全 文 ：利用 ISSR标记解析紫花苜蓿·黄花苜蓿和胡卢巴属植物的亲缘关系
刘 磊1，2，王宗礼1，李志勇1* ，周国栋1，2，师文贵1，李鸿雁1，蔡丽艳1
(1．中国农业科学院草原研究所，内蒙古呼和浩特 010010;2．中国农业科学院研究生院，北京 100081)
摘要 ［目的］解析紫花苜蓿、黄花苜蓿和胡卢巴属植物的亲缘关系。［方法］利用 ISSR分子标记技术，对紫花苜蓿、黄花苜蓿和胡卢巴
种质资源之间的亲缘关系进行研究。［结果］紫花苜蓿、扁蓿豆和黄花苜蓿有较广遗传基础，胡卢巴种质材料相对于紫花苜蓿种质材料
与黄花苜蓿的亲缘关系更近。苜蓿属和胡卢巴属亲缘关系研究有利于对一些存在争议的中间过渡类型进行分类，但在对中间过渡类型
分类时应找一个合适的“度”，以鉴定存在争议的中间过渡类型属于胡卢巴属还是苜蓿属。［结论］该研究结果为一些植物材料中间过
渡类型的分类学研究提供了指导。
关键词 紫花苜蓿;胡卢巴;黄花苜蓿;亲缘关系;ISSR
中图分类号 S541 + ． 1 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2012)25 －12393 －03
Analysis on Genetic Relationship among Medicago sativa，Medicago falcata and Trigonella foenum-graecum Using ISSR
LIU Lei et al (Grassland Research Institute，CAAS，Hohhot，Inner Mongolia 010010)
Abstract ［Objective］This study aimed to analyze the genetic relationships among Medicago sativa，Medicago falcate and Trigonella foenum-
graecum． ［Method］ ISSR technique was adopted to determine their genetic relationships． ［Result］M． sativa，M． falcata and T． foenum-
graecum had a broad genetic base． T． foenum-graecum shared closer relationship with M． falcata rather than M． sativa． The study on relation-
ship between M． sativa and T． foenum-graecum was advantageous to identify disputable transition types． But there must be a boundary to be
found to identify species belonging to M． sativa or T． foenum-graecum L． ［Conclusion］This study will provide reference for identifying some
disputable transitional species．
Key words Medicago sativa L．;Medicago falcata L．;Trigonella foenum-graecum L．;Relationship;ISSR
基金项目 农业部牧草种质资源保护项目。
作者简介 刘磊(1981 －) ，男，内蒙古乌兰察布人，博士研究生，助理研
究员，从事牧草种质资源及牧草育种研究，E-mail:
liu4311755@ 163． com。* 通讯作者，研究员，博士，硕士生
导师，从事牧草种质资源研究，E-mail:zhiyongl@ public． hh．
nm． cn。
收稿日期 2012-05-07
胡卢巴(Trigonella foenum-graecum L．)又名芸香草、香苜
蓿，系豆科蝶形花亚科一年生草本植物［1］。我国有 9 种，其
中一年生野生种在我国有 4 种，包括网脉胡卢巴(T． cancel-
lata Desf)、单花胡卢巴(T． monantha C． A． Meyer)、直果胡卢
巴(T． orthoceras Kar． et Kir．)和弯果胡卢巴(T． arcuata C． A．
Meyer) ，仅分布于新疆［2］。在自然间存在一些中间过度类群
常被称为“类苜蓿植物(Medicago id)”或“类胡卢巴植物
(Trigonella id)”，主要分布在亚洲中部的帕米尔、克什米尔、
兴都库什和我国西部山地及其周围的高原地带(青海、新疆、
西藏、云南等省区) ，它们的荚果呈扁长圆形、新月形或阔镰
形，弯曲程度不一，既与典型的苜蓿属果实不同，又与典型的
胡卢巴属果实相异，这些中间类群曾一度被分离出来，独立
为扁蓿豆属(Melilotoides Heister ex Fabr．)或黑荚豆属(Tu-
