全 文 ：2 0 1 1.2 湖 北 林 业 科 技
分子标记技术在我国杜鹃属植物中的应用＊
梅济发(1) 秦建明(2) 陆万明(3)
(1.湖北省麻城市发改局 麻城 4 3 8 3 0 0 ;2.湖北省麻城市林业局 麻城 4 3 8 3 0 0 ;
3 .湖北省长阳土家族自治县都镇湾林业管理站 长阳 4 4 3 5 0 0)
摘 要:分子标记作为新发展起来的 1 种遗传标记形式 ,凭借其可靠有效等优点 ,在植物科学
研究中的应用越来越广泛。笔者对分子标记技术在杜鹃属植物遗传多样性 、亲缘关系和种质
鉴定 、遗传变异测定 、以及指纹图谱构建等方面的应用进展进行了综述 ,同时提出了分子标记
技术在我国杜鹃属植物研究中存在的问题及今后发展方向 。
关键词:分子标记;杜鹃属;应用
Molecular Markers Application on Rhododendron L.inChina
Mei Jif a(1 ) Qin Jianming(2)Lu Wangming(3)
(1.Macheng City Development and Reform Bureau in Hubei Province Macheng 438300;
2.Macheng City Forestr y Bureau in Hubei Province Macheng 4383003.Changyang Tujia
Nationlity Autonomous County Douzhenwan Forest Station in Hubei Province Changyang 443500)
Abstract:DNA molecular marker is a molecular marke r form which is incre asingly and widely used in the
plants resear ch with re liability and validity.the cur rent progr ess tha t molecular markers were applied in to the
gene tic dive rsity , genetic relationship , ge rmplasm identification , genetic var ia tion testing and DNA f inger
printing r ese arch was presented , then existing questions and development dir ection of molecular marker ap-
plic ation in R hododendron in the futur e were also discussed by author s.
Key words:Molecular marker;Rhododendron ;Applica tion
杜鹃花属植物 Rhododendron 属于杜鹃花科
Ericaceae 杜鹃花亚科 Rhododendroideae ,杜鹃或
杜鹃花是杜鹃属植物的统称 。杜鹃是我国传统名
花 ,素有“花中西施”之美誉 ,在欧美至今流传着一
句名言“没有中国的杜鹃花 ,就没有西方的园林” 。
杜鹃以灌木种类为主 ,也不乏高大乔木种类 ,具有
树型美观 ,花朵大而艳丽 ,花期较长等特点 ,不仅可
供观赏 ,还可以提取芳香油 、食用及提制烤胶等 ,木
材可作为雕刻材料 ,具有很高的经济价值。中国约
542种 ,占世界杜鹃花种类的一半以上 ,主要分布
在长江以南地区[ 1] 。
我国是杜鹃花资源的重要原产地 ,但其资源研
究和整体开发利用水平低 ,远落后于其他国家 。此
前国内关于杜鹃属植物的研究主要在 2个方向 ,其
一是基础性的杜鹃属植物分类学研究 ,其二是与应
用密切相关的组培育种驯化及其生理生化学研究 。
近年来 ,随着分子生物学和生物技术的迅速发展 ,
分子标记技术已成为杜鹃属植物研究的 1项新技
术。此前的形态标记 、细胞学标记 、生化标记都是
以基因表达的结果(表现型)为基础 ,是对基因的间
接反映;而 DNA 分子标记则能反映生物个体或种
群间基因级中某种差异特征的 DNA 片段 ,它能够
直接反映基因组 DNA 间的差异是以基本遗传物
