全 文 ：江苏农业学报(JiangsuJ.ofAgr.Sci.), 2010, 26(6):1352～ 1356
苏家乐 , 刘晓宏 , 刘晓青,等.杜鹃花属植物 SRAP-PCR反应体系的优化及其应用 [J] .江苏农业学报 , 2010, 26(6):1352-1356.
杜鹃花属植物 SRAP-PCR反应体系的优化及其应用
苏家乐 , 　刘晓宏 , 　刘晓青 , 　李　畅
(江苏省农业科学院园艺研究所 ,江苏 南京 210014)
收稿日期:2010-07-13
基金项目:江苏省农业科技支撑项目 (BE2009321);江苏省自主创
新项目 [ CX(09)607]
作者简介:苏家乐(1965-),男,江苏江都人 , 硕士 ,研究员 ,主要从事
杜鹃花栽培及育种研究。 (Tel)025-84390223;(E-mail)
sujl66@yahoo.com.cn
通讯作者:刘晓宏 , (Tel)025-84390223;(E-mail)xiao 513@ 163.com
　　摘要:　采用改良 CTAB法提取杜鹃花属植物基因组 DNA,对影响 SRAP-PCR反应体系中的 Mg2+、dNTPs和引
物浓度进行优化 , 建立了杜鹃花属植物 SRAP分子标记的扩增体系:20 μl的 PCR体系中含有模板 DNA50 ng、10×
PCRbuffer(不含 Mg2 +)、Mg2 + 2.50 mmol/L、dNTPs0.20mmol/L、引物 0.40 μmol/L、TaqDNA聚合酶 1.0U。并对
10种杜鹃花属植物群体进行扩增验证 , 共获得 261条扩增条带 , 251个多态性位点 , 多态性位点比率为 96.17%,结
果表明供试材料间差异明显 、多态性较高 , 该体系适合杜鹃花属植物种间差异性分析 , 为今后杜鹃花属植物分子生
物学的深入研究奠定了基础。
关键词:　杜鹃花属;SRAP;体系优化;聚类分析
中图分类号:　S685.21　　　文献标识码:　A　　　文章编号:　1000-4440(2010)06-1352-05
OptimizationofSRAP-PCR ReactionSystem inRhododendronand
ItsApplication
SUJia-le, 　LIUXiao-hong, 　LIUXiao-qing, 　LIChang
(InstituteofHorticulture, JiangsuAcademyofAgriculturalSciences, Nanjing210014, China)
　　Abstract:　ThegenomicDNAofRhododendronwasextractedbytherevisedCTABmethod.Theconcentrationsof
Mg2 +, dNTPsandprimerswhichafectedtheSRAP-PCRreactionswereoptimized, andtheSRAPmolecularmarkersystem
inRhododendronwasestablished.Theoptimumsystemof20 μlwasasfolows:templateDNA 50 ng, 10×PCRbufer
(withoutMg2 +), Mg2 + 2.50mmol/ L, dNTPs0.20mmol/L, primers0.40 μmol/ L, TaqDNApolymerase1.0 U.
TengenotypesofRhododendronwereamplifiedanddetectedundertheoptimumsystem.SRAPfingerprintingamplifiedby
16 pairsofprimersrevealedthat261 unambiguousbandswereobtained, ofwhich251 siteswerepolymorphic, andthepol-
ymorphismfrequencywas96.17%.Theresultsindicatedthatthesystemwassteadyandreliable, whichwouldbehelpful
tostudymolecularbiologyofRhododendron.
