全 文 ：收稿日期:2015-08 － 26; 修订日期:2015-12-20
基金项目:国家自然科学基金(No． 31270398;No． 31540006);
辽宁省“百千万人才工程”人选项目择优资助项目
(No． 2013921008)
作者简介:于大永 (1976-)，男(汉族)，吉林德惠人，大连大学副教授，博
士学位，主要从天然活性物质的研究工作．
* 通讯作者简介:冯宝民 (1975-)，男(汉族)，吉林集安人，大连大学教
授，博士学位，主要从事天然产物活性物质的研究工作．
草胡椒属植物对人黑色素瘤 A375 细胞增殖的影响
于大永，杨秀秀，卢 轩，史丽颖，冯宝民*
(大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622)
摘要:目的 考察三种草胡椒属植物豆瓣绿、石蝉草和草胡椒乙醇提取物及不同极性部位对人黑色素瘤(A375)细胞增殖
抑制作用。方法 常规传代培养 A375 细胞，实验处理前后，采用噻唑蓝(MTT)法测定细胞活性。结果 豆瓣绿、石蝉草和
草胡椒的乙醇提取物对 A375 细胞增殖均有抑制作用，且细胞存活率随样品质量浓度的加大而降低。其中乙酸乙酯极性
部位抑制效果更加明显，水层在高浓度下有一定的抑制作用。结论 该属三种植物石蝉草、豆瓣绿和草胡椒均有抗肿瘤
作用。
关键词:草胡椒属; 人黑色素瘤 A375 细胞; 细胞增殖; 豆瓣绿
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2016． 05． 009
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2016)05-1048-02
Effect of Peperomia Ｒuizet Pav on Cell Proliferation of Human Malignant Melanoma
A375 Cell
YU Da-yong，Yang Xiu-xiu，Lu Xuan，SHI Li-ying，FENG Bao-min*
(School of Life Sciences and Biotechnology，Dalian University，Dalian 116622，China)
Abstract:Objective Compare the inhibition effect on human melanoma cells(A375)treated with the ethanolic extracts and dif-
ferent polar parts obtained from three different Peperomia Ｒuizet Pav species． Methods Human melanoma A375 cells were grown
in DMEM medium，MTT assay was used to examine the growth rates inhibition on human melanoma cells． Ｒesults The ethanolic
extracts of three different Peperomia Ｒuizet Pav species has inhibitory effects on A375 cell proliferation，and the survival rate re-
duced with the increase of sample mass concentration． The effect of the ethyl acetate polar parts is more apparent，water layer
does little effect． Conclusion The three species of Peperomia Ｒuizet Pav all have antitumor effect．
Key words:Peperomia Ｒuizet Pav; Human malignant melanoma cell A375; Cell proliferation; Peperomia tetraphylla
