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草莓属植物SCoT分析体系的建立及优化



全 文 :果 树 学 报 2012,29(3): 393~397
Journal of Fruit Science
草莓属植物 SCoT分析体系的建立及优化
秦国新 1,2,何 桥 1,梁国鲁 1*,雷家军 3*,郭启高 1
(1西南大学园艺园林学院,重庆北碚 400715; 2山西农业大学园艺学院,山西太谷 030801;
3沈阳农业大学园艺学院,沈阳 110161)
摘 要:为利用 SCoT 技术开展草莓属(Fragaria)植物种质资源遗传多样性及分子系统学研究,以草莓属植物 11 个野
生种和 1 个栽培品种为试材,采用 L25(56)正交试验设计,建立了草莓属植物的最优 SCoT-PCR 反应体系,即 20 μL
反应体系中,含 Mg2+ 2.0 mmol·L-1、dNTPs 0.3 mmol·L-1、Taq 酶 0.75 U、引物 0.75 μmol·L-1、模板 DNA 40 ng,并对退火
温度进行了优化, 对电泳检测方法及草莓属植物 DNA 提取方法进行了改进。 共筛选出 22 个适于进行草莓属植物
SCoT 分析的引物。 经验证,该反应体系稳定性好、可重复性强、多态性高、扩增效果好,适于草莓属植物的 SCoT 分
析。
关键词:草莓属; SCoT; 体系优化
中图分类号:S668.4 文献标志码:A 文章编号:1009-9980(2012)03-0393-05
Establishment and optimization of SCoT-PCR system in Fragaria
QIN Guo-xin1,2,HE Qiao1,LIANG Guo-lu1*,LEI Jia-jun3*, GUO Qi-gao1
(1College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Bebei,Chongqing 400716 China; 2College of Horticulture,
Shanxi Agricultural University, Taigu,Shanxi 030801 China; 3College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang,Liaon-
ing 110161 China)
Abstract: Start Codon Targeted Polymorphism (SCoT) is a novel gene-targeted molecular marker tech-
nique. In this experiment, a L25 (56) or thogonal design was used for the optimal SCoT-PCR reaction sys-
tem of strawberry with 11 Fragaria species and a cultivar as materials. The optimal PCR reaction mixture of
SCoT-PCR system for strawberry was 2.0 mmol·L-1 Mg2+,0.3 mmol·L-1 dNTPs,0.75 U Taq polymerase,
0.75 μmol·L-1 primer and 40 ng template DNA in 20 μL mixtures. Furthermore, the annealing tempera-
ture of each primer was optimized; the methods of electrophoresis and strawberry DNA extracting were im-
proved. 22 primers were selected which were suitable to the SCoT-PCR reactions. The optimal reaction
system with high polymorphism,stability and repeatability was obtained.
Key words: Fragaria; SCoT; System optimization
世界草莓属植物(Fragaria)约有 20 个常见种,
主要分布于欧洲、美洲和亚洲。 我国自然分布有 11
个种,包括 7个二倍体种和 4个四倍体种,是世界上
野生草莓种类最丰富的国家。草莓属植物倍性多样,
有二倍体、四倍体、六倍体、八倍体等,并存在较多的
种、变种和类型,近年来多国学者又发现了草莓自然
五倍体的存在[1];加之草莓属植物容易产生未减数配
子(2n)和未减数加倍配子(4n)[2],种间易发生基因渗
入(introgression),造成草莓属植物进化的复杂性,各
国学者对该属植物的进化及分类存在较大分歧[3]。与
早期的形态标记、生化标记和细胞学标记相比,分子
标记的优越性已经得到各国生物学者的广泛认同,
并趋向于 2者的协同应用。 但草莓属植物的分子生
物学研究起步晚, 相关研究明显落后于其他果树作
物,分子标记技术的应用也主要以 RAPD、AFLP、IS-
SR、SCAR、CAPS等为主[4-5]。 目标起始密码子多态性
标记 (Start codon targeted polymorphism,SCoT)是
Collard 和 Mackill 在水稻上开发的一种新的目的基
因分子标记 [6],具有操作简单、引物通用性强、成本
低、多态性高、遗传信息丰富等优点[7],并已被成功应
用于龙眼 [8-9]、枇杷 [10]、柑橘 [11]、葡萄 [12]等果树作物,但
尚未见有关草莓属植物研究应用的报道。 我们旨在
收稿日期: 2011-12-23 接受日期: 2012-03-30
基金项目: 国家自然科学基金(30971976)
作者简介: 秦国新,男,副教授,在职博士生。 研究方向:果树遗传育种与生物技术。 Tel: 023-68250383, E-mail: qgx1971@yahoo.cn
觹 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: lianggl@swu.edu.cn; jiajunlei@yahoo.com.cn
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2012.03.009
果 树 学 报 29 卷
较全面地建立并优化草莓属植物的 SCoT 反应体
系, 为应用 SCoT 分子标记技术进一步研究草莓属
植物种质资源的起源、进化及遗传多样性奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料及试剂
以草莓属植物森林草莓(F. vesca)、东北草莓(F.
