全 文 ：收稿日期:2010-09-05
基金项目:贵州省科技厅对外合作项目(2006)[ 400101] “杜鹃花属植物开花习性分子水平研究 ”;贵州省重大科技专项(黔科合重大专项字 [ 2007]
6005号)“延长百里杜鹃花期配套技术 ”部分;国家农业科技成果转化资金项目(2007GB2F200289号)“杜鹃栽培繁殖技术在贵州百里杜
鹃区的中试与转化 ”。
作者简介:王孜昌(1957-),男 ,高级工程师 ,主要从事林木遗传及生殖学研究。
贵州百里杜鹃保护区杜鹃属植物系统发育与开花习性的
分子水平分析
王孜昌 1 , 　陈　训 2 , 　任竹梅 3 , 　周家维1 , 　陈　翔 2 ,
安　淼3 , 　高贵龙 2 , 　黄家勇 4 , 　罗在柒 1
(1.贵州省林业科学研究院 , 　贵阳 550005;　2.贵州省科学院 , 　贵阳 550001;
3.山西大学 , 　太原 030006;　4.贵州百里杜鹃林业环保局 , 　贵州黔西 551500)
AnalysisonPhylogenesisofRhododendronL.PlantLocatedinHundredRhododendron
ProtectionZoneofGuizhouandFloweringCharacteristicsinMolecularLevel
WANGZi-chang1 , CHENXun2 , RENZhu-mei3 , ZHOUJia-wei1 , CHENXiang2
ANMiao3 , GAOGui-long2 , HUANGJia-yong4 , LUOZai-qi1
摘要:应用 trnL-F序列分析方法 , 对贵州百里杜鹃自然保护区
内的杜鹃属进行了系统发育关系与开花性状研究和分析。从
分子水平分析了杜鹃花属中马银花亚属 、映山红亚属 、杜鹃亚
属 、糙叶杜鹃亚属 、常绿杜鹃亚属等 5个亚属的系统发育关系;
从常绿杜鹃亚属的参试物种中分析了 3个不同颜色的聚合群
及之间的系统发育关系;从遗传物质的重组和分离的视角对红
色 、白色和粉色不同聚合群的生殖关系提出了两个假设。
关键词:　分子水平;系统发育与开花习性;贵州杜鹃花
中图分类号:　S685.21　　　文献标志码:　A
文章编号:　1001-4705(2010)12-0072-05
杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃属 (Rhododendron)植
物是世界最著名的高山野生花卉 、世界园林最著名的
观赏植物 、中国十大名花之一。杜鹃属植物广泛分布
于亚洲 、欧洲(约 9个原生种)、北美洲(24个原生种)
和大洋洲(仅有一个原产种)。亚洲是杜鹃花分布数
量最多的地区 ,其中以东亚和东南亚为世界最重要的
两大分布中心。中国的西南地区是东亚分布区中原生
种分布最多的区域。贵州杜鹃花原生种分布数量为全
国最多省(区)之一 ,是杜鹃花中国中心分布区向外扩
张的过渡地带 ,有着丰富的原生种和大量可能的新种
和变种 。贵州的百里杜鹃国家级保护区位于贵州省大
方 、黔西县交界处 ,地理坐标为:东经 105°45′～ 106°
04′45″,北纬 27°08′30″～ 27°20′00″。分布面积很广 ,占
整个天然杜鹃林带宽 1 000 ～ 3 000 m,绵延 50km,总
面积 125.8km2 ,是世界同纬度罕见的杜鹃花植被景
观 。在这个区域中 ,初步的科学考察结果约有 5个亚
属 43个杜鹃花原生种及众多待深入研究的新种和
变种。
杜鹃花属植物的科学研究在国内外均较为广泛和
深入 ,但在国内研究最多的领域是资源考察 、形态学分
类 、生态分布方向;20世纪后期有一定生物化学和组
织形态学研究;分子生物学研究分析有了一定进展 ,但
应该说尚属起步阶段 。在杜鹃属植物的分子系统学研
究中 ,国内外均有过一些报道 ,如 Kurashigeetal.[ 5]采
用 matK和 trnK序列证据进行了杜鹃属下各组间的关
系研究 ,高连明等 (2002 a＆d)基于 ITS序列进行了
杜鹃属的亚属和组间系统关系及杜鹃属映山红亚属的
组间关系研究 , Goetschetal.[ 7]提出了基于分子数据