质脱氧核糖核酸(DNA)的分子差异为基础的 1种
标记技术[ 2] ,不受环境影响;数量多 ,遍及整个基因
组;多态性状无必然的连锁;表现为中性[ 3] ,不影响
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＊ 收稿日期:2010-10-25
分子标记技术在我国杜鹃属植物中的应用 总第 1 6 8 期
目标性状的表达;许多标记表现为共显性。目前
DNA 分子标记技术已有数十种 ,广泛应用于作物
遗传育种 、基因组作图 、基因定位 、植物亲缘关系鉴
别 、基因库构建 、基因克隆等方面 。笔者综述了分
子标记技术在我国杜鹃属植物中的应用现状 ,为进
一步研究杜鹃属植物提供参考 。
遗传多样性分析
遗传多样性是生物所携带的遗传信息总和 ,是
物种适应自然和发生进化的遗传基础 ,一个种群遗
传多样性越高或越丰富 ,适应环境的能力就越强 ,
越容易扩展其分布范围和开拓新的环境 ,多样性的
测定对了解种源的适应性 、物种起源及基因资源
分布等具有重要意义 。分子标记是检测种质资源
遗传多样性的有效工具 ,是对物种的基因组多态性
分析 ,从而避免了环境和分析位点限制 ,分子标记
产物的多态性反映了被测材料的多样性 ,为种质资
源的研究提供了充分的数据。
目前国内外研究工作者主要利用 RAPD 和
ISS R 2种标记技术对杜鹃属种质资源进行遗传多
样性研究 。顾奇萍等[ 4] 最早通过筛选引物并设定
影响云锦杜鹃 Rh.f ortunei ISSR反应的诸因子的
不同浓度 ,检测 ISSR不同反应体系的扩增效果 ,
建立起云锦杜鹃 ISSR稳定可靠的反应体系。此
后金泽新等[ 5] 用该体系筛选出 12条有效引物 ,在
5个云锦杜鹃居群中扩增出 170条 DNA 片段 ,其
多态位点百分率为 88.24%,表现出物种水平遗传
多样性很高 ,同时进行 AMOVA 分子变异分析显
示居群水平遗传多样性较低 , 40.03%的变异存在
于居群间 ,59.97%的变异存在于居群内 ,居群间的
遗传分化明显 。居群间的基因流较低 ,为0.882 4 ,
故认为居群隔离 、自交衰退可能是导致云锦杜鹃居
群间遗传分化的主要原因。杨志勇[ 6] 则分别运用
ISS R和 RA PD分子标记 ,探讨 4个不同海拔的牛
皮杜鹃 Rh.chry santhum 遗传多样性和自然环境
与种群遗传多样性之间的关系 ,共获得 152条清晰
的谱带 ,其中多态性条带 143 个 ,多态带百分率为
96.04%。通过 Pearson的相关性分析 ,确定居群
遗传多样性高低受地理 、地形和气候等多方面因素
的影响。周兰英[ 7] 对 43种 49 个杜鹃样本 ,用 24
条随机引物扩增 , 结果发现多态位点百分率高达
98.03%,揭示了 49个杜鹃样品间极为丰富的遗传
多样性。赵芯等人[ 8] 用 ISSR标记对浙江省大明
山 4个麂角杜鹃 Rh.latoucheae 种群进行基因组
DNA 多态性研究 ,总多态位点百分率为 88.07%,
与云锦杜鹃不同的是麂角杜鹃种群间的基因交流
频率很高 ,Shannon信息指数和由 Gst估算的种群
间基因流(Nm)指标均显示 ,麂角杜鹃种群内 、种
群间均产生遗传变异 ,但主要遗传变异存在于种群
内。彭婵等人[ 9] 运用 ISSR标记分析了湖北麻城
我国最大古杜鹃原始群落遗传多样性 ,结果显示多
态位点百分率 P 为 79.12%,具有较高的遗传多样
性水平 ,表明它能较好地适应当前环境 ,但该古群
落野生杜鹃种质资源的保护仍不容忽视。
亲缘关系和种质资源鉴定
种质亲缘关系是现在育种和生物遗传技术研究
的物质基础 ,研究种质资源为探讨作物的起源 、进
化 、分类提供科学依据;了解资源遗传变异信息及亲
缘关系的疏远 ,有利于种质资源的收集 、整理 ,并对
所收集资源中可能存在的遗传变异进行评估 ,达到
有目的地选配亲本 ,培育出优良品种 ,有效利用和保
护遗传资源。杜鹃属植物中存在许多天然杂种 ,有
些园艺品种是经实生选种或采用混合花粉杂交选育
而成的 ,其品种类型丰富 、亲缘关系复杂 ,传统的分
类方法主要是依靠形态特征 、生理性状 、杂交关系 、
染色体组成及地理分布等特性进行研究和论证 ,存
在许多争议。采用分子标记 ,从 DNA水平上分析杜
