全 文 ：沙棘属植物RAPD最佳反应体系的建立
收稿日期:2006-04-13
作者简介:刘雨娜(1980-),女,黑龙江人,硕士,研究方向为
果树分子遗传学。
*通讯作者E-mail:yzy@neau.edu.cn
刘雨娜,于泽源*,李兴国
(东北农业大学园艺学院,哈尔滨 150030)
摘 要:文章以大果沙棘品种“楚伊”为试材,对沙棘属植物RAPD分析的最佳反应条件进行优化。结果表明,
沙棘属植物 RAPD分析的最适反应体系为:体系总体积 25!L,DNA30ng,TaqDNA聚合酶 1.0U,dNTPs1.0
!L(原液浓度2.0mmol·L-1),Mg2+2.0!L(原液浓度25mmol·L-1),引物3.0!L(原液浓度为5pmol·(3!L)-1),10×
bufer2.5!L,不足的体积用超纯水补足。在最佳反应条件下,RAPD分析具有良好的稳定性和可重复性。
关键词:沙棘;RAPD;体系优化
中图分类号:S793.6;Q78 文献标识码:A
20世纪 90年代发展起来的随机扩增多态性
DNA(RAPD)技术从遗传物质 DNA水平上揭示种
质之间的遗传变异情况[1-2],自问世以来,在短短
几年间已广泛应用于基因定位、遗传连锁图谱构
建、遗传多样性分析、种质鉴定以及起源、演化
和分类等诸多领域,成为当今最重要的分子生物
技术之一[3]。然而,RAPD也有其固有的缺点,即
对反应条件比较敏感,需要较严格的反应条件。
因此,在进行 RAPD分析时,首先要摸清其在供
试材料上的最佳反应条件,建立起具有高度重复
性的反应体系[4]。
沙棘为胡颓子科(Elaeapnacae)、沙棘属(Hippo-
phae)植物,又名酸刺、里刺、醋柳。是一种落叶
灌木或乔木,是兼有生态效益、经济效益和社会
效益的优良树种,具有众多珍贵特性[5]。本文通过
对影响沙棘属植物 RAPD分析诸因素的研究,建
立起具有高度重复性和稳定性的沙棘属 RAPD反
应技术体系,为日后沙棘属植物 DNA水平上的研
究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
于2004年8月在黑龙江省农科院浆果研究所
试验圃地采集大果沙棘品种楚伊的叶片(新出嫩
叶),放于采样箱中带回实验室冻藏于-80℃冰箱中
备用。
试验所用仪器为 PE-9600G型 PCR扩增仪
(美国PerlinElmer公司)、BEACKMANDU-7柴外
分光光度仪(德国)、TCL-6高速台式离心机(上
海)、DYY-Ⅲ型水平式电泳槽(北京)、凝胶成像
分析系统(天能GIS)等。
试验所用引物 S60购自上海生物工程公司,
Taq酶、dNTP、bufer缓冲液、琼脂糖等购自广州
宝泰克公司。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取与检测
用改良的 CTAB法(Cetyltrimethylammoniurm
Bromide)[6]提取基因组DNA,步骤如下:①称取沙棘
叶片约150mg,立即置于无菌离心管中,加入液氮
充分研磨成粉后,加入 700mLDNA提取缓冲液,
充分混匀,于65℃水浴中加热1h;②加入700mL
的氯仿/异戊醇(24:1)颠倒混匀,静置 10min,于
12000r·min-1、4℃条件下离心 10min;③取上清
液于另一离心管中,加入等体积的氯仿/异戊醇
(24:1),重复上述步骤②1次;④取上清液,加入约
2/3体积的异丙醇,颠倒混匀,静置15min,于12000
r·min-1、4℃条件下离心10min;⑤弃上清,在面巾
纸上控干;⑥将沉淀用 700mL、75%的酒精洗
2次,冰乙醇洗1次,室温凉干;⑦将沉淀溶于20
!LTE(Tris-EDTA)水或重蒸水中,置于-20℃保存。
第39卷 第2期 东 北 农 业 大 学 学 报 39(2):171~175
2008年 2月 JournalofNortheastAgriculturalUniversity Feb.2008
文章编号 1005-9369(2008)02-0171-05
将 DNA样品稀释不同的倍数后在 BEACK-
MANDU-7紫外分光光度仪上测定波长为260,280
nm的OD值,A260/A280于1.8左右为较纯,按公式:
DNA的产量(ng·!L-1)=OD260nm×50×稀释倍数,计
算 DNA的产量。同时,在 0.8%的琼脂糖凝胶(EB
染色)上电泳检测DNA的数量和质量。
1.2.2 RAPD反应体系的优化
对影响沙棘 RAPD反应结果的主要因素:模
板DNA浓度、TaqDNA聚合酶浓度、dNTP浓度、
Mg2+浓度、引物浓度等进行比较试验。RAPD反应
参照体系总体积为25!L,以大果沙棘品种楚伊基
因组 DNA为模板,以 S60为引物,在调整反应体
系时,下一个比较因素以前一个优化结果为准,
10×bufer用量2.5!L,调整超纯水量,保持25!L
反应总体积不变。
设计6个模板DNA浓度5、10、20、30、40、50ng;
6个浓度的引物 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0!L
(原液浓度为 5pmol·(3!L)-1);6个 TaqDNA聚