mandschurica)、五叶草莓(F. pentaphylla)、绿色草莓
(F. viridis)、黄毛草莓(F. nilgerrensis)、东方草莓(F.
orientalis)、西南草莓(F. moupinensis)、伞房草莓(F.
corymbosa)、麝香草莓 (F. moschata)、智利草莓 (F.
chiloensis)、弗州草莓(F. virginiana)等 11 个野生种
及草莓栽培品种“全明星”( F. × ananassa ‘Allstar’)为
试材, 其中五叶草莓用于 SCoT-PCR 反应体系的优
化及退火温度的确定, 五叶草莓和全明星用于引物
筛选。 所有材料均露地栽植于沈阳农业大学园艺学
院草莓资源圃, 于旺盛生长期采集嫩叶, 置于冰盒
中,迅速带回实验室,清洗后吸干水分,置-80℃超低
温冰箱中备用。
SCoT 引物序列来自于 Collard 等[6],由上海生工
生物工程有限公司合成 。 DL2000 Marker、dNTPs、
Taq DNA 聚合酶、10×Buffer 等均购自宝生物工程
(大连)有限公司。
去糖缓冲液配方为每 500 mL中,含 Tris 6.057 g,
葡萄糖 34.678 8 g,1 mol·L-1 HCL 50 mL,Na2-EDTA
0.930 6 g,PVP 10 g, 巯基乙醇 20 mL, 以 ddH2O 补
足,pH值调至 8.0。
1.2 基因组 DNA提取
草莓属植物基因组 DNA 提取采用改良 CTAB
法,具体步骤为:称取嫩叶材料 1 g,用不锈钢剪刀剪
碎置研钵中, 加入适量石英砂及 5 mL去糖缓冲液,
充分研磨,转入 10 mL离心管中。 静置 10 min,常温
下 6 000 r·min-1离心 15 min,弃上清。再次加入 5 mL
去糖缓冲液,充分震荡摇匀,静置 10 min,常温下
6 000 r·min-1离心 15 min,弃上清。 后续步骤同韩国
辉等[10]的方法。
所得 DNA用 Thermo NANO DROOP 2000 Spec-
trophotometer 测定仪和 0.8%琼脂糖凝胶电泳法检测
其质量及完整性。 根据检测结果,将 DNA 浓度稀释
至 20 mg·L-1后,-20℃保存备用。
1.3 SCoT-PCR扩增程序
PCR 扩增反应在 Eppendorf Gradient PCR 扩增
仪上进行。 初始扩增程序参考 Collard 等[6]和韩国辉
等 [10]的方法,具体为 94 ℃预变性 3 min;94 ℃变性 1
min,50 ℃退火 1 min,72 ℃延伸 2 min, 循环 35 次;
最后 72℃延伸 10 min,扩增产物于 4℃下保存。
扩增反应结束后, 加入 1 μL 6×Loading buffer,
采用干板点样法,取 20 μL左右扩增产物在 2.0%琼
脂糖凝胶中电泳,用 BIO-RAD Molecular Imager Gel
DocTM XR+成像系统照相。
1.4 SCoT-PCR体系的正交设计
选用 L25(56)正交试验设计(表 1),采用 20 μL
反应体系, 各因素水平分别为 Mg2+ 1.25、1.5、1.75、
2.0、2.25 mmol·L -1;dNTPs 0.15、0.2、0.25、0.3、0.35
mmol·L -1;Taq 酶 0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 U; 引物
