全 文 ：2009年 12 月 甘　肃　农　业　大　学　学　报 第 4 4 卷
第 6 期 8 ～ 11 JOURNAL OF GANSU AGRICULTURAL UNIVERSIT Y 双 月 刊
麻黄属植物 SSR反应体系的优化
武季玲1 ,姜寒玉1 ,高玉红2 ,牛俊义2
(1.甘肃农业大学生命科学技术学院 ,甘肃 兰州　730070;2.甘肃农业大学农学院 ,甘肃 兰州　730070)
摘要:以中麻黄为材料 , 探讨了麻黄 SSR技术中 PCR体系的主要成分对扩增结果的影响 ,并对引物退火温度
进行了优化 ,确立了适合麻黄 SSR分子标记的优化体系。为了节约成本 , 在综合分析优化条件的基础上 , 最终确定
的反应体系为:总体系 25μL , 其中 Mg2 + 1.5 mmo l· L -1 , dNTP 0.5 mmol· L -1 , Tag 聚合酶 1.0 U ,引物浓度0.6
μmo l· L-1 , 退火温度为 53 ～ 54 ℃.
关键词:麻黄属植物;SS R;体系优化
中图分类号:S 567.19　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1003-4315(2009)06-0008-04
作者简介:武季玲(1972-),女 ,博士,副教授 ,主要从事植物生理学及组织培养方面的教学及研究.E-mail:w ujl@gu au.edu.cn
通信作者:牛俊义 ,男 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事作物栽培及生态生理方面的教学 、研究工作.E-mail:niujy@gsau.edu.cn
基金项目:甘肃省科技厅自然基金项目(3ZS051-A25-063).
收稿日期:2008-11-18;修回日期:2009-03-06
Optimization of SSR reaction system of Ephedra
WU Ji-ling1 , JIANG Han-yu1 ,GAO Yu-hong2 , NIU Jun-y i2
(1.Colleg e of L ife Sciences and Technolo gy , Gansu Agricultural Univer sity , Lanzhou 730070 , China;2.Co llege of
Ag ronomy , Gansu Ag ricultural Unive rsity , Lanzhou 730070 , China)
Abstract:Ephedra intermedia was used in this study to optimize the several facto rs applied in SSR
technique sy stem .Optimized Simple Sequence Repeats(SSR)system w as established as M g2+ 1 .5 mmol·
L
-1 , dNTPs 0.5 mmol·L-1 , Taq polyme rase 1.0 U , prime r 0 .6 μmol· L-1 .Optimized annealing tem-
perature w as 53 ℃ to 54 ℃.
Key words:Ephedra;SSR;sy stem opt imization
　　麻黄为裸子植物买麻藤纲(Gnetopsida)麻黄
目(Ephedrale s)麻黄 科(Ephedraceae)麻黄 属
(Ephedra)多年生草本状小灌木 ,我国现存 15种 2
变种和 1变型.麻黄中所含麻黄碱 、挥发油 、黄酮类 、
鞣质及麻黄多糖等化学成分 ,具有平喘 、生压 、收缩
血管 、利尿 、降压和降温的作用 ,是治疗风寒感冒 、全
身疼痛 、咳嗽和气喘的良药 ,也是提取麻黄素的唯一
原料.麻黄属植物多生长在沙丘 、黄土丘陵 ,多为荒
漠植被的优势种或建群种 ,在防治水土流失 ,保护草
场 ,改善沙地生态环境等方面发挥着巨大作用[ 1] .
简单序列重复(simple sequence repeats ,SSR)
标记是 DNA 标记的一种.SSR标记具有数量丰富 ,
分布于整个基因组 ,等位变异高 ,共显性 ,检测简单 ,
结果稳定可靠等优点 ,被认为是研究群体遗传多样
性最好的方法 ,在作物的遗传多样性分析 、图谱绘制
和品种鉴定等方面得到了广泛应用[ 2-7] .SSR标记虽
有诸多优点 ,但其应用于不同作物也会出现较大的
差异 ,如易产生非特异性扩增 、干扰因素多 、反应体
系中成分复杂等.目前仅见党荣理等[ 8-9] 利用 RAPD
技术对麻黄亲缘关系进行分析的报道 ,而有关麻黄
SSR的研究国内外尚未见报道.本研究旨在优化并
建立适宜麻黄的高效稳定的 SSR技术体系 ,以期为
麻黄种质的鉴定 、遗传多样性等方面的研究奠定
基础.
