ,模板 DNA 1. 6 ng /μL, Taq DN A聚合酶 0. 06 U /μL,可成功用于梨属植物 RAPD扩增。说明改良的 CT AB
法能成功用于梨属植物 DNA提取 ,建立的最佳反应体系可用于梨属植物 RAPD扩增。
[关键词 ]　梨属植物 ; RAPD;反应体系
[中图分类号 ]　 S188 　　　　　 [文献标识码 ]　 A [文章编号 ]　 1671-9387( 2007) 03-0144-05
Establishment and optimizat ion of RAPD technique in Pyrus L .
M A Yan-zhi1, 2 , WANG Xiang-dong3 , ZHANG Yu-xing1
( 1 Col lege of Horticulture ,Agricultural Universit y of Hebei,Baoding, Hebei 071001,China;
2 Department of Biological Science and Technology , Tangshan Teachers College, Tangshan, Hebei 063000,China;
3 Agricultural Science Academe of Tangshan, Tangshan, Hebei 063000,China)
Abstract: Tested with Yali pear and Betulaefolia , the paper studied the ex tract o f DN A o f Pyrus and
the optimized RAPD reaction sy stem. Th e result show ed as follows: by raising the concentrations of antiox-
ida tiv e components and antiphenolic compounds ( 2% β-ME, 2% PV P-40, 20 mmol /L Na2 S2O5 ) , the puri ty
o f the ex t racted genomic DN A was higher. Its concluded that the optimum reaction sy stem that contained
Mg
2+
2. 0 mmol /L, dN TPs 200μmo l /L, primer 0. 4μmol /L, 1. 6 ng /μL template DN A, 0. 06 U /μL, Taq
DNA polymerase would be applied in the ampli fica tion of RAPD. It explained that refo rmed CT AB method
could ex tract the genomic DN A o f Pyrus successfully , and the optimum RAPD reaction sy stem could am-
pli fica te RAPD in Pyrus L. .
Key words: Pyrus; RAPD; reaction system
　　 RAPD技术是建立在 PCR( Polymerase Chain
Reaction)基础上的一种可对整个未知序列基因组进
行多态性分析的 DNA分子标记技术 [1 ] ,被广泛应用
于果树种植资源研究中。在国外 , 1998年 Bo tta等 [ 2]
应用 RAPD技术研究了意大利皮埃蒙特 ( Piemonte)
的梨种质资源 ,鉴别了 17个梨品种 ,并建立了系统发
育关系图; 2000年 Kim等 [3 ]讨论了 RAPD技术在梨
树品种鉴定方面应用的潜力与局限性 ,并揭示了供试
梨树品种的亲缘关系 ; 2000年 Teng等 [ 4]对原产中国
的梨属植物 13个种进行分析 ,探讨了新疆梨的分类
地位 ,并对供试材料进行了聚类分析。 在国内 , 1998
年王丙旭 [5 ]应用 RAPD技术对梨树种质资源的秋子