合酶浓度 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6!L(1!L=
5U);4个浓度的dNTPs0.4、0.6、0.8、1.0!L(原
液浓度为 2.0mmol·L-1)。其中 dNTPs和 Mg2+浓度
做正交设计。通过比较实验确定最终的反应体系。
dNTPs和Mg2+浓度正交设计见表1。
1.2.3 PCR扩增程序
PCR反应在 PE-9600型 PCR扩增仪(美国
PerlinElmer公司)上进行。反应程序为95℃(预变
性)7min;94℃(变性)1min;41℃(复性)1min;
72℃(延伸)2min;40个循环;72℃(延伸)10
min;4℃(保温)。
PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭
0.5!g·mL-1)与 1×TAE(TrisElectrophoresisBufer)
缓冲液中,以100V的电压电泳 2h,在紫外灯下
观察并照相,照相使用凝胶成像系统。
2 结果与分析
2.1 模板DNA的质量分析
模板 DNA是研究和检测的对象,高质量的模
板 DNA是 RAPD成功的保证,其浓度和纯度的高
低都直接影响 PCR产物数量和质量。本试验采用
CTAB法提取的总 DNA经凝胶电泳检测无明显的
拖尾现象,并且检验其OD值均在 1.7左右,这说
明所提 DNA具有良好的完整性且纯度较高,无降
解现象,可适用于RAPD分析。
2.2 RAPD反应体系的优化
2.2.1 模板DNA对RAPD扩增的影响
为了探索出适应大果沙棘 RAPD分析的模板
DNA浓度,设计了以下浓度梯度:5、10、20、30、40、
50ng。结果表明模板 DNA用量在 5~50ng的范围
内均能扩增出条带,扩增的主要条带没有差异,证
明模板DNA浓度不同对扩增效果无明显影响,说明
模板浓度在一定的范围内不会影响RAPD结果,但
扩增的强度略有不同,DNA浓度在30ng时,条带
更加清晰(见图1)。最后选取的适应大果沙棘RAPD
分析的最佳模板DNA用量为30ng。
表 1 Mg2+与dNTPs浓度正交试验组合
Table1 OrthogonalexperimentdesignofMg2+and
dNTPsconcentrations
编号
No.
dNTPs Mg2+
编号
No.
dNTPs Mg2+
1 0.4 1.5 9 0.8 1.5
2 0.4 2.0 10 0.8 2.0
3 0.4 2.5 11 0.8 2.5
4 0.4 3.0 12 0.8 3.0
5 0.6 1.5 13 1.0 1.5
6 0.6 2.0 14 1.0 2.0
7 0.6 2.5 15 1.0 2.5
8 0.6 3.0 16 1.0 3.0
(!L)
·172· 东 北 农 业 大 学 学 报 第39卷
2.2.2 引物浓度对RAPD扩增的影响
随机引物是 RAPD反应中的起始点,只有同
模板DNA稳定结合的引物,才能扩增出稳定产物。
引物浓度低时,与模板碰撞机会减少,结合概率降
低,扩增受到影响;引物浓度过高时,引起错配和
非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体或多
聚体的机会,以加入适量为好。通常,引物用量为
2.0~3.5μL(原液浓度为 5pmol·(3μL-1))为适宜。
为此,设计了 6个浓度梯度 1.5、2.0、2.5、3.0、
3.5、4.0μL。经筛选最佳单引物用量为 3.0μL(见
图2)。
2.2.3 TaqDNA聚合酶对RAPD扩增的影响
在反应体系中,TaqDNA聚合酶一般用量为
1.0~2.0U,浓度过高,易造成非特异性扩增,浓
度过低则导致效率降低,延伸不完全。本文分别研
究了0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0U的6个Taq聚
合酶梯度对 RAPD的影响。发现 TaqDNA聚合酶
用量在 0.5~1.5U时扩增结果一致,2.0U时扩增
明显加强,带型丰富,但出现弥散现象,不易辨
别。从实验效果和实验成本上考虑,TaqDNA聚
合酶最佳浓度为1.0U(见图3)。
2.2.4 dNTPs和Mg2+浓度对RAPD扩增的影响
dNTPs作为RAPD反应的原料,其量的多少直
接影响产物的多少。浓度过高,与Taq酶竞争,结
合了Mg2+,浓度过低会降低产量,不利于实验准确
性。Mg2+是 TaqDNA聚合酶活性所必需的,对反
应有显著影响。浓度过高,会抑制该酶的活性,出
现非特异性扩增,浓度过低,对Taq聚合酶的活化
作用不够,使酶的活力降低。本试验将 dNTPs浓
度和Mg2+浓度做了正交设计,结果表明,当dNTPs
用量为1.0μL(原液浓度2.0mmol·L-1), Mg2+用量
为 2.0μL(原液浓度 25mmol·L-1)时,所获得的扩
增结果最好,条带多且清楚(见图4)。
3 讨 论
RAPD可用于任何没有分子生物学研究基础的
物种,而且检测灵敏、方便、多态性强,并可以检
测出 RFLP标记不能检测的重复顺序区,可填补