DOI :10.13432/j.cnki .jgsau.2009.06.018
第 6 期 武季玲等:麻黄属植物 SSR反应体系的优化
1　材料与方法
1.1　供试材料
采取中麻黄(E .intermedia)幼嫩枝条 ,液氮速
冻后置于-70 ℃冰箱中保存备用.试验所用 SSR
引物序列来自 SSR Taxonomy Brow ser数据库(ht-
tp ://bioinfo rmatics.pbcbasc.lat robe.edu.au/cgi-
bin/ ssrs.cgi ? tax id =3760),SSR引物由北京赛百
盛基因技术有限公司合成(表1).试验在甘肃省作
物改良与种质创新重点实验室完成.
1.2　主要试剂及设备
Tag DNA 聚合酶 、10×buffer 、Mg2+购自大连
宝生物公司;dN TP 购自上海生物工程技术公司.
TEMED(N , N , N, N-Tetramethy lethy lenedia-
mine)购自 Promega 公司;十二烷基硫酸钠(sodium
dodecy I sulfate ,SDS)购自 Sigma 公司.
PCR反应在梯度扩增仪上进行 (PTC-100 ,
M JR esearch公司).
表 1　麻黄 SSR 引物 PCR参数
Tab.1　PCR parameter of SSR primer of E phedua
编号 左引物序列 右引物序列 左引物退火温度/ ℃
右引物退
火温度/ ℃
左引物
GC/ %
右引物
GC/ %
1 GGGAAGAACTATGGGAATG C TAACCGTGACCAACCAG 53.0 56.0 47.4 55.6
2 T TTAGGGAAGGAGAGGGA CGGAGGACCAGAGATAGG 54.7 55.6 50.0 61.0
3 CATTACGGTCCCTCCTT T GCTGTATTAT TGAACACCCAC 55.0 54.7 50.0 42.9
4 CATTACGGTCCCTCCTT T TTGTATTAT TGAACACCCACC 54.0 54.0 50.0 38.1
5 TCT TAC TTGCCGCTCACT GT TGCCAGATTGCT TCC T 54.0 54.0 50.0 50.0
6 TCT TAC TTGCCGCTCACT GT TGCCAGATTGCT TCC T 54.0 54.0 50.0 50.0
7 ATCT TACT TGCCGCTCAC T AAAGGAGGCGACGATGGG 55.1 63.5 47.4 61.1
8 GACGGTGTGGCGTAGGTT AGTGAGCGGCAAGTAAGA 54.5 56.3 61.1 50.0
9 TCT TAC TTGCCGCTCACT GT TGCCAGATTGCT TCC T 54.7 52.1 61.1 50.0
10 T TTAGGGAAGGAGAGGGA TATTACTGAACACCCAACCT 54.7 52.1 50.0 50.0
11 GAGGGAAGCGAA TGGAGG TCC TTGGTCCGTGTT TCA 54.0 53.2 50.0 40.0
12 GACGGTGTGGCGTAGGTT AGTGAGCGGCAAGTAAGA 59.6 54.5 61.1 50.0
13 CATTACGGTCCCTCCTT T TATTACTGAACACCCACCT 55.0 53.5 50.0 50.0
14 GACGGTGTGGCGTAGGTT AGTGAGCGGCAAGTAAGA 57.5 55.0 55.4 46.8
15 GAGGGAAGCGAA TGGAGG TCC TTGGTCCGTGTT TCA 54.0 53.5 48.6 50.4
1.3　基因组 DNA的提取
DNA 的提取参照高盐低 pH 值法[ 9] .DNA 浓
度和纯度检测在紫外分光光度计上进行.用 0 .8 %
琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量.
1.4　SSR反应体系及 PCR扩增条件
Mg2 +浓度梯度:0 .8 , 1.0 , 1.25 , 1 .5 , 2.0
mmo l·L-1 ;dN TP 浓度梯度:0.1 , 0 .2 , 0.3 , 0 .4 ,
0.5 mmo l·L-1 ;引物浓度梯度:0.1 , 0.2 ,0 .4 , 0.5 ,
0.6 μmo l· L-1 ;Tag DNA 聚合酶用量:1.0 , 1.5 ,
2.0 , 2.5 , 3.0 U ;模板 DNA 用量:5 , 10 , 15 , 20 , 30
ng ;退火温度:49.0 , 50.0 , 50 .9 , 52 , 53.2 , 54.4 ,
55.6 ,56.8 ,58.0 , 59.0 ℃(PCR仪自动生成).总体
系 25 μL ,当其中任一种成分进行用量梯度试验时 ,
其它成分用量不变.
采用高浓度琼脂糖凝胶(2 %～ 3 %)电泳检测
PCR扩增产物.