鹃属各品种 、亚种间的亲缘关系 ,为确定物种间的亲
源关系和进化地位提供有力的证据。
高连明[ 10]基于 ITs 序列分析了映山红亚属的
组间关系 ,支持将映山红亚属划分为轮生叶组和映
山红组 2个组 ,但 ITs 应用于杜鹃花亚组内分类时
明显表现出信息位点不高的缺点 ,赵喜华[ 11] 等用
RAPD对 11种杜鹃花进行了分类学的初步研究 ,结
论与形态学分类相一致。继而周兰英[ 7] 对 43 种杜
鹃属植物其亲缘关系聚类分析结果也与以形态区分
的3个亚属完全吻合。证明RAPD技术是杜鹃属植
物亲缘关系鉴定的有效方法。刘旭颖等人[ 12] 也利
用 ISSR标记对辽宁 9种耐寒杜鹃花进行了基因组
DNA多态性分析。从 100个随机引物筛选出 13个
多态性好的引物进行 PCR扩增 ,扩增 DNA 片段数
据用 UPGMA 聚类法构建系统发育树。将 9 种杜
鹃花明显聚为 3大类:照白杜鹃 Rh.micranthum 、牛
皮杜鹃聚为一类;迎红杜鹃 Rh.mucronulatum 、缘毛
迎红杜鹃 Rh.mucronulatum f.ciliatum、兴安杜鹃
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Rh.dauricum 聚为一类;黄杨杜鹃 Rh.yedoehse
huang yang 、淀川杜 鹃 Rh.yedoehse、红枫杜 鹃
Rh.hong feng和大字杜鹃 Rh.schlippenbachii 聚为
一类 , 其中第 2类与形态学分类结果一致。
遗传变异检测
植物的遗传变异不仅仅表现在外部形态 、蛋白
质分子结构等方面 ,过去进行品种分类和鉴定主要
采用比较植物学特征并结合细胞学 、酶学等方法 ,但
都有其局限性 ,对关系较近的材料不能准确区分 ,而
借助分子标记技术可以在大范围内对杜鹃属植物的
遗传物质进行较全面的比较 ,从而提高杜鹃属植物
分类的准确性和可靠性。
到目前为止 ,国内外对于杜鹃属植物的系统发
育研究大部分基于 ITS的序列分析。 ITS是核糖体
DNA(nrDNA)的内转录间隔区 , ITS序列可以提供
丰富的信息位点 ,目前被广泛应用于植物进化与系
统分析 ,符合较低阶元系统分析的要求。刘仁林[ 13]
对上犹杜鹃 Rh.hangyounicum 和毛果杜鹃原变种
Rh.seniavinii以及相关类群进行 ITS 分子标记实验
分析 ,上犹杜鹃没与毛果杜鹃原变种聚合在一起 ,而
与乳源杜鹃 Rh.rhuyuenens聚合为一支 。说明上犹
杜鹃的 ITS 基因序列与毛果杜鹃原变种有明显差
异 ,其差异是建立在基因序列差异的分子基础之上。
根据密码子偏向性指数 CB1分析 ,上犹杜鹃的 CBI
指数大于原变种毛果杜鹃的 CBI 指数 ,而且是 CBI
指数最小的一个类群 ,说明上犹杜鹃的进化速率较
快 ,基因表达速度较慢 ,这一事实正好反映了上犹杜
鹃处于“变种”等级阶段的特点 ,因此支持把上犹杜
鹃作为种以下等级“变种”处理。
指纹图谱构建
指纹图谱是鉴定品种 、品系和无性系(包括杂交
亲本和自交系)的有利工具。20世纪 90年代以前 ,
指纹图谱构建主要是同工酶方法 ,而后期发展起来
的DNA指纹图谱(DNA finger printing)技术具有多
态性丰富 、分辨率高 、稳定性强等优点 ,目前已成为
种质资源收集和种质鉴定中一个非常重要的技术手
段 ,可以用来对种质资源进行评估和品种真实性和
纯度鉴定。由于杜鹃属植物在我国分布广 ,在长期
的自然演化和种间杂交过程中形成了生态适应性各
异 、数量庞大的变异新种或新无性系。谭萍[ 14] 等人
应用 RAPD研究了贵州 7个常见杜鹃花的种质 ,从
60个随机引物中挑选反应结果稳定 、重复性好的 10
个有效引物(A16 、H15 、A3 、A20 、H13 、Y3 、Y4、Y5 、
A8 、H12)进行研究 。10个随机引物在 7个供试材
料上都获得了基因组 DNA指纹图谱 ,并对各个品种
进行聚类分析和比较 ,7个杜鹃花基因型明显地聚
成 A 、 B 2 大 类 , A 类 包 括:锈 叶 杜 鹃
Rh.siderophy llum 、红花露珠杜鹃 Rh.irroratum 和
露珠杜鹃 Rh.irroratum3个基因型;B类包括:大白
杜鹃 Rh.decorum 、杜鹃 Rh. simsii 、红马缨杜鹃