梨、砂梨、白梨和西洋梨的 40个品种进行了品种鉴
定、亲缘关系和分类研究。但 RAPD技术在梨属植物
应用过程中 ,优化和稳定体系的研究不系统。本试验
以栽培品种鸭梨和野生品种杜梨为材料 ,在前人已初
[收稿日期 ]　 2006-02-17
[基金项目 ]　河北省自然科学基金项目 ( 303240)
[作者简介 ]　马艳芝 ( 1977- ) ,女 ,河北唐山人 ,讲师 ,硕士 ,主要从事植物学及植物分类学研究。
[通讯作者 ]　张玉星 ( 1961- ) ,男 ,河北沧县人 ,教授 ,博士 ,主要从事果树优质无公害栽培技术与品种改良。
DOI : 10. 13207 /j . cnki . jnwaf u. 2007. 03. 029
步建立起 RAPD反应体系的基础上 ,对梨属植物
RAPD反应体系进行了更加系统的优化 ,使其能更广
泛的应用于梨属植物 ,为 RAPD技术在梨属植物资
源利用方面的应用提供参考。
1　材料和方法
1. 1　材料与药品
　　材料:鸭梨与杜梨成熟叶片 ,采自河北农业大学
标本园。
供试药品:试验所用普通化学试剂购自保定海
泰克生物技术有限公司、保定博爱欣生化试剂公司 ;
所需 PCR试剂 ( Taq DNA聚合酶、 dN TPs、引物等 )
购自上海生工 ( Sangon)生物工程公司 ;电泳检测所
需琼脂糖和 DNA分子量标准 ( Marker: Gene
Ruler
TM
100 bp DN A Ladder Plus)为 MBI产品 ,均
购自上海生工 ( Sangon)生物工程公司。
1. 2　基因组 DNA的提取
基因组 DNA的提取参照经典的 CT AB法 [6 ] ,并
加以改进 ,即在提取液中加入抗酚类、抗氧化物质
2% β -巯基乙醇 , 2% PV P-40, 20 mmo l /L Na2 S2O5。
1. 3　 RAPD扩增
RAPD扩增反应在 Whatman Biometra型热循
环仪上进行。以 0. 2 mL Eppendorf管编号 ,采用 25
μL体系进行 RAPD扩增 ,各组分浓度及其用量分
别为: 10× PCR缓冲液 , 2. 5μL(即 100 mmol /L
KCl, 8 mmo l /L ( N H4 ) 2 SO4 , 10 mmol /L Tris-HCl
( pH 9. 0) ) ; 25 mmo l /L M gCl2 2μL; 5μmol /L引物
2μL; 2. 5 mmo l /L dN T Ps 2μL; 20 ng /μL模板
DNA 2μL; 5 U /μL Taq DNA聚合酶 0. 3μL;
DDW (双蒸水 ) 14. 2μL。加入 20μL矿物油覆盖 ,扩
增程序: 94℃预变性 3 min; 94℃变性 1 min,退火 1
min, 72℃延伸 1. 5 min, 43个循环 ; 72℃保温 10
min,最后 4℃保温 (为了使本体系更加具有广泛
性 ,优化体系过程中使用的引物不是单一的 ,也不固
定 ,随机使用所购买的引物 )。
1. 4　 RAPD扩增产物的检测
RAPD扩增产物用 1. 5%琼脂糖凝胶 (含 0. 5
μg /mL EB)电泳分离 ,电泳缓冲液为 0. 5× TBE,电
泳于 DYY-Ⅲ稳压电泳仪上进行 (电压 3. 5 V /cm)。
根据扩增片段的大小 ,适时停止电泳。电泳结果在紫
外透射仪上观察 ,照相。同时 ,本着节约的原则 ,在体
系优化过程中未使用 Marker。
2　结果与分析
2. 1　基因组 DNA的提取和检测
　　基因组 DNA的提取是 RAPD扩增能否成功的
关键。许多研究表明 [ 7-8 ] ,影响 RAPD扩增的 DNA
杂质往往不是 RNA或蛋白质这些大分子物质 ,而
是多糖类和酚类等小分子物质 ,但梨属植物叶片含
有多糖类和酚类物质。因此 ,在对抗氧化、抗酚类物
质进行浓度梯度预试验基础上 ,适当提高抗氧化、抗
酚类物质的浓度 (本试验采用 2% β -巯基乙醇 , 2%
PV P-40, 20 mmo l /L Na2 S2O5 ) ,用 CT AB法提取梨
基因组 DNA,结果见图 1。图 1结果表明 ,提取的基