2　结果与分析
2.1　Mg2+浓度对 SSR反应的影响
优化 Mg2+浓度是保证 SSR-PCR稳定性和多
态性的基础.图 1为不同 Mg2+浓度的扩增结果.结
果显示 ,Mg 2+在 0.8 ～ 2 .0 mmo l·L-1浓度范围内 ,
均可得到扩增.0 .8 ～ 1.25 mmo l·L -1的 Mg2+浓度
略低 ,影响了 DNA聚合酶的活性 ,2 .0 mmo l·L-1
的浓度下扩增条带不稳定 ,经反复试验 ,Mg2+浓度
为 1.5 mmo l·L -1时谱带最清晰稳定 ,扩增效果最
好.因此 ,本试验从扩增的结果和成本考虑 , 确定
Mg2+浓度为 1 .5 mmo l·L-1 .
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甘 肃 农 业 大 学 学 报 2009 年
注:1-5.Mg2 +浓度分别为 0.8 , 1.0 , 1.25 , 1.5 , 2.0 mmol· L-1
图 1　Mg2+浓度对 SSR反应的影响
Fig.1　Effect of M g2 +concentrations on SSR reaction
2.2　dNTP浓度对 SSR反应的影响
dN TPs是 SSR-PCR扩增效果比较好且反应稳
定的底物 ,dN TPs量的多少直接关系到扩增产物量
的多少 ,并对 SSR-PCR的非特异性扩增产生一定
影响.由图 2可见 , dN TP 浓度低于 0.2 mmol· L-1
时 ,无扩增或扩增带微弱 ,在 0.3 ～ 0.5 mmol· L-1
范围内 ,均有多条扩增条带 ,其中 dNTP 为 0.50
mmo l·L-1时扩增带最清晰稳定 ,而且条带整齐.故
dN TP 的浓度确定为 0.50 mmo l·L-1 .
注:1-5.dNTP 浓度分别为 0.1 , 0.2 , 0.3 , 0.4 , 0.5 mm ol · L -1
图 2　 dNTP 浓度对 SSR反应的影响
Fig.2　Effect of dNTP concentrations on SSR reaction
2.3　Taq DNA聚合酶对 SSR反应的影响
图 3显示了不同浓度 Taq聚合酶 PCR扩增产
物情况.结果表明 , Taq聚合酶有很高的活性 ,即在
低浓度下具有扩增效果 ,在高浓度下也具有扩增带
型丰富的效果 , 5个浓度均有扩增产物.从试验结果
注:1-5.Taq聚合酶用量分别为 1.0 , 1.5 , 2.0 , 2.5 , 3.0 U
图 3　Taq聚合酶用量对 SSR反应的影响
Fig.3　Effect of Taq DNA polymerase concentr ations
on SS R reaction
及经济节约角度考虑 ,在 Taq聚合酶浓度为 1.0 U
时带型丰富 ,扩增带清晰稳定.故确定 Taq DNA 聚
合酶适宜用量为 1.0 U .
2.4　引物浓度对 SSR反应的影响
图 4可见 ,在 0.1 μmol·L-1的引物浓度下 ,无
扩增 ,引物浓度在 0.2 ～ 0.4 μmo l· L-1范围内 ,扩
增条带少而且不亮 ,说明被扩增的片断和扩增量较
少.引物浓度为 0.5 , 0.6 μmol ·L-1时扩增效果较
好 ,条带清晰稳定 ,尤其在 0.6 μmol·L -1时扩增条
带最好 ,故选择 0.6 μmo l·L-1为引物优化浓度.
注:1-5.引物浓度分别为 0.1 , 0.2 , 0.4 , 0.5 , 0.6 μmol· L -1
图 4　引物浓度对 SSR反应的影响
Fig.4　Effect o f primer concentra tions on SS R reaction
2.5　模板 DNA对 SSR反应的影响
结果表明 ,模板 DNA 在设定的用量范围内 ,扩
增带数 、带型和带的明暗程度变化不大 ,出现平台效
应.10 ～ 30 ng ·μL-1谱带效果没有太大差别 ,扩增
条带基本一致.相比之下 ,模板在 20 ～ 30 ng ·μL-1
时条带更清晰 ,故本研究确定加入 DNA 模板在 20
～ 30 ng ·μL-1为宜.
注:1-5.DNA 用量分别为 5 , 10 , 15 , 20 , 30 ng
图 5　DNA用量对 SSR反应的影响
Fig.5　Effect of DNA concentrations on SSR reaction
2.6　PCR退火温度对 SSR反应的影响
由图 6可看出 ,在 53.2 ～ 58 ℃.0的退火温度
条件下 ,均能扩增出条带 ,但 58.0 ℃扩增结果不理
想 ,在 53.2 ℃带型比较清晰 ,信息量较多 , 54.4 ～
56 .8 ℃之间差别不大 ,为了获得最佳的扩增效果 ,
退伙温度可在 53 ～ 54 ℃.