和形态特征的杜鹃属 5个亚属的新分类系统 ,谭萍
等 [ 8]进行的贵州几种常见杜鹃花的随机扩增多态性
DNA(RAPD)研究 ,以及赵喜华等 [ 9]运用 RAPD技术
对 9种常绿杜鹃亚属和 2种马银花亚属杜鹃的亲缘关
系及系统位置所作研究等 。叶绿体基因组 cpDNA基
因间区的 trnL-F间隔区序列目前已经较多地应用于
植物系统发育分析中 [ 10 ～ 13] 。
目前分子生物学的研究主要集中在系统发育和物
种分类方向 , 在开花性状的研究罕见 。本研究应用
trnL-F序列分析方法 ,对百里杜鹃自然保护区内的杜
鹃属进行了系统发育关系与开花性状研究和分析 ,以
期为保护区内不同杜鹃属物种的分类以及生殖性状的
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DOI :10.16590/j.cnki.1001-4705.2010.12.076
表 1　百里杜鹃杜鹃属植物 DNA材料采样记录及花期等特征表
采集号 种 名 所属类群 花期(月份) 花色 备注
08025 映山红 映山红亚属 -映山红组 4～ 5 鲜红色
08010 映山红(变种) 映山红亚属 -映山红组 4～ 5 鲜红色
08011 桃叶杜鹃 常绿杜鹃亚属 -露珠杜鹃亚组 5～ 6 白色
09040 金波杜鹃 常绿杜鹃亚属 -露珠杜鹃亚组 3～ 4 淡粉色 、红
09042 匙叶杜鹃 常绿杜鹃亚属 -露珠杜鹃亚组 3～ 4 粉红带紫色
09054 露珠杜鹃 常绿杜鹃亚属 -露珠杜鹃亚组 3～ 4 乳白 、淡黄
09049 迷人杜鹃 常绿杜鹃亚属 -露珠杜鹃亚组 3～ 4 较深粉红色
09051 光柱迷人杜鹃(变种) 常绿杜鹃亚属 -露珠杜鹃亚组 3～ 4 较深粉红色 叶窄 、背面毛被胶结
09053 迷人杜鹃(变种) 常绿杜鹃亚属 -露珠杜鹃亚组 3～ 4 较深粉红色 叶为豆荚形
09046 美容杜鹃 常绿杜鹃亚属 -云锦杜鹃亚组 4～ 5 粉红
09057 大白杜鹃 常绿杜鹃亚属 -云锦杜鹃亚组 5～ 6 白色
08029 高尚大白杜鹃 常绿杜鹃亚属 -云锦杜鹃亚组 6～ 7 白色
09048 新方杜鹃 常绿杜鹃亚属 -云锦杜鹃亚组 5～ 6 白色
08024 黄坪杜鹃 常绿杜鹃亚属 -云锦杜鹃亚组 4～ 5 蔷薇色 、红
08031 九龙山杜鹃 常绿杜鹃亚属 -云锦杜鹃亚组 6～ 7 白色
09050 树形杜鹃 常绿杜鹃亚属 -树形杜鹃亚组 3～ 4 蔷薇色或深红色
09055 马缨杜鹃 常绿杜鹃亚属 -树形杜鹃亚组 3～ 4 深红色
09044 狭叶马缨杜鹃 常绿杜鹃亚属 -树形杜鹃亚组 3～ 4 深红色
09038 微毛马缨杜鹃 常绿杜鹃亚属 -树形杜鹃亚组 3～ 4 深红色
08032 银叶杜鹃 常绿杜鹃亚属 -银叶杜鹃亚组 5～ 6 白色粉红色
07399 皱叶杜鹃 常绿杜鹃亚属 -银叶杜鹃亚组 3～ 4 粉红色
08023 繁花杜鹃 常绿杜鹃亚属 -银叶杜鹃亚组 3～ 4 粉红色
08034 枇杷叶杜鹃 常绿杜鹃亚属 -银叶杜鹃亚组 3～ 4 浅粉红色
09052 皱叶杜鹃(变种) 常绿杜鹃亚属 -银叶杜鹃亚组 3～ 4 粉红色 叶较大 、叶背毛胶结
08033 淡粉杜鹃 常绿杜鹃亚属 -麻花杜鹃亚组 2～ 3 淡粉色
08019 普底杜鹃 常绿杜鹃亚属 -大理杜鹃亚组 4 白色带浅粉色
08026 云南杜鹃 杜鹃亚属 -三花杜鹃亚组 4/11 淡紫色
08013 百合花杜鹃 杜鹃亚属 -有鳞大花亚组 5 白色
08016 糙叶杜鹃 糙叶杜鹃亚属 -糙叶杜鹃组 2～ 4 粉红色
08030 长蕊杜鹃 马银花亚属 -长蕊杜鹃组 6～ 7 白色
深入研究 、开发和利用提供更多理论基础和科学依据。
1　材料及方法
1.1　材　料
30种(其中有迷人杜鹃 2个变种 、映山红 1个变
种 、皱叶杜鹃 1个变种)杜鹃花属植物的叶片 。来自
贵州省百里杜鹃保护区 ,共有 5个亚属的杜鹃花物种。
包括映山红亚属 2种 、常绿杜鹃亚属 24种 、杜鹃亚属
2种 、糙叶杜鹃亚属 1种及马银花亚属 1种。杜鹃属
下分类系统依据 《中国植物志 》 (方瑞征等 1999)和
《FloraofChina》 (Fangetal.2005)。见表 1。