(Forst． f．)Hook． et Arn
草胡椒属 Peperomia Ｒuizet Pav． 是胡椒科(Piperaceae)第二
大属，约 1000 种，主要分布在热带和亚热带地区。该属植物为一
年或多年生、肉质草本植物。我国有 9 种，分布于东南至西南
部［1］，分别为硬毛草胡椒 Peperomia cavaleriei C． DC．、石蝉草
Peperomia dindygulensis Miq．、短穗草胡椒 Peperomia duclouxii C．
DC．、蒙自草胡椒 Peperomia heyneana Miq．、柬埔寨草胡椒 Pepero-
mia leptostachya、山草椒 Peperomia nakaharai Hayata、草胡椒 Peper-
omia pellucida (L．)Kunth、红脉草胡椒 Peperomia rubrivenosa C．
DC．、豆瓣绿 Peperomia tetraphylla (Forst． f．)Hook． et Arn．。中
医认为草胡椒属植物性凉、味辛;具有清热解毒、散瘀止痛的功
效;主治痈肿疮毒、跌打损伤、外伤出血、烧烫伤等症;适用于内服
煎汁和外敷［2］。《新华本草纲要》亦记载:草胡椒属植物全草有
散瘀止痛的功能，用于跌打损伤、烧伤等［3］。近年来，有报道发
现草胡椒属植物的化学成分具有抗炎［4 ～ 6］、抗肿瘤活性［7，8］、抗
肿瘤血管生成［9，10］等作用。但未发现有报道草胡椒属植物对黑
色素瘤细胞增殖抑制作用的研究。本文以草胡椒属的三种植物
石蝉草、豆瓣绿和草胡椒的 95%乙醇提取物及各不同部位为对
象研究其对黑色素瘤 A375 细胞增殖的影响。
1 材料和方法
1． 1 植物提取及药品配制 草胡椒植物样品采集于云南普洱
市，石蝉草采集于贵州安顺。豆瓣绿样购自江苏省花卉市场。三
种植物分别用 95%乙醇超声提取 3 次［7］，30min /次，合并提取液
并浓缩，减压浓缩得到石蝉草 95%乙醇提取物、豆瓣绿 95%乙醇
提取物和草胡椒 95%乙醇提取物浸膏，浸膏挥至无醇味后以热
蒸馏水溶解，后用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯分层和残余水层，
挥干溶剂得到乙酸乙酯层浸膏和水层浸膏。实验前将上述各浸
膏用 DMSO分别配成质量浓度为 60mg /ml 的母液。然后将各个
样品用无血清培养基配成 60，600，2400，6000μg /ml的药物原液，
并用 0． 22μm微孔滤膜过滤，置 4℃冰箱备用。
1． 2 细胞培养 人黑色素瘤细胞株 A375，常规传代培养。培养
液用含有 10%胎牛血清的 DMEM 培养液，同时加入链霉素和青
霉素，使双抗在培养液中的浓度为 100U /ml，于 37℃、5% CO2，饱
和湿度条件下培养。视具体情况换培养液，每 2 ～ 3 天传代培养，
使细胞保持在对数生长期。
1． 3 体外细胞增殖抑制实验 选择生长状态较好，处于对数期
的细胞，用含有 10%热灭活胎牛血清的 DMEM培养液将 A375 细
胞制成悬液并调密度至 4 × 104 个 /ml，取 96 孔平底培养板，各孔
加入 100μl细胞悬液。细胞贴壁后，分别加入不同质量浓度的药
物原液 20μl，实验组设 3 ～ 4 个药物质量浓度组，每组药物的终质
量浓度分别为 10，100，400，1000μg /ml。其中药物质量浓度为
1000μg /ml时含二甲基亚砜(DMSO)量最高，为 0． 33%，因此设
空白对照组和含 0． 33% DMSO 对照组。以 200μM 的五氟尿嘧
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啶(5 － FU)作为阳性对照组。每个样品重复 3 孔。将培养板移
入 CO2 孵箱中，孵育 24h，各孔加入 MTT 溶液(5mg /ml)10μl，同
样条件继续孵育 4h 终止培养。弃上清液，每孔加入 150μl DM-
SO，(40℃恒温培养箱中放置使结晶物充分溶解)。选择 570nm