2.7　SSR反应体系的建立
在节约成本和对以上试验结果综合考虑的基础
上 ,确定了麻黄 SSR最佳反应体系中的各参数.在
进行 SSR扩增时 ,在 PCR 管中依次加入下列试剂
(表 2).
反应程序为 :95 ℃预变性2min ;9 4 ℃变性40
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第 6 期 武季玲等:麻黄属植物 SSR反应体系的优化
注:1-10.退火温度分别为:49.0 , 50.0 , 50.9 , 52 , 53.2 , 54.4 , 55.6 , 56.8 , 58.0 , 59.0 ℃
图 6　SSR 引物 1 的 PCR扩增结果
Fig.6　PC R result of primer 1
s ,49 ～ 59 ℃退火 45 s 、72 ℃延伸 2 min ,30个循环;
最后 72 ℃延伸 8 min ,4 ℃保存.
表 2　SSR 反应体系
Tab.2　SS R reaction sy stem
加样顺序 加样体积/μL
灭菌双蒸水 15.8
10×Buffe r 2.5
MgCl2(25 mmo l· L-1) 1.5
dNT(2.5 mmo l· L-1) 1.0
上游引物(10 μmol· L-1) 1.5
下游引物(10 μmol· L-1) 1.5
TaqDNA 聚合酶(5 U ·μL -1) 0.2
DNA 模板(20～ 30 ng·μL-1) 1.0
总体积 25
3　讨论
SSR分子标记具多态性高 、遗传信息量大 、重
复性且呈共显性等特点 ,是一种较为理想的分子标
记技术 ,在植物种质资源遗传多样性和基因分子标
记等遗传育种领域中已被广泛应用 ,而在麻黄上的
应用国内外尚无报道.SSR反应涉及诸多因素 ,每
个因素对整个反应体系都有较大影响.由于微卫星
DNA 的片段较小 ,若许多因子的条件不适合则导致
图谱弥散状背景的产生 ,扩增产物的消失以及电泳
谱带位置的改变.这些现象都影响 SSR的扩增结
果 ,因此在具体某一作物的 PCR 反应过程中 ,必须
确定各组成成分的适宜浓度 ,以提高 PCR反应的效
率 ,并减少非特异性扩增[ 10] .本试验对 PCR反应体
系进行了优化 ,确定了最适麻黄 SSR反应的体系:
25 μL 反应体系 , Mg2+为 1.5 mmol ·L-1 、dN T 为
0.40 ～ 0.50 mmo l· L-1 、Tag 聚合酶为 2.5 U 、引
物为 0.5 ～ 0.6 μmol · L-1 、DNA 模板在 20 ～ 30
ng ·μL-1 ,剩余体积用 ddH 2O 补充.
PCR反应的扩增效率是反应体系中各因素综
合作用的结果.Taq酶用量是重要的因子 ,它直接影
响多态性的检出率和扩增结果的重复性及忠实
性[ 1 0] .Mg2+浓度是影响 Taq酶活性的主要因子 ,
Mg
2+浓度过高会使非特异性扩增产物增加;Mg2+
浓度过低则造成扩增产物减少 ,甚至不能扩增.这是
因为 Mg2+是 Taq DNA 聚合酶的激活剂 ,其浓度不
仅影响酶的活性和扩增的可靠性 ,而且还会影响引
物与模板的结合效率和产物的特异性[ 10] .不同物种
对 Mg2+浓度的要求不同 ,从已有的报道看 , Mg2+
浓度范围大多在 1.5 ～ 3.0 mmol·L -1之间[ 10-14] ,也
有高达 7.5 mmol·L-1的报道[ 15] .本试验结果是在
1.5 mmo l · L-1时扩增产物最清晰 , Mg2+为 2.0
mmol·L-1时扩增结果不稳定 ,出现这种现象的原
因可能是由于高浓度 Mg2+影响了 Taq 酶的活
性[ 1 5] .dN TP 浓度过低影响扩增效率 , 浓度过高将
与 Taq DNA 聚合酶竞争 Mg2+ ,影响游离 Mg2+浓
度 ,降低酶活性.引物的质量和特异性也直接影响
PCR扩增反应 , 引物浓度过高会促进非特异性扩
增 ,还会增加引物二聚体的形成.一般认为模板
DNA ,退火温度等因素适宜用量的范围较宽 ,本试
验结果也验证了这一点.试验发现每一个扩增条件
的变化都会对 SSR图谱产生较大的影响 ,反应体系
各因素间存在相互影响关系 ,需要对主要因素进行
互作的研究 ,寻找优化的反应体系.
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