Rh.delavay i和桃叶杜鹃 Rh.annae 4个基因型 。
5 展望
由上所述可见:目前我国的杜鹃属植物分子遗传
基础研究刚刚起步 ,基础薄弱 ,用于杜鹃属遗传与种
质资源研究中的分子标记主要是 ITS 和 RAPD 、ISSR
标记 ,与其它植物相比 ,所涉及的分子标记类型还远
远不够 ,无论在研究的广度还是深度上都有较大的差
距。今后我国杜鹃属植物分子标记研究应该围绕以
下重点进行:与常规技术结合的方法 ,构建起源于我
国或具有我国特色的杜鹃属核心种质资源 ,发掘核心
资源的重要园艺性状及新基因 ,明确其利用价值;开
展多种分子标记的研究 ,筛选出多态性高的引物和探
针 ,实现自动化 ,降低成本 ,从而加快杜鹃种质资源研
究进程;发展新型分子标记技术 ,构建相应的分子标
记连锁图谱 ,利用不同特性(种类)的分子标记进行补
充 ,减小遗传图谱中的空隙;实现多年多点地调查重
要经济性状 ,获得大量基因型与表型关联数据;开发
利用这些数据进行分子设计育种的计算机软件 ,在此
基础上 ,初步开展分子设计育种。
相信随着分子标记技术在杜鹃属植物种质资源
上的广泛应用 ,特别是分子标记技术与比较基因组
学 、功能基因组学 、蛋白组学科等学科相结合 ,将推动
我国杜鹃属植物种质资源的遗传基础 、起源与进化 、
品种分类、鉴定和分子育种等基础科学的发展 ,从而
更好地指导实践工作 ,更好地开发、利用和保护我国
的杜鹃资源。
参考文献
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(下转第 46页)
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湖北省野生牡丹种质资源调查 总第 1 6 8 期
发展进度缓慢。 ②在长江流域的城市绿化还没有
认识到湖北省保康野生牡丹的耐湿热性的特性 ,以
致于在园林设计 、城市绿化中基本不采用牡丹 。三
是在由资源优势向商品优势转化的过程中 ,还有许
多基础研究去做 ,需要更多的科研机构的协作 。
保护 、开发湖北省保康野生牡丹应
采取的主要措施
针对湖北省野生牡丹现存的状况和濒临灭绝
的原因 ,在保护上应采取就地保护和迁地保护相结
合 ,并积极扩大野外种群数量 ,做好牡丹野外生态
体系的恢复。在保护与开发上 ,积极扶持一些有条
件的专业户 ,面向市场 ,大力培育市场适销对路的
牡丹品种 ,首先应在城市中大力培植野生牡丹 ,丰
富城市的园林绿化树种 ,扮靓我们的城市。
4.1 保护保康野生牡丹的主要措施
(1)就地保护措施。省 、市 、县三级政府落实湖
北省野生牡丹分布的自然保护区管理人员经费 ,让
保护区的工作正常开展起来 ,加强区内自然分布的
野生牡丹的调查和监测 ,保证现有的野生牡丹资源
不至于灭绝。
(2)迁地保护措施。利用保康县后坪镇九池村
三组的野生牡丹种质资源基地现有的技术优势和
区位优势 ,由政府扶持建立保康野生牡丹基因圃 ,
集中全县的野生原种于其中 ,以供人工繁育和种科
研机构研究使用 ,达到保存和繁衍保康野生牡丹原
种之目的 。同时 ,安排城市园林绿化部门在全省各
个城市的园林绿化中率先使用野生牡丹子代杂交
品种 ,扩大湖北省野生牡丹的迁地保护范围 。
(3)恢复野生牡丹野外生态体系 ,由政府每年投
入一定数额的资金 ,利用种质资源基地人工繁育的
野生牡丹苗木 ,在保护区内寻找适合野生牡丹生长
并具备自然更新能力的地块栽植 ,逐步扩大其野外
种群数量 ,最终达到保康野生牡丹有效保护的目的。
4.2 开发湖北省野生牡丹应采取的主要措施
(1)省 、市 、县三级政府要在资金 、政策上大力扶
持野生牡丹种质资源基地 ,使其快速成长为保康野生
牡丹开发利用的龙头企业 ,为兴县富民作出贡献。
(2)联系对口有实力的科研机构加大对湖北省
野生牡丹种质资源基地的研发力度 ,使其尽早出成
果 ,出高水平的成果 。
(3)鼓励将繁育的子代野生牡丹在城市绿化中
大量应用 ,为湖北省野生牡丹种质资源基地繁育生
产的苗木打开市场销路 。
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(本文编校:唐 岚)
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