波长，在酶标仪上测定各孔 OD 值，计算体外细胞存活率。细胞
存活率 =(药物孔 OD值 /对照孔 OD值)× 100%。
1． 4 统计分析 实验重复 3 次，实验结果以 珋x ± s表示，采用统计
学 t检验进行组间比较分析，P ＜ 0． 05 为差异有显著性，P ＜ 0． 01
差异极显著。
2 结果
2． 1 乙醇提取物的抗肿瘤活性 用三种植物的乙醇提取物处理
A375 细胞，结果(表 1)发现三种植物的乙醇提取物均对 A375 细
胞增殖有抑制作用，并且随着样品质量浓度的增加，细胞存活率
逐步下降，且与空白对照组有显著差异(P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01)。
豆瓣绿和石蝉草乙醇提取物的抑制作用更明显。另外含 0． 33%
DMSO的样品与空白对照组相比没有显著差异(数据未列出)。
2． 2 极性部位的抗肿瘤活性 分别用三种植物的乙酸乙酯层和
水层处理 A375 细胞。结果(表 2)发现三种植物的乙酸乙酯层均
对 A375 细胞增殖有抑制作用，并且随着样品质量浓度的增加，
细胞存活率逐步下降，且与空白对照组有显著差异(P ＜ 0． 05 或
P ＜ 0． 01)。并且与乙醇提取物处理组相比，乙酸乙酯层处理组
的抑制效果更佳。经统计分析，豆瓣绿、草胡椒和石蝉草三种植
物的乙酸乙酯层抑制 A375 细胞的 IC50值分别为 31． 331μg /ml、
210． 251μg /ml 和 245． 966μg /ml，其中以豆瓣绿的乙酸乙酯层抑
制 A375 细胞增殖的作用最强。水层处理组对 A375 细胞增殖存
在一定的抑制作用，但无明显的剂量依赖性(表 3)。
表 1 草胡椒属植物的乙醇提取物对 A375 细胞增殖的影响(珋x ± s)
组别
存活率 /%
10μg·ml － 1 100μg·ml － 1 1000μg·ml － 1
空白对照组 － － －
5 － FU 50． 77 ± 1． 08＊＊
豆瓣绿 87． 39 ± 3． 23* 78． 91 ± 6． 84* 25． 35 ± 3． 37＊＊
草胡椒 77． 32 ± 1． 77* 74． 34 ± 1． 36* 84． 99 ± 7． 50*
石蝉草 85． 18 ± 5． 18* 84． 99 ± 7． 50* 28． 10 ± 1． 61＊＊
与空白对照组比较，* P ＜0． 05 ，＊＊P ＜0． 01;n =3
表 2 草胡椒属植物的乙酸乙酯部位对 A375 细胞增殖的影响(珋x ± s)
组别
存活率 /%
10μg·ml －1 100μg·ml －1 400μg·ml －1 1000μg·ml －1
空白对照组 － － － －
5 － FU 47． 77 ± 3． 04＊＊
豆瓣绿 109． 90 ± 7． 19 77． 86 ± 4． 07* 16． 59 ± 0． 55＊＊ 17． 54 ± 0． 63＊＊
草胡椒 176． 46 ± 6． 23 41． 11 ± 9． 79＊＊ 29． 74 ± 0． 74＊＊ 24． 82 ± 0． 12＊＊
石蝉草 91． 14 ± 9． 81 91． 01 ± 5． 56 21． 59 ± 1． 43＊＊ 24． 25 ± 1． 35＊＊
与空白对照组比较，* P ＜ 0． 05 ，＊＊P ＜ 0． 01;n = 3
表 3 草胡椒属植物的水层部位对 A375 细胞增殖的影响(珋x ± s)
组别
存活率 /%
10μg·ml －1 100μg·ml －1 400μg·ml －1 1000μg·ml －1
空白对照组 － － － －
5 － FU 47． 77 ± 3． 04＊＊
豆瓣绿 76． 47 ± 7． 44* 65． 55 ± 1． 88＊＊ 88． 13 ± 6． 52* 51． 08 ± 6． 86＊＊
草胡椒 108． 23 ± 5． 28 93． 19 ± 5． 79 98． 99 ± 9． 06 76． 30 ± 4． 67*
石蝉草 109． 73 ± 6． 64 94． 64 ± 8． 38 83． 06 ± 3． 13* 74． 58 ± 4． 80
与空白对照组比较，* P ＜ 0． 05 ，＊＊P ＜ 0． 01;n = 3