Keywords:　Rhododendron;SRAP;systemoptimization;clusteranalysis
　　杜鹃花属(Rhododendron)是杜鹃花科中最大的
属 ,全世界约 960种 ,中国产 500多种。具有极高的
观赏价值 ,其花美色艳 ,烂漫如锦 ,瑰丽异常 ,是世界
著名的观赏花卉 ,被誉为花中皇后 。中国杜鹃花资
源种类多 ,分布广 ,由于受特殊地理环境影响长期处
于相对封闭的状态 。目前应用于杜鹃花的分子标记
法有 RAPD、RFLP、AFLP、ISSR与 ITS等 ,主要用于
种质资源鉴定与评价 、系统分类 、遗传多样性分析 、
连锁图谱构建等方面[ 1-4] 。
SRAP(序列相关扩增多态性分析)分子标记技
术最早在芸薹属植物中开发应用 ,该标记简便 、快
1352
速 ,不需预知物种的序列信息 ,具有多态性高 、重复
性好 、在基因组中分布均匀 、引物通用性强等优点 。
近年来在植物遗传多样性分析 、种质鉴定 、遗传连锁
图的构建 、基因连锁标记的寻找与基因定位和比较
基因组学研究等方面得到了广泛应用 [ 5-9] 。本研究
拟对杜鹃花 SRAP反应体系中的 Mg2+、dNTPs与引
物浓度等主要因子进行优化分析 ,试图建立适合于
杜鹃花基因组 DNA的 SRAP-PCR反应体系 ,并采用
该体系对 10种杜鹃花材料进行 SRAP-PCR扩增检
验 ,以期为进一步利用该技术开展杜鹃花种质资源
的遗传多样性分析 、材料鉴定 、种子质量控制以及重
要性状分子标记辅助育种等打下技术基础 。
1　材料与方法
1.1　材料
材料为江苏省农业科学院园艺研究所收集的杜
鹃花属植物部分种质资源 ,保存在杜鹃花种质资源
库 ,用于基因组 DNA提取的材料共 10个种(表 1)。
取植株的幼嫩叶片 ,洗净 ,晾干 ,剪去主脉 ,装入密封
袋中 ,置于 -20 ℃冰箱中保存备用。
SRAP-PCR反应的 TaqDNA聚合酶 、dNTPs、
DL2000 DNAMarker均购于 TaKaRa公司;引物委托
上海生工合成。
表 1　供试 10种杜鹃花属植物材料
Table1　TenRhododendronusedforextractionofgenomicDNA
编号 中文名 学名
1 迎红杜鹃 R.mucronulatum
2 牛皮杜鹃 R.aureum
3 大字杜鹃 R.schlippenbachi
4 短果杜鹃 R.brachypodum
5 鹿角杜鹃 R.latoucheae
6 迷人杜鹃 R.agastum
7 羊踯躅 R.mole
8 满山红 R.mariesii
9 映山红 R.simsi
10 大白花杜鹃 R.decorum
1.2　DNA提取
采用改良 CTAB法 [ 10] 提取基因组 DNA, 用
0.8%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA,采用紫外凝胶成
像系统观察并拍照 ,用核酸蛋白仪检测 DNA浓度及
纯度 ,并将其稀释至 50 ng/μl。
1.3　SRAP-PCR体系的优化
扩增反应采用 20 μl的反应体系。分别对影响
SRAP扩增反应体系的 3个主要因素分别设 5个浓
度(表 2),其中模板 DNA50 ng、TaqDNA聚合酶
1.0 U、10 ×PCRbufer(不含 Mg2+)、不足部分用
ddH2O补齐。 PCR扩增程序为 94 ℃预变性 5 min,
反应前 5个循环在 94 ℃ 1 min, 35 ℃ 1 min, 72 ℃ 1
min条件下运行;随后的 30个循环退火温度提高到
50 ℃,最后 72 ℃延伸 10 min, 4 ℃保存 。扩增反应
在德国 Biometra公司 Thermocycler型 PCR扩增仪上
进行 。结果用 1.8%琼脂糖凝胶电泳检测 。
表 2　Mg2 +、dNTPs及引物浓度
Table2　TheconcentrationofMg2+, dNTPsandprimers
因素　　 浓度
Mg2+(mmol/ L) 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00
dNTPs(mmol/ L) 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30
引物 (μmol/ L) 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60
1.4　SRAP引物筛选与种间分子标记鉴定
从实验室现有的 SRAP引物组合中筛选出条带