外类群构建分子系统树物种为扫帚岩须 Cassiope
fastigiataD.Don和灯 笼树 Enkianthuschinensis
Franch.两种 ,其基因序列来自 Genbank。扩增采用引
物 c(CGAA ATCGGTAGACGCTACG)和 f(ATTT-
GAACTGGTGACACGAG)(Taberlet等 , 1991)。基因序
列号为 AF394265和 AF452225。
1.2　方　法
1.2.1　采样方法与野外处理
于 2009年 6月上旬在贵州省黔西县与大方县交
界的贵州百里杜鹃保护区杜鹃原生林中对采样树进行
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问题探讨　　王孜昌 等:贵州百里杜鹃保护区杜鹃属植物系统发育与开花习性的分子水平分析
图 1　DNA分析聚类图
叶片采集并逐一登记环境与生长因子 。当天对所采样
品迅速用变色硅胶进行干燥保存。
1.2.2　DNA提取及 PCR扩增与测序
使用改进的 CTAB法进行总 DNA提取 (Doyle
＆Doyle, 1987)。trnL-F序列的扩增采用引物 c
(CGAAATCGGTAGACGCTACG)和 f(ATTTGAACTG-
GTGACACGAG)(Taberlet等 , 1991), 反应体系为 50
μl,反应体积含:10×bufer, 0.25mmol/LdNTP, 0.25
mmol/LMgCl2 ,引物 “c”和 “f”各 0.01μmol/L, 1.5U
TaqDNA聚合酶 , 以及模板溶液 2μl(含 20 ～ 25 ng
DNA)。 PCR扩增条件为 95 ℃预变性 3 min, 95 ℃变
性 40s, 50℃退火 50s, 72℃延伸 1.5min, 40个循环 ,
最后 72℃延伸 7min。 PCR产物使用来宝生物公司凝
胶回收试剂盒回收目的片段 ,委托三博生物技术有限
公司测序。
1.2.3　序列分析
序列排列用 ClustalX软件完成(Thompsonetal.,
1997)。排好的序列用 PAUP4.0(Swoford, 2000)和
Mega4(Kumaretal., 2001)进行系统发育分析。利用
PAUP4.0做简约(Parsimony)分析时 ,空位(gap)始终
作为缺失状态 ,使用启发式(heuristic)搜索最简约树 ,
采用 100次重复的随机加入(randomadditionof100
replicates)寻找最简约树的岛屿(islands)分布(Madd-
ison, 1991)。利用 bootstrap(1 000次重复)(Felsen-
stein, 1985)检验各分支的置信度 。
1.2.4　聚类图的建立
使用岩须属的扫帚岩须(Cassiopefastigiata)和吊
钟花属的灯笼树(Enkianthuschinensis)作为外类群。
使用 PAUP构建的 trnL-F序列聚类图树 。
2　结果与分析
经过对位排列后 ,序列长度为 919bp,包括 144个
变异位点 , 42个简约信息位点。通过这些信息 ,利用
PAUP构建了 trnL-F序列聚类图(见图 1)。通过对
PAUP构建的 trnL-F序列聚类图树进行整理 ,得出系
统发育树图(见图 2)。
从系统发育树可以看出 ,该树有 2个一级分枝 A、
B;4个二级分枝 A1、A2 、B1 、B2;4个三级分枝 B1.1 、
B1.2 、B2.1 、B2.2;2个四级分枝 B2.1.1 、B2.1.2。
从亚属分类层面分析:在 PAUP构建的 trnL-F序
列聚类图中 , 30个杜鹃花物种分成了 A, B两个一级分
枝 。A的支持率为 99%, B的支持率为 72%。其 A分
枝又分为了两枝:A1映山红亚属的映山红和似映山红
为一枝 , A2马银花亚属的长蕊杜鹃自为一枝 。分枝一
级分枝 B分有分枝 B1枝和 B2枝 。其分枝 B1又为
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图 2　系统发育树图
A、B为第一级分枝;A1、A2 、B1、B2为第二级分枝;B1.1、B1.2、B2.1、B2.2为第三级分枝;B2.1.1、B2.1.2为第四级分枝;