3 讨论
本研究旨在初步探讨草胡椒属植物的醇提物及不同部位对
人黑色素瘤细胞的抑制作用。黑色素瘤是一种极易发生转移的
恶性皮肤肿瘤，具有高度的致死性。在美国，每年有超过 9000 人
死于黑色素瘤，用于治疗黑色素瘤的总成本在 33 亿美元［11］。黑
色素瘤本身的高增殖性和微环境血供丰富等特点，有利于该肿瘤
的生长、浸润，对放化疗不敏感，易产生治疗耐受，预后差［12］。天
然产物是人类预防和治疗疾病的重要来源，天然产物及其衍生物
由于蕴藏巨大的生物活性和化学结构多样性引起了人们对天然
产物的持续关注与热切期盼。草胡椒属植物化学成分多样，具有
多样的生物活性。Peperomia sui的正己烷粗提物对 HONE － 1 和
NUGC － 3 癌细胞表现出明显的细胞毒性［13］。陈立等［14］对石蝉
草乙醇提取物影响 A549、KBV200、K562 等细胞增殖的作用亦有
研究，但尚未见有关于其对黑色素瘤细胞增殖作用影响的研究。
为探究草胡椒属植物对人黑色素瘤 A375 细胞增殖作用的影响，
本实验对石蝉草、豆瓣绿和草胡椒的乙醇提取物和乙酸乙酯萃取
层及水层不同植物部位抑制 A375 肿瘤细胞的活性进行了考察。
研究结果显示豆瓣绿和石蝉草乙醇提取物对 A375 细胞增殖抑
制作用更明显(表 1)。研究过程中还发现豆瓣绿的乙酸乙酯部
位抑制 A375 细胞增殖作用最强(表 2)。在所研究的三种草胡椒
属植物中，其乙酸乙酯萃取部位均显示了比乙醇提取物更好的抑
制作用，表明其抑制细胞增殖的有效部位在乙酸乙酯部位。在以
后的研究中，我们将针对草胡椒属植物乙酸乙酯萃取部位的有效
成分进行进一步的研究。
本研究表明，所选取的三种草胡椒属植物草胡椒、豆瓣绿及
石蝉草的 95%乙醇提取物及乙酸乙酯分层均有抑制 A375 肿瘤
细胞增殖的作用，三种植物虽同为草胡椒属，但对黑色素瘤 A375
细胞增殖的抑制作用不同，其中豆瓣绿具有更为显著的抑制黑色
素瘤 A375 细胞增殖的作用。这些发现为草胡椒属植物抗肿瘤
研究奠定了理论基础，同时为该属植物资源开发利用提供了理论
依据。
参考文献:
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2016 VOL． 27 NO． 5 时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 5 期
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军军事医学科学院博士学位论文，2005．
收稿日期:2015-09-15; 修订日期:2016-01-20
基金项目:国家自然科学基金(No． 81360590)
作者简介:史 琴(1976-)，女(汉族)，贵州贵阳人，贵阳中医学院副教授，
硕士学位，主要从事中药药理研究工作．
* 通讯作者简介:王 慧(1967-)，女(汉族)，贵州贵阳人，贵阳中医学院
教授，博士学位，主要从事中西医结合基础研究工作．
PCPA失眠后大鼠不同时间大脑皮质钠 －钾 ATP酶
和钙 －镁 ATP酶活性变化及酸枣仁汤的干预作用
史 琴 ，王 慧* ，武 静，万 亿，藏印竹
(贵阳中医学院，贵州 贵阳 550025)
摘要:目的 研究 PCPA失眠后大鼠大脑皮质不同时间大脑皮质钠 －钾 ATP 酶和钙 －镁 ATP 酶活性变化及酸枣仁汤的
干预作用。方法 采用连续 3 天 ip对氯苯丙氨酸(PCPA)350mg·kg －1的方法建立失眠大鼠模型。动物随机分为空白对
照组、模型组、5 －羟色氨酸(5 － HTP)组、酸枣仁汤(SZＲD)治疗组、5 － HTP + SZＲD 组、SZＲD 对照组和正常对照组。
SZＲD治疗组按 15g·kg －1 ig 7d。各组分别在实验第 4、5、6、8、10 天取皮质组织，采用无机磷法同时测定钠 －钾三磷酸腺
苷酶(Na + /K + － ATPase)和钙 －镁三磷酸腺苷酶(Ca2 + /Mg2 + － ATPase)活性。结果 实验第 4、5、6、8、10 天 PCPA失眠模