rukhania V ass．)［3 －4］，而有学者把这些过渡类群归入胡卢巴
属［5 －7］或苜蓿属［8 －9］。
ISSR分子标记技术广泛应用于植物亲缘关系的研究，
而且有较好的稳定性和多态性［10］。其在报春花［11］、国
兰［12］、水稻［13］、芒果［14］、烟草［10，15］、观赏贝母［16］、果梅［17］、大
豆［18］、冬虫夏草［19］、丝瓜［20］、茶树［21］等植物上均有应用，且
都取得了较好的效果。
该研究拟通过 ISSR分子标记技术，对紫花苜蓿、黄花苜
蓿和胡卢巴的亲缘关系进行分析，以期为一些中间过渡类型
的分类学研究提供指导。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 试验材料。选取同年种植的紫花苜蓿、黄花苜蓿和
胡卢巴植物作为试验材料。
1． 1． 2 试剂。Taq 酶、dNTP 和 PCR 缓冲液均购自 Sangon
公司。
1． 2 方法
1． 2． 1 DNA提取。从上述试验材料分别随机取样 15 株，
单株提取 DNA。提取方法采用 CTAB法［22］。利用 0． 8%琼
脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量，紫外分光光度计测定 DNA浓
度，提取产物置于 －20 ℃保存备用。
1． 2． 2 样品分析。引物参考加拿大哥伦比亚大学所设计的
二核苷酸重复 ISSR 引物，由上海生物工程技术服务有限公
司(Sangon)合成。
PCR反应体系为:在25 μl反应体系中，Taq DNA聚合酶
1． 5 U，10 × PCR buffer(含 Mg2 +)2． 0 mmol /L，模板 DNA 0． 5
ng /μl，dNTPs 0． 6 mmol /L，引物 0． 9 μmol /L。扩增程序为:94
℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，55 ℃复性 30 s(退火温度依
引物而定) ，72 ℃延伸 30 s，循环 35次，再 72 ℃延伸 7 min，4
℃保存。用 1． 5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，电极缓冲
液为 1 × TAE，电泳时间 40 min。
1． 2． 3 数据分析。同一引物扩增的电泳迁移率一致的条带
被认为具有同源性，使用 POPGENE VERSION 1． 31 软件［23］
统计清晰可重复的电泳条带，按扩增条带有记为 1、无记为
0，并参照 DL 2000 DNA Marker估计片段大小。
2 结果与分析
2． 1 基因组 DNA的检测 琼脂糖凝胶电泳结果表明，试
验所提取的 3种材料基因组 DNA均为一条清晰完整明亮的
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40(25):12393 － 12395 责任编辑 王春艳 责任校对 况玲玲
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.25.091
带，没有拖尾或弥散现象。试验中，如果电泳检测结果为空
白或条带拖尾等，则重新对试验材料进行 DNA 提取、检测，
使得提取的 DNA符合 ISSR分析要求。
2． 2 引物筛选 筛选扩增条带清楚、多态性和重复性好的
引物用作 ISSR研究，共筛选出了 14 个有效引物，引物序列
和退火温度如表 1所示。
表 1 引物序列和退火温度
引物编号 核苷酸序列 退火温度∥℃
UBC808 AGAGAGAGAGAGAGAG C 55
UBC810 GAGAGAGAGAGAGAGAT 65
UBC807 AGAGAGAGAGAGAGAGT 55
UBC825 CACACACACACACA CAT 55
PRIMER21 AGAGAGAGAGAGAGAG CC 62
UBC853 TCTCTCTCTCTCTCTCRT 55
UBC818 CACACACACACACACAG 53
UBC834 AGAGAGAGAGAGAGAGYT 53
UBC854 TCTCTCTCTCTCTCTCRG 55
UBC862 AGCAGCAGCAGCAGCAGC 61
UBC812 GAGAGAGAGAGAGAGAA 52
UBC866 CTCCTCCTCCTCCTCCTC 54
UBC856 ACACACACACACACACYA 58
UBC836 AGAGAGAGAGAGAGAGYA 56
2． 3 总 DNA扩增产物的多态性分析 利用优化的反应体
系从22个 ISSR引物中选取扩增条带清晰、稳定性好的14条
引物进行统计分析(图 1)。
用 14个 ISSR 引物对紫花苜蓿、黄花苜蓿和胡卢巴 18
份种质材料进行 PCR扩增，结果如表 2 所示。共在 92 个位
点获得扩增片段，平均每个引物扩增片段为 6． 57 条，扩增片
段最多的引物是 UBC808，为 12 条，最少的引物为 UBC818，
只有 3条。多态性带共有 91 条，多态性比例为 98． 57%，平