因组 DNA多呈透明无色状 ,且易溶于 1× TE中 ,
经过 0. 7%琼脂糖凝胶电泳检测呈 1条亮带。
图 1　部分供试类型基因组 DNA的电泳检测结果
A.去除 RN A; B.未去除 RNA
Fig. 1　 Electr opho r etic products of the genomic DN A fr om ma teria ls of Pyrus tested in this study
A. Treated w i th Rnase; B. Not treated w ith Rnase
　　一般认为 , OD260 /OD280值在 1. 5以上即可进行
RAPD分析 ,本试验中各样品的 OD260 /OD280值均在
1. 6～ 2. 0,只有很少一部分在 1. 4～ 1. 6,表明蛋白
质等杂质均较少 , DN A纯度较高 ,无需去除 RNA
即可用于 RAPD-PCR,为 RAPD稳定扩增奠定了
基础。
145第 3期 马艳芝等:梨属植物 RAPD反应体系的建立与优化
2. 2　 RAPD反应体系的优化
2. 2. 1　模板 DNA用量对 RAPD扩增结果的影响
　在反应体系中 ,其他条件不变 ,加入模板 DNA
0. 4, 0. 8, 1. 6, 3. 2, 6. 4, 12. 8 ng /μL,研究模板 DNA
用量对 RAPD扩增结果的影响 ,结果见图 2。图 2结
果表明 ,在模板 DNA用量为 0. 4～ 12. 8 ng /μL时 ,
鸭梨和杜梨均能产生清晰的带型。 说明模板 DNA
用量对 RAPD扩增结果不太敏感。本试验确定的模
板 DNA用量为 1. 6 ng /μL。
图 2　模板 DN A用量对 RAPD扩增结果的影响
a.鸭梨 ; b.杜梨 ; 1～ 6.模板 DNA用量分别为 0. 4, 0. 8, 1. 6, 3. 2, 6. 4, 12. 8 ng /μL
Fig. 2　 Effec t of templa te concentration on RAPD amplification
a. YaLi pear; b. Betulaefolia; 1- 6. DNA concent ration in ord er: 0. 4, 0. 8, 1. 6, 3. 2, 6. 4, 12. 8 ng /μL
2. 2. 2　 dN TPs浓度对 RAPD扩增结果的影响　
在反应体系中 ,其他条件不变 ,加入 dN TPs的浓度
分别为 50, 100, 200, 400, 600, 800μmo l /L,研究
dN TPs浓度对 RAPD扩增结果的影响 ,结果见图
3。 由图 3可以看出 , dN T Ps浓度低于 100μmol /L
时 ,扩增条带较少 ;浓度在 200μmol /L以上时 ,条带
基本一致 ,其中以 200μmol /L时产生的条带最清
晰。 因此 ,本试验确定的 dN TPs使用浓度为 200
μmol /L。
图 3　 dNT Ps浓度对 RAPD扩增结果的影响
a.鸭梨 ; b.杜梨 ; 1～ 6. dN TPs浓度依次为 50, 100, 200, 400, 600, 800μmol /L
Fig. 3　 Effec t o f dNTPs concentra tion on RAPD amplification
a. YaLi pear; b. Betulaefolia; 1- 6. dN TPs concent ration in order: 50, 100, 200, 400, 600, 800μmol /L
2. 2. 3　 Taq DNA聚合酶对 RAPD扩增结果的影
响　在反应体系中 ,其他条件不变 ,加入 Taq DNA
聚合酶的浓度分别为 0. 02, 0. 04, 0. 06, 0. 08, 0. 10,
0. 12 U /μL,研究 Taq DNA聚合酶对 RAPD扩增
结果的影响 ,结果见图 4。从图 4可以看出 , 0. 02,
0. 04 U /μL处理的谱带少且不清晰 ,而 0. 06～ 0. 12
U /μL处理从条带数量及清晰度上基本无差异。 因