(红色)、(白色)、(粉色)为不同聚合群花的颜色;括号内数据如(99)为聚合群的支持率。
B1.1糙叶杜鹃亚属的糙叶杜鹃 ,以及 B1.2杜鹃亚属的云
南杜鹃和百合花杜鹃两枝 。分枝 B2全部属于常绿杜
鹃亚属 。至此 5个亚属明显地独立于系统发育树的不
同分枝 ,即 A1、A2、B1.1、B1.2 、B2。
常绿杜鹃亚属内层面分析:参加实验分析的所有
常绿杜鹃亚属杜鹃物种都聚合在 B2分枝 ,其支持率为
89%。从这个分枝可以看出有 3个聚合的小分枝 ,
B2.1.1 、B2.1.2和 B2.2、其支持率分别为 59%、 86%和
84%。
3　讨　论
3.1　从亚属间的层面来看 ,在基于 trnL-F间隔区序
列的结果分析得到的系统发育树图中 ,参加实验分析
的 5个杜鹃花亚属杜鹃花物种均明显地独立于系统发
育树的不同分枝 ,即 A1 、A2 、B1.1 、B1.2 、B2。结果表明 ,
该分析方法对杜鹃属物种的研究在亚属层面上与形态
学研究方法有较好的对应关系 。
3.1.1　在第一级分枝中 ,映山红亚属的映山红杜鹃与
马银花亚属的长蕊杜鹃亲缘关系较为相近 ,两者组成
共同分枝 A的支持率达到了 84 %。表明映山红亚属
A1和马银花亚属 A2之间在分子水平分析上存在着较
近的系统发育关系。
3.1.2　本研究中 ,有鳞类杜鹃全部的种类均聚为一枝
B1 ,由糙叶杜鹃亚属 B1.1的糙叶杜鹃与杜鹃亚属 B1.2
的百合花杜鹃和云南杜鹃构成 ,支持率为 83%,表明
了这两个亚属间的系统发育关系较近 。在其中小的分
枝内 ,糙叶杜鹃是独立成一枝的 ,而杜鹃亚属的百合花
杜鹃和云南杜鹃另构成一个小分枝 ,支持率有 63 %。
3.1.3　在本次研究中 ,常绿杜鹃亚属植物种类全部聚
为一枝 B2 ,其支持率达 89%,表明了常绿杜鹃亚属是
一个单系类群。相对比常绿杜鹃亚属与有鳞类杜鹃的
糙叶杜鹃亚属和杜鹃亚属间的系统发育关系较近 ,而
与映山红亚属和马银花亚属间的系统发育关系较远 。
3.2　从常绿杜鹃亚属内分析:trnL-F间隔区序列的
结果没有对应形态学分类方法的各亚组情况。在形态
学研究方法的实践中 ,同样存在该亚属中不少亚组间
的区别特征是不甚明显或多有交错的 ,在一些类群的
分类学处理和研究中存在一些困难。本研究所包含的
常绿杜鹃亚属各个亚组 ———大理杜鹃亚组 、银叶杜鹃
亚组 、露珠杜鹃亚组 、云锦杜鹃亚组 、树形杜鹃亚组和
麻花杜鹃亚组的杜鹃花物种均交错在一起并组成 3个
小的分枝 B2.1.1、B2.1.2 、B2.2。
3.3　对应用 trnL-F隔区序列方法得到的第二级分
枝 ,常绿杜鹃亚属物种组成的 B2分枝进行分析发现:
3.3.1　本研究中的 24个常绿杜鹃亚属物种分别组成
的 3个小分枝有着明显的花色特征区别。位于三级分
枝的 B2.2聚合群有 5个种 ,具有以粉色为主的颜色特
征;位于另一枝三级分枝 B2.1有 2个四级分枝 , 其中
B2.1.1聚合群有 12个种 ,具有以红色为主的颜色特征;
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问题探讨　　王孜昌 等:贵州百里杜鹃保护区杜鹃属植物系统发育与开花习性的分子水平分析
B2.1.2聚合群有 7个种 ,具有以白色为主的颜色特征 。
从系统发育关系分析 ,在常绿杜鹃亚属物种中 ,红
色聚合群 B2.1.1和白色聚合群 B2.1.2位于相同三级分枝
B2.1 ,它们应该有较近的系统发育关系;而粉色聚合群
B2.2独立位于另外三级分枝 。
3.3.2　B2.2聚合群的粉色 ,正是 B2.1.1聚合群的红色与
B2.1.2聚合群白色的综合色 。到此出现两个假设:a.以
马缨杜鹃为代表的红色聚合群与以大白杜鹃为代表的
白色聚合群 ,在其系统发育过程中 ,通过其遗传物质重
组 ,演变出杜鹃花粉色的物种群;b.粉色杜鹃花物种
群 ,在其系统发育过程中 ,通过其遗传物质的分离 ,演
变并分化出红色杜鹃花的物种和白色的杜鹃花物种 。
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