全 文 ：第 24卷 哈尔滨师范大学自然科学学报 Vol.24, No.6 2008
第 6期 NATURALSCIENCESJOURNALOFHARBINNORMALUNIVERSITY
黄杨属几种植物的过氧化物酶和酯酶同工酶研究＊
王玲玲　　徐　娜　　李俊雁　　关　旸＊＊
(哈尔滨师范大学)
【摘要】　采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术 ,对黄杨属的小叶黄杨 、锦熟黄
杨 、朝鲜黄杨的过氧化物酶和酯酶同工酶酶谱进行分析 ,结果表明小叶黄杨和锦熟黄
杨具有相同的 Rf值 ,亲缘关系非常近 ,而二者和朝鲜黄杨之间的遗传差异较明显.
关键词:黄杨;过氧化物酶同工酶;酯酶同工酶
收稿日期:2008-08-21
＊黑龙江省教育厅科学技术研究资助项目(10541083, 10551104)
＊＊通讯作者:E– mail:gyuang0611@ 163.com
0　引言
同工酶是指能催化同一种化学反应 ,但其酶
蛋白本身的分子结构组成有所不同的一组酶 ,这
类酶存在于生物的同一属 、种或同一个体的不同
组织 、细胞中 ,随着蛋白质分离技术的发展 ,特别
是凝胶电泳的应用 ,使同工酶可以从细胞提取物
中分离出来 ,因而 ,可以通过对它们的分析 ,以其
多态性作为遗传标记 , 研究种质资源的亲缘关
系 [ 1] 、重要性状的同工酶表现 [ 2, 3]等.
过氧化物酶和酯酶是同工酶技术中研究最多
的酶类 ,普遍存在于各种植物组织中 ,易于提取和
分离 ,而且具有较好的稳定性 ,因而广泛应用于各
类植物种质资源的分类[ 4] ,系统发育 [ 5] , 亲缘关
系研究 [ 6] ,植物杂交种的分析鉴定 [ 7, 8]等方面.
黄杨属(Buxus):黄杨科中最大一属 ,约占三
分之二 ,根据中国植物志记载 ,本属约有 70种 ,分
布于亚洲 ,热带非洲至非洲南部 ,马达加斯加 ,美
洲中部和中欧.亚洲 29种.中国约有 21种 ,其中
大多数种类分布在长江以南地区 ,仅 2 ～ 3种产于
河南与陕西.本属植物材质坚腻 ,致密美观 ,适于
做雕刻 ,美工和其他工艺品.有些种类含生物碱可
药用.常见栽培为观赏植物 ,而且多数具有很强的
抗寒性 ,是园林绿化的良好树种.
锦熟黄杨(Buxussempervirens):灌木 ,高约
1 ～ 1.5 cm,宽 1 ～ 1.2 cm,顶端圆形 ,偶有微凹 ,
基部楔形 ,中脉突起 ,叶背苍白色 ,中脉扁平 ,初时
背细毛 ,侧脉两面不明显.
小叶黄杨 (Buxussinica.var.parvifoliaM.
Cheng):叶薄革质 ,叶小 ,长 0.7 ～ 1 cm,宽 0.5 ～
0.7cm,小枝节间长 0.2 ～ 0.4 cm,先端圆形 ,稍
有小凹口 ,侧脉明显 ,无毛 ,背面平滑.
朝鲜黄杨(Buxusmicrophylakoreana):常绿
灌木 ,高 1 ～ 2 m,叶革质 ,叶长 0.8 ～ 1.4 cm,宽
0.4 ～ 0.8cm,边缘略反卷 ,表面侧脉不甚明显 ,花
序腋生 ,花浅黄色.
黄杨属内分类较为混杂 ,不同植物志中记载
各有所不同 ,小叶黄杨与锦熟黄杨形态相似 ,在实
际工作中较难区分 ,给科研工作和实际栽培带来
一定的困扰 ,而且关于黄杨属植物的同工酶电泳
研究较少[ 9, 10] ,仅限于珍珠黄杨 ,雌花黄杨的同工
酶研究.本文对黄杨属中小叶黄杨 ,锦熟黄杨 ,朝
鲜黄杨的过氧化物同工酶和酯酶同工酶进行研
究 ,从分子水平论证了几种黄杨间的亲缘关系 ,以
期为该属植物的分类研究和遗传分析提供一定的
参考依据.
1　材料与方法
1.1　材料
实验材料取自哈尔滨师范大学江北校区栽培
的黄杨属三种植物 ,包括小叶黄杨(Buxussinica.
var.parvifoliaM.Cheng),锦熟黄杨(Buxussemper-
virens),朝鲜黄杨(Buxusmicrophylakoreana).
1.2　仪器设备
DYY-Ⅲ -6B型稳流稳压电泳仪(北京六一
仪器厂)、DYY-Ⅲ型垂直板电泳槽(北京六一仪
器厂)、低温离心机 , 30μL微量进样器.
1.3　方法
1.3.1　酶液制备
称取新鲜叶片 0.2 g左右 ,置于预冷的研钵
中 ,加入样品提取液(磷酸缓冲液 , pH =7.8)
1mL,研成匀浆 , 12000×g离心 15min,取其上清
液 ,并加入等体积的 10%甘油混匀 ,贮于冰箱中 0
～ 4℃备用.
1.3.2　同工酶测定
采用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳法.分离胶
浓度为 7.5% (pH =8.9),过硫酸胺化学聚
合;浓缩胶浓度为 4% (pH =6.7),电极缓冲液
为 Tris-甘氨酸系统(pH=8.3), 0.2%的溴
酚蓝做为指示剂 ,采用 DYY型稳压稳流电泳仪在
冰箱中 4 ℃下进行电泳 6h左右 ,重复 3次.