清晰 、多态性高的引物组合进行多态性分析 ,淘汰扩
增效果差 、带型不易辨认的引物组合。根据 PCR扩
增产物的电泳结果 ,在凝胶的某个相同迁移率位置
上有 DNA条带的记为 1,无 DNA条带的记为 0。
NTSYS-pcVersion2.1统计分析软件 ,根据 Nei-Li遗
传相似系数(GS)按非加权配对算术平均法 UPGMA
(unweightpairgroupmethodusingarithmeticaverage)
进行 SAHN聚类分析 ,再用 TreePlot功能绘出聚
类图 [ 11] 。
2　结 果
2.1　杜鹃花属植物基因组 DNA的提取
通过对杜鹃花属 10个种基因组 DNA的提取 ,
OD值为 1.7 ～ 2.0,样品中蛋白质和酚类物质去除
比较干净 。采用 0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测
DNA,结果(图 1)表明 ,条带清晰 ,没有拖尾现象。
改良的 CTAB法能很好地去除多糖多酚类次生代谢
物 ,适于杜鹃属植物 DNA的提取。
2.2　SRAP-PCR体系的优化
单因素试验结果(图 2)显示:随着 Mg2+浓度的
1353苏家乐等:杜鹃花属植物 SRAP-PCR反应体系的优化及其应用
编号 1～ 10见表 1。
图 1　 10种杜鹃属植物 DNA电泳图谱
Fig.1 　 ElectrophoresisprofileofDNAsfrom 10 genotypes
ofRhododendron
升高条带逐渐清晰 ,达到 2.50 mmol/L时多态性条
带较多 ,故 Mg2+的最佳浓度为 2.50 mmol/L;dNTPs
浓度在 0.20 mmol/L时条带丰富且最为清晰 ,之后
随着浓度的增加亮度反而减弱;引物浓度在 0.40
μmol/L至 0.50 μmol/L之间较合适 ,引物浓度会对
PCR的带型产生明显的影响 , 在确保产量的前提
下 ,采用了较低的引物浓度 0.40 μmol/L。因此 ,杜
鹃花属植物最佳 SRAP反应体系为:20 μl的 PCR
体系中含有模板 DNA50 ng、10×PCRbufer(不含
Mg2+)、Mg2+ 2.50 mmol/L、dNTPs0.20 mmol/L、引
物 0.40 μmol/L、TaqDNA聚合酶 1.0 U。
1～ 5:1.00 mmol/LMg2 +、1.50 mmol/LMg2 +、 2.00 mmol/LMg2 +、2.50 mmol/LMg2 +、 3.00 mmol/LMg2+;6～ 10:0.10 mmol/LdNTPs、 0.15
mmol/LdNTPs、 0.20 mmol/LdNTPs、0.25 mmol/LdNTPs、0.30 mmol/LdNTPs;11～ 15:0.20 μmol/L引物 、 0.30 μmol/L引物 、 0.40 μmol/L引
物 、0.50 μmol/L引物 、0.6 μmol/L引物;M:DL2000 DNAmarker。
图 2　Mg2 +、dNTPs、引物浓度对 SRAP反应的影响
Fig.2　EffectsoftheconcentrationsofMg2 +, dNTPsandprimersonSRAPamplification
2.3　SRAP-PCR优化体系在杜鹃花属植物间的
运用
　　应用优化的 SRAP反应体系 , 从实验室现有
SRAP引物中筛选出 16对扩增条带清晰 、多态性高
的引物组合(表 3),对 10种杜鹃花属植物进行初步
鉴定分析 ,其中用引物组合 me9 /em1扩增电泳图谱
(图 3)。从图 3可以看出 ,所有供试材料扩增带型
清晰 、稳定性好 ,供试材料间差异明显 ,多态性较高 ,
表明优化的 SRAP-PCR体系适合用于杜鹃属植物种
间的差异性分析 。
16对引物组合扩增长度多集中在 250 ～ 2 000
bp。从表 3可以看出 ,共获得 261条扩增条带 , 251
个多态性位点 ,多态性位点比率为 96.17%,平均每
对引物扩增 16.31条带 , 15.69个多态性位点 ,其中
10对引物组合的多态性位点比率为 100%。表明杜
鹃花属植物具有丰富的遗传多样性 , SRAP分子标
记能检测出较多的遗传位点。
M:MarkerDL2000,编号 1～ 10见表 1。
图 3　采用引物组合 me9/em1对 10种杜鹃花属植物 SRAP-
PCR的扩增结果
Fig.3　SRAP-PCRamplificationresultsof10genotypesofRho-