型组 Na + /K + － ATPase和 Ca2 + /Mg2 + － ATPase活性均明显下降，与空白对照组相比具有显著性差异(P ＜ 0． 01)，实验第
8 天和第 10 天 SZＲD治疗组 Na + /K + － ATPase活性明显升高，与模型组相比具有显著性差异(P ＜ 0． 01);实验第 8 天和
第 10 天 SZＲD治疗组 Ca2 + /Mg2 + － ATPase的活性明显升高，与模型组相比具有显著性差异(P ＜ 0． 05)。结论 PCPA 所
致失眠能导致大鼠皮质组织 Na + /K + － ATPase和 Ca2 + /Mg2 + － ATPase 的活性明显下降，酸枣仁汤能调节 PCPA 失眠大
鼠皮质 Na + /K + － ATPase和 Ca2 + /Mg2 + － ATPase的活性，这可能是酸枣仁汤治疗失眠症的中枢机制之一。
关键词:对氯苯丙氨酸; 失眠; 酸枣仁汤; 钠 －钾三磷酸腺苷酶; 钙 －镁三磷酸腺苷酶
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2016． 05． 010
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2016)05-1050-03
失眠症严重影响人类的身心健康，失眠症的治疗至关重要。
酸枣仁汤是临床治疗失眠症的常用方剂，但酸枣仁汤治疗失眠的
机制尚未明确。大量研究表明失眠症的发生与脑内 5 － HT递质
代谢紊乱有重要关系，但 5 － HT 递质系统如何与脑内其他功能
系统相互作用进而影响睡眠 － 觉醒功能调节目前仍不清楚。
Na + /K + － ATP 酶(Na + /K + － ATPase)和 Ca2 + /Mg2 + － ATP 酶
(Ca2 + /Mg2 + － ATPase)目前已知对神经信息传递有重要作用。
Na + /K + － ATPase存在于细胞膜上，可以分解 ATP 释放能量从
而维持细胞内高 K +和细胞外高 Na +的不均衡分布状态，以维持
细胞生物电活动的正常进行。Ca2 +是重要的细胞内信号分子，神
经元的功能受到细胞内 Ca2 +浓度的调节，维持细胞内 Ca2 +浓度
稳态的一个重要部分就是 Ca2 + /Mg2 + － ATPase 的活动。细胞内
Ca2 +浓度稳态的破坏可导致神经元活动的失常，最终导致神经细
胞死亡。脑内 5 － HT 递质合成障碍是否能影响 Na + /K + － AT-
Pase和 Ca2 + /Mg2 + － ATPase的功能活动目前尚未见报道。本研
究通过建立 PCPA失眠大鼠模型，观察 PCPA 失眠后不同时间大
鼠大脑皮质 Na + /K + － ATPase和 Ca2 + /Mg2 + － ATPase活动变化
及酸枣仁汤对这种变化的干预情况，进一步探讨 PCPA失眠的机
制及酸枣仁汤的作用机理。
1 材料与仪器
1． 1 动物 健康成年清洁级 SD 雄性大鼠 245 只，体质量 200 ～
220g，由重庆腾鑫生物技术有限公司提供，许可证号:SCXK(渝)
2007 － 0008。置于安静、温度保持恒定(22 ± 2)℃、避免强光的环
境中饲养 7 天。
1． 2 试剂、药物与器材 超微量 ATP酶测试盒(南京建成生物工
程研究所提供，批号:20140911)。对氯苯丙氨酸(PCPA，DL － 4
－ Chlorophenylalanine)Sigma 公司，批号:1001685258;5 －羟色氨
酸(5 － HTP)Sigma公司，批号:101399644;酸枣仁、川芎、知母、茯
苓、甘草均购自贵阳中医学院第一附属医院中药房。721 分光光
度计(上海欣茂仪器有限公司，型号 721B)，大容量台式冷冻离心
机(上海天美生化仪器设备工程有限公司，型号 CT10Ｒ，型号
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时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 5 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2016 VOL． 27 NO． 5