0.25、0.375、0.5、0.625、0.75 μmol·L-1;模板 DNA 20、
30、40、50、60 ng,10×Buffer用量均为 2 μL,以 ddH2O
补足。 共进行 3次,分别以 S1、S7、S14为扩增引物。
对扩增结果进行人工评分后,利用正交设计助手 3.1
软件进行直观分析和方差分析。
1.5 引物筛选和退火温度的确定
根据正交试验结果, 选择最佳反应体系进行引
物筛选及退火温度的确定试验。
2 结果与分析
2.1 正交设计试验结果
从正交试验扩增电泳图(图 1)中可以看出,扩
增效果以组合 15、18、19最好。 根据扩增条带数、清
晰度、亮度及分散性进行评分,最好的计为 25 分,最
差的计为 1分, 对实验结果进行直观分析和统计分
析(表 1)。根据直观分析结果,各因素极差 ki大小依
次为 Mg2+>dNTPs>模板 DNA>Taq 酶>引物, 表明各
因素对反应体系的影响程度大小亦以此排序。 根据
直观分析中各因素不同水平的均值大小, 各因素单
一最佳水平分别为 Mg2+ 1.75 mmol·L-1、dNTPs 0.2
mmol·L-1、Taq 酶 0.75 U、 引物 0.5 μmol·L-1、 模板
DNA 20 ng。 但相应组合在正交设计表中并未出现。
方差分析结果表明,各因素间及各因素内不同水平
间差异均未达显著水平,说明可以根据扩增产物电
泳的肉眼观察结果进行最佳组合的确定。 由此,确
定最佳组合为 19, 即草莓属植物 SCoT-PCR 的最
佳反应体系为总体积 20 μL 中含 Mg2+ 2.0 mmol·L-1、
dNTPs 0.3mmol·L-1、Taq酶 0.75 U、引物 0.75μmol·L-1、
模板 DNA 40 ng。
2.2 引物筛选
根据正交试验结果确定的草莓属植物 SCoT-
PCR 最佳反应体系,以五叶草莓和草莓品种全明星
的基因组 DNA 为模板,对 Collard 和 Mackill 开发的
394
3 期 秦国新等: 草莓属植物 SCoT 分析体系的建立及优化
表 1 SCoT-PCR 反应体系 L25(56)正交设计及直观分析表
Table 1 L25(56) orthogonal design for SCoT-PCR and intuitive analysis
36 个引物进行筛选。 选择出条带清晰、种间差异明
显、 多态性好的 22 个引物用于后续草莓属植物的
SCoT分析(表 2)。 部分引物扩增效果见图 2。
2.3 最适退火温度的筛选
对每一筛选出的引物进行最适退火温度的确
定。根据(50±5)℃的温度设定范围,PCR仪自动生成
12个温度梯度,分别为 45℃、45.1℃、45.7℃、46.6℃、
47.7℃、49℃、50.4℃、51.8 ℃、53 ℃、54.1 ℃、55 ℃和
55.4℃。 根据电泳检测结果,选择扩增条带数量多、
条带清晰的作为最适退火温度, 扩增效果相同的情
况下选择温度高的作为最适退火温度,以确保 PCR
产物的特异性 (图 3)。 各引物最适退火温度如表 2
所示。
2.4 草莓属植物 SCoT-PCR反应体系的验证
采用多个引物及其最适退火温度,对优化的草
莓属植物 SCoT-PCR 反应体系进行多次验证,结果
如图 4 所示,所有的材料均能扩增出清晰的条带,
且分散良好,多态性好,重复性高,反应体系稳定,
说明该反应体系非常适合草莓属植物的 SCoT 分
析。
序号
No.