dodendronbytheprimercombinationofme9 / em1
1354 江 苏 农 业 学 报 　2010年 第 26 卷 第 6期
表 3　10种杜鹃花属植物 SRAP扩增结果
Table3　SRAPprimercombinationsusedinanalysisoftengeno-
typesofRhododendronandtheiramplificationresults
序号 引物组合 扩增总条带数
多态性位
点总数
多态性位点
比例(%)
1 me2/em1 20 20 100.00
2 me2/em6 17 17 100.00
3 me2/em9 20 20 100.00
4 me4/em1 14 14 100.00
5 me4/em6 16 14 87.50
6 me5/em9 15 15 100.00
7 me5/em10 11 10 90.91
8 me6/em1 20 20 100.00
9 me6/em10 13 13 100.00
10 me7/em8 20 20 100.00
11 me8/em1 16 14 87.50
12 me9/em1 20 20 100.00
13 me9/em6 17 15 88.24
14 me9/em7 12 10 83.33
15 me9/em9 15 14 93.33
16 me9/em10 15 15 100.00
　　从聚类图(图 4)中可以得出 ,在阈值 0.59处 ,
可以把供试材料分成 4大类:第 1类包括大字杜鹃 、
满山红 、映山红 、羊踯躅;第 2类包括大白花杜鹃 、迷
人杜鹃 、牛皮杜鹃;第 3类包括迎红杜鹃 、鹿角杜鹃;
第 4类为短果杜鹃 。
3　讨 论
植物组织中含有大量的酚类 、多糖 、色素 、单宁
等干扰物质 ,这些物质对 TaqDNA聚合酶的活性有
抑制作用 [ 12] ,在 DNA的提取过程中应有效地控制。
CTAB是一种去污剂 ,可溶解细胞膜 ,它能与核酸形
成复合物 ,该法能很好地去除糖类杂质 ,对于含糖较
高的材料可优先采用 ,改良后效果更佳 。本试验采
用改良 CTAB法能很好地去除多糖 、酚类等次生代
谢物 ,提取的杜鹃花属植物基因组 DNA,经检测 ,样
品的纯度和浓度都较高 ,可作为模板用于 SRAP-
PCR反应。
编号 1～ 10见表 1。
图 4　基于SRAP分析的杜鹃花属植物聚类图
Fig.4　ClusteranalysisofRhododendronbasedonSRAP
　　基于 PCR的 SRAP分子标记技术 , 可以将
RAPD和 AFLP两者的优点有机地结合在一起 ,具有
简便 、稳定 、中等产率的优点 ,高频率共显性也明显
优于 AFLP,且比 AFLP、RAPD、SSR等其他方法更能
反映表型的多样性及进化历史 [ 13-14] 。 SRAP反应体
系中 , Mg2+、dNTPs及引物浓度对 SRAP分子标记的
影响较显著 [ 15-17] 。Mg2+和 dNTPs浓度不仅影响 Taq
酶的活性 ,还在反应液中相互制约 ,且与反应液中的
模板 DNA及引物结合 ,影响引物与模板的结合效
率 、产物的特异性及引物二聚体的形成[ 18] 。引物浓
度会对 PCR的带型产生明显的影响。浓度过低不
能扩增 ,浓度太高会产生新的位点 ,且形成引物二聚
体的机率增大 [ 19] 。为了减少非特异性扩增 ,加强重
复性 ,本研究在确保产量的前提下 ,采用了较低的引
物浓度。
SRAP分子标记技术对 10种杜鹃花属植物材
料的遗传多样性进行分析 ,使植物种质资源研究从
表型深入到基因组 DNA水平上反映种质间的遗传
差异 。 10种杜鹃花属植物内共扩增出 261条多态
性条带 ,多态性比率为 96.17 %。研究结果表明 ,供
1355苏家乐等:杜鹃花属植物 SRAP-PCR反应体系的优化及其应用
试的杜鹃花属植物分化明显 ,在 DNA水平上存在较
高的遗传多样性 ,与传统的形态学 [ 20-23]分类结果基
本一致 。
本试验采用改良 CTAB法提取杜鹃花属植物基
因组 DNA,并对 SRAP扩增反应中 Mg2+、dNTPs及
引物浓度 3个主要影响因子进行了体系优化 ,较快
地建立了杜鹃花 SRAP反应体系。验证试验表明 ,
供试材料间差异明显 ,多态性较高 ,该体系适合杜鹃
花属植物 SRAP-PCR反应 。欲将其应用于杜鹃花属
植物种间亲缘关系和物种鉴别 、遗传多样性和分子
标记辅助育种等研究 ,还有待今后收集更多的杜鹃
花属植物资源作进一步的研究 。
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