此 ,确定 Taq DNA聚合酶浓度为 0. 06 U /μL。
146 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 35卷
图 4　 Taq DN A聚合酶对 RAPD扩增结果的影响
a.鸭梨 ; b.杜梨 ; 1～ 6. Taq DN A聚合酶浓度依次为 0. 02, 0. 04, 0. 06, 0. 08, 0. 10, 0. 12 U /μL
Fig. 4　 Effect o f Taq DN A po lymera se concentra tion on RAPD amplifica tion
a. Yali pear; b. Betulaefolia; 1- 6. Taq DN A polymeras e concen tration in order: 0. 02, 0. 04, 0. 06, 0. 08, 0. 10, 0. 12 U /μL
2. 2. 4　 Mg2+ 浓度对 RAPD扩增的影响　在反应
体系中 ,其他条件不变 ,分别加入 0. 5, 1. 0, 1. 5,
2. 0, 2. 5, 3. 0 mmol /L Mg
2+
,研究 Mg2+ 浓度对
RAPD扩增结果的影响 ,结果见图 5。由图 5可以看
出 ,在试验浓度范围内都能扩增 ,但 Mg2+ 浓度为
0. 5, 1. 0, 1. 5 mmol /L时 ,扩增出的条带数和扩增
量均少 ,这是由于 Mg2+是 Taq酶的激活剂。Mg2+浓
度低时 , Taq酶活性低 ,而当 Mg2+ 浓度在 2. 0～ 3. 0
mmol /L时 ,均可产生稳定、清晰、一致的扩增带型。
因此 ,本试验确定的 Mg2+浓度为 2. 0 mmo l /L。
2. 2. 5　引物浓度对 RAPD扩增结果的影响　在反
应体系中 ,其他条件不变 ,加入引物浓度分别为 0. 1,
0. 2, 0. 3, 0. 4, 0. 5, 0. 6μmol /L,研究引物浓度对
RAPD扩增结果的影响 ,结果见图 6。 图 6结果显
示 ,引物浓度为 0. 1, 0. 6μmol /L时扩增不稳定 ,其
他浓度产生的扩增结果基本一致。因此 ,本试验确定
的引物浓度为 0. 4μmol /L。
应用该反应体系对部分梨属植物 (表 1)进行扩
增 ,结果如图 7所示。图 7结果表明 ,应用优化后的
体系对 27个梨品种 (系 )、类型进行 RAPD分析 ,都
能得到比较稳定的 RAPD图谱 ,扩增出的条带数在
4～ 8,且有些为多态性条带。
图 5　 Mg2+ 浓度对 RAPD扩增结果的影响
a.鸭梨 ; b.杜梨 ; 1～ 6. Mg2+ 浓度依次
为 0. 5, 1. 0, 1. 5, 2. 0, 2. 5, 3. 0 mmol /L
Fig. 5　 Effect of th e Mg2+ concent rat ion on RAPD amplif ication
a. Yali pear; b. Betulaefolia; 1- 6. Mg2+ concent ration
in order: 0. 5, 1. 0, 1. 5, 2. 0, 2. 5, 3. 0 mmol /L
图 6　引物浓度对 RAPD扩增结果的影响
a.鸭梨 ; b.杜梨 ; 1～ 6.引物浓度依次为
0. 1, 0. 2, 0. 3, 0. 4, 0. 5, 0. 6μmol /L
Fig. 6　 Effect of primer concent ration on RAPD amplif icat ion
a. Yali p ear; b. Betulaefolia; 1- 6. Primer concent ration
in order: 0. 1, 0. 2, 0. 3, 0. 4, 0. 5, 0. 6μmol /L
147第 3期 马艳芝等:梨属植物 RAPD反应体系的建立与优化
表 1　用于 RAPD分析的 27个梨属植物材料
Table 1　 27 materials o f Pyrus applied in this study by RAPD
编号
No.
名称 Name 编号
No.
名称 Name 编号
No.