1.3.3　酶谱定位
过氧化物同工酶染色采用联苯胺染色系统 ,
取醋酸联苯胺溶液与氯化铵 、EDTA、3%H2O2和
蒸馏水按 1∶1∶1∶1∶9配制染色液 ,电泳毕后取下凝
胶板 ,经重蒸馏水漂洗 ,放入上述染液中染色 10
～ 15 min,酶谱呈现蓝色 -棕色后将染色液倾
出 ,自来水冲洗.
酯酶同工酶染色采用醋酸 -α-萘酯 , β -醋
酸萘酯和坚牢蓝染色系统:200 mgα-醋酸萘酯 ,
200mgβ -醋酸萘酯 , 200 mg坚牢蓝 RR盐 ,先分
别用 2mL丙酮溶液 [ V(丙酮)/V(水)=1∶1]溶
解 ,再用 0.1 mol/LpH=6.4的磷酸缓冲液 200
mL稀释.电泳结束后 ,取出凝胶 ,放入染色液中 ,
在 25℃保温 1 h,当出现红色区带时 ,取出凝胶 ,
用 7%醋酸溶液浸泡 ,使背景清晰即可照相.
1.3.4　数据计算
谱带迁移率 Rf=(谱带迁移距离)/ (溴酚
兰迁移距离)×100 %
2　结果与分析
2.1　过氧化物酶同工酶
如图 1所示 ,三种黄杨的过氧化物酶同工酶
酶谱具有一定的差异性.其中小叶黄杨和锦熟黄
杨均有 3条谱带 ,谱带迁移率 Rf值分别为 0.05、
0.09、0.54,其中 Rf值为 0.05的酶带表达较强 ,
其余两条带表达较弱 ,而且两者的酶带表达位点
和酶带宽均没有明显的差异 ,仅在活性上有略微
的差异 ,表明二者具有很近的亲缘关系;朝鲜黄杨
有 2条酶带 , Rf值分别为 0.24、0.38,其中一条酶
带较宽但较分散 ,另一条表达量很大 ,活性很强 ,
朝鲜黄杨与小叶黄杨 ,锦熟黄杨之间没有相同迁
移率的酶带 ,表明从过氧化物同工酶角度看 ,朝鲜
黄杨与同属的小叶和锦熟黄杨亲缘关系相对较
远.
A.小叶黄杨　B.锦熟黄杨　C.朝鲜黄杨
图 1　三种黄杨过氧化物酶模式图
2.2　酯酶同工酶
酯酶的表达位点相对于过氧化物酶不太敏
感.如图 2所示 ,小叶黄杨和锦熟黄杨各有一条表
达量很大的酶带 ,活性很强 , Rf值为 0.10,而且表
达位点相同 ,再次表明小叶和锦熟黄杨亲缘关系
很近;朝鲜黄杨有 3条酶带 ,朝鲜黄杨的酯酶谱带
较清楚 ,谱带迁移率 Rf值分别为 0.51、0.52、0.
54,但与前两者具有明显的遗传差异性 ,没有相同
迁移率的酶带 ,而且表达位点也相距较远 ,表明朝
鲜黄杨与小叶黄杨和锦熟黄杨亲缘关系较远 ,这
与过氧化物同工酶的结果是一致的.
A.小叶黄杨　B.锦熟黄杨　C.朝鲜黄杨
图 2　三种黄杨酯酶同工酶模式图
75第 6期　　　　　　　　　　　　　　黄杨属几种植物的过氧化物酶和酯酶同工酶研究
3　讨论
近年来 ,随着分子生物学的飞速发展 ,同工酶
分析技术已逐渐成为分子水平上研究生命现象的
一种重要手段[ 11] ,越来越广泛地应用于生物学的
各个领域 ,包括动物 [ 12-13] 、植物 [ 14] 、遗传[ 15-17] 、
生化[ 18]各个方向 ,在植物学中的应用更加深入广
泛 ,同工酶分析是植物系统分类研究的重要工具 ,
在种内和种间亲缘关系研究中起着重要的作
用 [ 19] .
笔者利用同工酶分析技术对三种黄杨的亲缘
关系进行了探讨 ,从三种黄杨的过氧化物酶同工
酶和酯酶同工酶酶谱分析 ,小叶黄杨 、锦熟黄杨与
朝鲜黄杨没有相同 Rf值的特征带 ,表明二者与朝
鲜黄杨亲缘关系相对较远.而小叶黄杨和锦熟黄
杨之间无论从过氧化物酶同工酶还是酯酶同工酶
上看均没有表现出明显的差异 ,它们具有相同迁
移率的酶带 ,并且酶带的表达量也基本一致 ,说明
两者具有非常近的亲缘关系.
参　考　文　献
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ASTUDYONTHEESTERASEANDPEROXIDASE
ISOZYMESOFSEVERALSPECIESINBUXUS
WangLingling　XuNa　LiJunyan　GuangYang
(HarbinNormalUniversity)
ABSTRACT
TheesteraseandperoxidaseisozymesonBuxussinica.var.parvifoliaM.Cheng, Buxussempervirens,
BuxusmicrophylakoreanaofBuxuswereanalysedbyusingverticalslabpolyacrylamidegelelectrophoresis.
TheresultsshowthattherelationsofBuxussinica.var.parvifoliaM.ChengandBuxussempervirensareclose
toeachotherwithsameRf, thegeneticdiferencesbetweenBuxusmicrophylakoreanaandBuxussinica.var.
parvifoliaM.Cheng, Buxussempervirensareobvious.
Keywords:Buxus;Peroxidaseisozyme(POD);Esteraseisozyme(EST) (责任编辑:柳湘云)
76 哈尔滨师范大学自然科学学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年