Mg2+
/(mmol·L-1)
dNTPs
/(mmol·L-1)
Taq
/U
引物 Primer
/(μmol·L-1)
DNA
/ng
评分
Score
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
K1
K2
K3
K4
K5
ki
1.25
1.25
1.25
1.25
1.25
1.50
1.50
1.50
1.50
1.50
1.75
1.75
1.75
1.75
1.75
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.25
2.25
2.25
2.25
2.25
10.6
13.6
20.6
19.6
19.2
10.0
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
19.2
19.6
18.6
14.2
12.0
7.6
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
0.75
1.00
1.25
1.50
0.50
1.00
1.25
1.50
0.50
0.75
1.25
1.50
0.50
0.75
1.00
1.50
0.50
0.75
1.00
1.25
17.8
19.6
17.4
15.8
13.0
6.6
0.25
0.375
0.50
0.625
0.75
0.50
0.625
0.75
0.25
0.375
0.75
0.25
0.375
0.50
0.625
0.375
0.50
0.625
0.75
0.25
0.625
0.75
0.25
0.375
0.50
12.4
16.0
18.6
18.4
18.2
6.2
20
30
40
50
60
50
60
20
30
40
30
40
50
60
20
60
20
30
40
50
40
50
60
20
30
20.6
18.0
16.0
13.4
15.6
7.2
18
19
14
1
1
16
22
22
4
4
22
16
19
22
24
19
20
24
25
10
21
21
14
19
21
图 1 SCoT-PCR 正交试验扩增产物电泳
M. DL2000 marker;1~25.处理编号,同表 1
Fig. 1 Electrophoresis of orthogonal design PCR products
M. DL2000 marker;1 to 25. Code is the same as Table 1
395
果 树 学 报 29 卷
图 3 引物 S25、S26 退火温度的优化
Fig. 3 Annealing temperature selection of primer
S25 and S26
M. DL2000 marker
图 4 引物 S28 的扩增结果
M. DL2000 marker; CK. 空白对照; 1. 森林草莓; 2. 东北草莓; 3.
五叶草莓; 4. 绿色草莓; 5. 黄毛草莓; 6. 东方草莓; 7. 西南草莓; 8.
伞房草莓; 9. 麝香草莓; 10. 智利草莓; 11. 弗州草莓; 12. 全明星
Fig. 4 Amplification results of primer S28
M. DL2000 marker; CK. Control; 1. F. vesca; 2. F. mandschurica; 3. F.
pentaphylla; 4. F. viridis; 5. F. nilgerrensis; 6. F. orientalis; 7. F.
moupinensis; 8. F. corymbosa; 9. F. moschata; 10. F. chiloensis; 11. F.
virginiana; 12. F.× ananassa ‘Allstar’
图 2 部分 SCoT 引物筛选结果
M. DL2000 marker; S13-S24. SCoT 引物
Fig. 2 SCoT primers selecting in Fragaria
M. DL2000 marker; S13 to S24. SCoT primers
表 2 草莓属植物 SCoT 引物筛选及最适退火温度
Table 2 Selected SCoT primers in Fragaria and their
annealing temperatures
3 讨 论
应用分子标记技术对某种材料进行遗传学研究
前,对特定的反应体系进行优化是一项基础性工作。
SCoT 标记作为一种新型的目的基因分子标记,虽然
在多种植物上证明具有操作简单、重复性好、引物通
用性强的优点, 但对于不同材料所适用的反应体系
仍有很大不同。 韩国辉等[10-11]对枇杷、柑橘及张君玉
等 [12]对葡萄的研究中,均认为 dNTPs 是影响 SCoT-
PCR反应体系的最主要因素。 本研究利用正交设计