RFLP图谱的空缺,适用于种质资源鉴定和分类、
遗传多样性分析及遗传图谱的快速构建等研究。但
刘雨娜等:沙棘属植物RAPD最佳反应体系的建立第2期 ·173·
是RAPD标记为显性标记,不能有效鉴别杂合子,
易受反应条件的影响,稳定性较差。解决的办法是
尽量使试验的反应条件趋于一致,以克服 RAPD
标记的缺点[7]。由于RAPD的反应体系中存在许多
成分,包括模板 DNA、随机引物、Taq聚合酶、
Mg2+、dNTPs及反应缓冲液等,另外反应的条件也
很复杂,故影响结果的因素很多,又没有统一标
准,所以RAPD的重复性并不在于些技术的本身,
而是由于这些影响因素没有一个统一标准[8]。
一般来说,RAPD对模板 DNA的质量要求不
是特别高,但是高质量的 DNA会提高扩增产物的
产量和质量。在提取 DNA的样品中的去污剂
CTAB及蛋白质沉淀剂如氯仿、乙醇或异丙醇等小
分子物质未被除尽直接影响Taq聚合酶活性而影响
扩增。模板 DNA浓度的轻微变化不影响扩增产物
的带型,但扩增的强度略有不同,总体来说 DNA
浓度可允许在一定范围内变动[9]。本文发现大果沙
棘的模板 DNA用量在 5~50ng的范围内均能获得
扩增条带,用量在30ng时为最佳。
引物浓度的变化会对 RAPD带的数量和强弱
产生影响。如果引物浓度过大易造成非特异扩增,
不稳定弱带增加;如果引物浓度过低,则造成扩增
产物的强带变弱或消失,弱带消失,而不能反映扩
增的真实情况。随机引物与模板 DNA的量之间有
一种协同作用,当随机引物量变化时,模板 DNA
的量可能会成为制约因素。当随机引物达到一定的
浓度时,出现随机引物争夺模板 DNA的情况,这
时只有部分位点可以和随机引物结合,优先结合的
是那些产生强带的位点,会导致弱带的消失,因此
必须选择合适的引物浓度[10]。本试验设定了6个引
物浓度,引物用量在 1.5μL和 2.0μL时,扩增条
带少,并且强度变弱,当引物用量达到 4.0μL时
出现非特异性条带。因此选择的最佳引物用量是
3.0μL。
在 RAPD反应中 Taq聚合酶的用量受到反应
体积、酶活性、酶的耐热性等因素制约,因些需要
适合的Taq聚合酶量。使用高浓度的Taq聚合酶不
仅会造成经济的浪费,而且容易产生非特异扩增产
物的积累,从而影响试验结果;浓度过低则导致效
率降低,延伸不完全[11],因此进行优化是必要的。
经过优化试验,确定了反应的最佳Taq聚合酶的用
量为 1.0U。另外,还发现购买不同批次的 Taq酶
活性有差异,导致扩增结果不一,因此建议购买大
剂量Taq酶,然后分装,以获得较好的重复效果。
反应混合物中的离子强度,尤其是 Mg2+的浓
度,对RAPD反应的特异性和扩增效率均有影响,
Mg2+过多,易鳌合 dNTPs,由于 dNTPs消耗殆尽,
无延伸反应,扩增产物单链化。Mg2+过少,又造成
dNTPs鳌合Mg2+,TaqDNA聚合酶的作用效率降低
而使扩增产物减少导致扩增反应失效。同样Mg2+也
直接影响随机引物与模板 DNA的结合,从而导致
RAPD结果改变。而dNTPs是合成DNA的原料和能
量,当dNTPs不足时扩增产物减少,但浓度过高时,
会增加碱基的错配率。并且dNTPs同TaqDNA聚合
酶竞争 Mg2+,也影响 TaqDNA聚合酶的活性。因
此,把Mg2+和dNTPs进行优化组合设计是必要的。
[ 参 考 文 献 ]
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·174· 东 北 农 业 大 学 学 报 第39卷
Foundationsofthemostsuitablereactionvolumeof
sea-buckthorngenericplants
LIUYuna,YUZeyuan,LIXingguo
(ColegeofHorticulture,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China)
Abstract:Thebestsystemofsea-buckthorngenericplantsRAPDanalysiswaspromotedbythesea-buck-
thornvarietyChuyiasthetestedmaterial.Theresultsshowedthatthemostsuitablereactionvolumeofsea-
buckthorngenericplantswas25μLtotalreactionvolulmewhichcontrainedDNAtemplate30ng,TaqDNA1.0U,
dNTPs1.0μL,Mg2+2.0μL,10baserandomprimers3.0μL,10×bufer2.5μL,andusedwatertosupplythe
deficiencyofvolume.Underthemostsuitablecondition,thestabilityandrepetitionofRAPDanalysisweregood.
Keywords:sea-buckthorn;RAPD;volumepromotion
刘雨娜等:沙棘属植物RAPD最佳反应体系的建立第2期 ·175·