均每个引物产生 6． 5 条多态性带，多态性变幅为 80% ～
100%，由于大多数引物的多态性信息含量较高，故各个材料
的 ISSR多态性比例相对较高，上述结果表明试验材料的遗
传基础相对较广。
注:M为 DL 2000 DNA Marker;1 ～ 5 代表胡卢巴种质材料;6 ～ 11
代表紫花苜蓿材料;12 ～18代表黄花苜蓿材料。
图 1 引物 UBC812对紫花苜蓿、黄花苜蓿和胡卢巴扩增的 ISSR
带型
2． 4 依据 ISSR标记种质的聚类分析结果 由表 3、4 和图
2可知，紫花苜蓿、黄花苜蓿和胡卢巴种质两两间的相似系数
分布在 0． 85 ～0． 94之间。其中胡卢巴属种质材料和紫花苜
蓿种质材料相似系数最小，为 0． 85，遗传距离最大，为 4． 69，
表明种质间的亲缘关系最远;胡卢巴种质材料和黄花苜蓿种
质材料之间的相似系数居中，为 0． 86，黄花苜蓿种质材料与
扁蓿豆种质材料的相似系数为 0． 94，遗传距离最小，可见，胡
卢巴种质材料相对于紫花苜蓿种质材料与黄花苜蓿的亲缘
关系更近。
表 2 14个引物对紫花苜蓿、黄花苜蓿和胡卢巴种质 DNA扩增带数
引物 多态性带数 总带数 多态性微点比例∥%
UBC808 12 12 100
UBC810 5 5 100
UBC807 4 5 80
UBC825 6 6 100
PRIMER21 4 4 75
UBC853 6 6 100
UBC818 3 3 100
UBC834 6 6 100
UBC854 4 4 100
UBC836 9 9 100
UBC856 10 10 100
UBC862 5 5 100
UBC866 8 8 100
UBC812 9 9 100
总计 /平均 91 92 98． 57
表 3 紫花苜蓿、黄花苜蓿和胡卢巴材料基因相似性
popID
popID
1 2 3
1 1 0． 846 1 0． 861 2
2 0． 167 1 1 0． 937 6
3 0． 149 4 0． 064 5 1
注:pop1代表胡卢巴;pop2代表紫花苜蓿;pop3代表黄花苜蓿。
图 2 紫花苜蓿、黄花苜蓿和胡卢巴种质材料基于 ISSR标记的聚类图
表 4 紫花苜蓿、黄花苜蓿和胡卢巴种质材料遗传距离
编号 组间 遗传距离
1 2和 Pop1 7． 91
2 2和 1 4． 69
3 1和 Pop2 3． 22
4 1和 Pop3 3． 22
注:pop1代表胡卢巴;pop2代表紫花苜蓿;pop3代表黄花苜蓿。
3 结论与讨论
ISSR分子标记技术在研究植物遗传多样性和亲缘关系
上已经进行了广泛的应用，在一些植物上也取得了可靠地结
果［11 －22］。但是组成 ISSR分子标记技术的因素众多，几乎组
成反应体系和程序中的每个因子都可以影响到 ISSR分子标
记的准确性［24 －32］，由于 ISSR 分子标记的存在的一定误差，
不可避免的造成在分析遗传多样性和亲缘关系上存在这一
些问题。该试验中，选取了 22条引物，通过电泳胶片最终选
出 14条比较清晰的电泳条带进行亲缘关系的分析，在一定
49321 安徽农业科学 2012 年
程度上保证了试验的精度，从而较为准确反映了材料所蕴含
的信息，较为真实的反映了试验材料之间的亲缘关系。
因为苜蓿属和胡卢巴属都属于蝶型花亚科(Faboideae) ，
具有较为广阔的遗传基础，分析紫花苜蓿、黄花苜蓿和胡卢
巴的亲缘关系，在三者关系比较明晰的情况下，有利于对中
间类型进行分类学的鉴定。该研究对试验材料亲缘关系的
研究，明晰了苜蓿属和胡卢巴属的遗传范围，有利于对存在
争议的中间过渡类型进行分类。
该试验引进了黄花苜蓿这个种质材料，得出了:胡卢巴
种质材料相对于紫花苜蓿种质材料与黄花苜蓿的亲缘关系
更近，这一结果本身就说明了研究苜蓿属和胡卢巴属亲缘关
系的中间过渡类型分类学的重要性，但是，这里存在一个问
题，即在鉴定中间过渡类型时，必须找一个中间过渡类型的
“度”，以鉴定中间过渡类型属于苜蓿属还是胡卢巴属，所以
在以后的研究过程中寻找“度”就显得非常重要。
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79 －84．
(上接第 12392页)
发育，因此要严格控制培养基的 pH 值。培养基的 pH 值因
培养材料不同而异，大多数植物种类要求 pH 值在 5． 0 ～
6． 0［10］。研究显示，唐古特大黄细胞愈伤组织的最佳 pH 值
为 5． 8［11］;在台湾青枣愈伤组织培养过程中发现，pH 值在
5． 5 ～7． 0 范围内时，越接近 6． 0，越有利于愈伤组织的生
长［12］。该试验结果显示，三岛柴胡细胞愈伤组织优化得出
的培养基的最佳初始 pH值为 5． 6。
4 结论
该研究结果表明，基本培养基、pH值、6-BA、NAA、2，4-D
对试验结果的影响均达到显著水平，三岛柴胡愈伤组织快速
繁殖体系的培养基配方为:N6 + 2 mg /L 6-BA + 0． 5 mg /L
NAA，pH值为 5． 6;2，4-D 对三岛柴胡愈伤组织的生长有一
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