方法,对草莓属植物 SCoT-PCR 反应体系中的 Mg2+、
dNTPs、Taq 酶、引物及模板 DNA 等主要因素的影响
进行了研究, 发现各因素对反应体系的影响程度大
小为 Mg2+>dNTPs>模板 DNA>Taq 酶>引物, 且各因
素间及各因素内不同水平间差异均未达显著水平,
说明不同的试验材料有较为明显的差异,在将 SCoT
应用于新的材料时必须对相应的扩增体系进行优
化。
关于 Collard等[6]最初在水稻上开发的 36个 SCoT
引物的通用性,陈虎等 [8-9]、韩国辉等 [10-11]已对龙眼、
枇杷和柑橘的 SCoT 引物筛选进行明确分析; 张君
玉等[12]从中筛选出 23 个引物,证明其适用于葡萄的
SCoT分析。本研究利用遗传差异较大的 2份草莓基
因组 DNA 为模板, 共从中筛选出 22个适于进行草
莓属植物 SCoT 分析的引物, 其他引物则在草莓属
植物上扩增效果差,不能用于相关研究。 SCoT 引物
是根据 ATG 翻译起始位点侧翼区域的保守性来设
计的,引物设计相对简单。 在后续的研究工作中,可
根据特定的原则及草莓属植物基因组的特点, 自行
设计适用于草莓属植物的 SCoT 引物, 以弥补引物
数量的相对不足,并增强引物的特异性。
几乎所有关于 SCoT-PCR 的研究中, 扩增时对
所有引物均采用单一退火温度[6-12]。本研究对筛选出
的引物逐一进行了退火温度的优化, 发现不同的引
物最适退火温度不同, 范围从 49.0 ℃到 55.0 ℃,多
数略高于 Collard 等[6]采用的 50℃。研究认为,在进行
不同材料的 SCoT 分析时, 为提高扩增产物的特异
性,应该对所用引物的退火温度进行进一步筛选。
参考已有研究报道 [6-12],试验中采用了 1.0%、
1.2%、1.5%、1.8%及 2.0%等多个琼脂糖凝胶浓度对
扩增产物进行检测,发现胶浓度越高,扩增条带越清
晰,分散效果越好,以采用 2.0%琼脂糖凝胶为最佳。
这可能是由于草莓属植物的 SCoT-PCR 扩增产物片
段较大, 近半数条带介于 750 bp 和 2 000 bp 之间,
引物
Primers
序列(5′-3′)
Sequences (5′-3′)
退火温度
Annealing temperatures/℃
S1
S2
S3
S4
S5
S7
S11
S12
S14
S15
S17
S18
S21
S25
S26
S27
S28
S32
S33
S34
S35
S36
CAACAATGGCTACCACCA
CAACAATGGCTACCACCC
CAACAATGGCTACCACCG
CAACAATGGCTACCACCT
CAACAATGGCTACCACGA
CAACAATGGCTACCACGG
AAGCAATGGCTACCACCA
ACGACATGGCGACCAACG
ACGACATGGCGACCACGC
ACGACATGGCGACCGCGA
ACCATGGCTACCACCGAG
ACCATGGCTACCACCGCC
ACGACATGGCGACCCACA
ACCATGGCTACCACCGGG
ACCATGGCTACCACCGTC
ACCATGGCTACCACCGTG
CCATGGCTACCACCGCCA
CCATGGCTACCACCGCAC
CCATGGCTACCACCGCAG
ACCATGGCTACCACCGCA
CATGGCTACCACCGGCCC
GCAACAATGGCTACCACC
49.0
49.0
50.4
50.4
50.4
45.7
49.0
53.0
54.1
50.4
50.4
50.4
50.4
55.0
49.0
47.7
50.4
50.4
50.4
50.4
50.4
50.4
396
3 期 秦国新等: 草莓属植物 SCoT 分析体系的建立及优化
但也提示对其他植物材料进行 SCoT 分析研究时,
应该采用适当偏高浓度的琼脂糖凝胶电泳对 PCR
产物进行检测。电泳检测时,常规的点样方法一般是
吸取 10 μL扩增产物在电泳槽中进行点样。 作者采
用了干板点样法, 即在制胶时选择合适的凝胶厚度
及点样孔大小,吸取所有的 20 μL 扩增产物,先行点
样,再将凝胶小心放入电泳槽中进行电泳。与常规方
法相比,该方法点样速度快,操作简单,轻松,样品不
易在电泳液中上漂,且扩增条带亮度明显提高,应用
效果较好。
同时,试验还改进了草莓属植物基因组 DNA 的
提取方法。草莓属植物叶片中多糖含量高,而酚类物
质含量较低,因此,试验中减少了 PVP 的用量,增加
了去糖缓冲液处理的程序。 为操作方便、提高效果,
采用常温下常规研磨的方法,不再使用液氮。结果表
明,采用这一方法提取的草莓属植物 DNA,杂质去
除完全,纯度高,基本无降解现象,改进效果明显,可
为其他同类植物材料少量提取基因组 DNA 时提供
借鉴。
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