名称 Name
1 日面红 Flemish Beauty 10 大香水 Daxiang shui 19 早酥梨 Zaosuli
2 延边明月 Yanbianming yue 11 秋白梨 Qiubaili 20 麻梨 Mali
3 绿宝石 Lubaoshi 12 满园香 Manyuanxiang 21 茌梨 Chili
4 京白梨 Jingbaili 13 伏茄 Fuqieli 22 幸水 Xingshui
5 苍溪梨 Cangxi li 14 锦香 Jinxiang 23 八月红 Bayu ehong
6 歪把子 Waibazi 15 佛见喜 Fuo jianxi 24 金坠梨 Jin zh uili
7 车头 Chetou 16 糖梨 Tangli 25 青海马奶头 Qinghaimanai tou
8 矮香 Aixiang 17 红香酥 Hongxiang su 26 甘肃麦梨 Gansumai li
9 蜜香梨 Mixiangli 18 苹果梨 Pingg uoli 27 杜梨 Duli
图 7　 27个供试梨属植物材料的 RAPD图谱
M. Maker; 1～ 27.供试梨属植物
Fig. 7　 27 pat terns of 27 ma teria ls
M. Mak er; 1- 27. Materials of Pyrus applied in thi s study
3　讨　论
基因组 DNA的提取是 RAPD扩增能否成功的
关键。 本试验在提取 DNA的过程中加入抗氧化物
质 ,有效抑制了酚类物质和 DNA的氧化 ,保证了高
质量 DNA的成功提取。结果表明 ,改良的 CTAB法
能成功进行梨属植物 DNA提取。
确定反应体系中每个因子合适的反应参数是保
证 RAPD分析稳定性和重复性的前提 [9 ]。本研究建
立的梨 属植物 RAPD优化反 应体系为: 100
mmol /L KCl , 8 mmo l /L ( N H4 ) 2 SO4 , 10 mmol /L
Tris-HCl ( pH 9. 0) (即 10× PCR缓冲液 , 2. 5μL) ,
Mg
2+
2. 0 mmol /L, dN TPs 200μmol /L,引物 0. 4
μmo l /L,模板 DNA 1. 6 ng /μL, Taq DN A聚合酶
0. 06 U /μL,其余用 DDW。 经与前人结果比较 [ 5, 10]
认为 ,梨属植物 RAPD分析的最佳反应条件在不同
实验室之间有较强的一致性 ,只需对引物、 Taq
DNA聚合酶和 Mg2+的用量进行小幅度调整。
[参考文献 ]
[1 ]　顾红雅 ,瞿礼嘉 .植物分子生物学试验手册 [M ].北京:高等教
育出版社 , 1996: 236-237.
[ 2]　 Bo tta R, Akkak A, Me G, et al. Id en tifi cation of pear cultiv ars
by molecular markers [ J ] . Acta Hort icu lturae, 1998 ( 457 ):
63-70.
[ 3]　 Kim C S, Lee G P, Han D H, et al. Clas sif ication and id en tifi ca-
tion of Pyruse per ihel ia using RAPD [ J]. Journal of Korean So-
ciety for Hor ticultural Science, 2000, 41( 2): 119-214.
[ 4]　 Teng Y W , Tanabe K, Tamura F, et al. Gen etic relationships of
pear cul tivars in Xinjiang, China, as measured by RAPD mark-
ers [ J ]. Journal of Hor ticultural Science and Biotech nology,
2000, 76( 6): 771-779.
[ 5 ]　王丙旭 . RAPD在梨种质资源亲缘关系和品种鉴定中的应
用 [D] .长春:吉林农业大学 , 1998: 1-9.
[6 ]　萨姆布鲁克 J,费里奇 E F,曼尼阿蒂斯 T.分子克隆实验指
南 [M ] .北京:科学出版社 , 1992.
[ 7 ]　范洪源 ,蔡　青 ,宿　兵 ,等 . DN A提纯方法对甘蔗亚族植物
RAPD的影响 [ J ].西南农业学报 , 1998, 12( 1): 1-7.
[ 8 ]　李晓青 .福建柏总 DN A的快速简便提取和鉴定 [ J ].林业科
学 , 1999( 5): 51.
[ 9]　赵　锦 ,刘孟军 ,吕增仁 ,等 . RAPD技术在植物遗传多样性研
究中的应用 [ J ].河北农业大学学报 , 2000, 23( 1): 25-28, 36.
[10 ]　马兵钢 ,牛建新 ,马连营 ,等 .库尔勒香梨基因组 DNA提取及
RAPD体系建立 [ J] .新疆农业科学 , 2001( 1): 2-7.
　
　
148 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 35卷