全 文 ：第 25 卷 第 3期
2003 年 5 月
北 京 林 业 大 学 学 报
JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY
Vol.25 , No.3
May , 2003
2002--12-24收稿
http: www .wanfangdata.com.cn
＊四川省杰出青年基金(462)和农业部发展棉花生产专项基金(200012)资助项目.
第一作者:蔡应繁 ,男 , 1964年生 ,博士生.主要研究方向:植物分子生物学与遗传育种. 电话:028-85417281 Emai l:chenfang@scu.edu.cn
地址:610064成都四川大学生命科学学院.
责任作者:陈放 ,男 , 1960年生,教授 ,博士生导师.主要研究方向:植物发育生物学及生物技术.电话:同上 Email:同上 地址:同上.
抑制性消减杂交方法克隆棉属突变材料
腺体发育相关的 cDNAs＊
蔡应繁1 ,2) 莫剑川2) 曾 宇1) 任薇薇1) 苗 琛1)
徐 莺1) 王胜华1) 陈 放1)
(1四川大学生命科学学院 2西南交通大学生物工程系)
摘要 该文采用抑制性消减杂交方法(SSH)构建了棉属突变材料“湘棉 18”种子萌发过程中腺体发育形成前后的
两个不同时期的 SSH差减文库.通过差示筛选及反式 Northern 检测 ,获得了色素腺体形成时期特异表达或优势表
达的 cDNA片段.结果表明 ,这些 cDNA所涉及的基因 , 多数是棉属中新发现的 ,它们与发育调控 、细胞凋亡 、蛋白质
合成等密切相关.
关键词 抑制性消减杂交(SSH),色素腺体 ,发育 , 克隆 ,棉属 , 差示筛选 ,反式 Northern
中图分类号 Q754
Cai Yingfan;Mo Jianchuan;Zeng Yu;Ren Weiwei ;Miao Chen;Xu Ying;Wang Shenghua;Chen Fang.
Cloning of cDNAs associated with the development of pigment gland of Gossypium by suppression sub-
tractive hybridization.Journal of Beijing Forestry University(2003)25(3)6-10[ Ch ,15 ref.] Life College of
Sichuan University , Chengdu ,610064 ,P.R.China.
Two differentially expressed cDNA libraries of forward and reverse subtraction were constructed using sup-
pression subtractive hybridization(SSH)to isolate the gland-related genes differentially expressed in the devel-
opment of special pigment gland of Gossypium in the process of germinating of the seeds of Xiangmian 18.The
authors obtained some cDNA fragments differentially expressed in the time of development of the gland through
screening the libraries and virtual northern analysis.The results revealed that the differentially expressed cDNA
fragments were associated with regulation and control factors , apoptosis , protein synthesis etc.
Key words suppression subtractive hybridization , pigment gland , development , cloning , Gossypium , differ-
entially screening , virtual northern analysis
锦葵科(Malvaceae)棉属(Gossypium)植物不仅产
生高纯度的自然纤维 ,而且其种子还含有丰富的蛋
白和油脂.棉属共有 39个种 ,包括二倍体 34个种
和四倍体 5 个种 ,其中野生种 35 个 , 占绝大多数.
由于棉属通常具有储存于色素腺体的对人和单胃动
物有毒的次生代谢产物棉酚 ,致使大量的种子蛋白
和油脂难以利用[ 1 ,2] .这种储存棉酚的色素腺体往
往遍布普通棉全身 ,包括种子 、根 、茎 、叶等.人们多
年来致力于创造无棉酚的特殊材料 ,Michael于 1954
年首次从霍皮棉(G.punctatum)中育成无腺体棉 ,成
为后来无腺体棉(无酚或低酚棉)的主要基因源.然
而棉酚本身又是棉属的重要抗性物质 ,由于无腺体
棉植株全身均无腺体即无酚或低酚 ,其抗病虫性大
大降低 ,鼠害也特别严重[ 2, 3] .人们迫切希望育成一
种植株有腺体 ,而种子无腺体的特殊材料 ,可以结合
无酚棉和有酚棉的优点 , 其植株因具有色素腺体
(有酚), 既可保持对病虫害的抗性 ,又可生产出无
色素腺体 、无棉酚或棉酚含量极低 ,从而可以安全食
用的种子.
张雪林等[ 3] 从四倍体显性无腺体海岛棉(G.
DOI :10.13332/j.1000-1522.2003.03.003
barbadense)与有腺体陆地棉(G.hirsutum)的衍生杂
交后代中发现一突变体 ,育成了种子无腺体 ,而根 、
茎 、叶有腺体的特殊腺体棉“湘棉 18” ,其棉籽棉酚
含量低于国家食品标准[ 3] .目前国内外关于棉属腺
体性状的遗传研究已报道较多[ 2 ～ 4] , 但是有关棉属
色素腺体分子水平上的研究报道极少 ,利用新的分
子生物技术和手段研究其形成与发育对深入了解其
机制具有重要作用.
抑制性消减杂交(SSH)是新近发展起来的不同
于以往的差减克隆技术 ,用于富集和分离两个 mR-
NA群体之间差异表达的基因.该技术于人类及动
物研究中应用较多 ,特别是成功地克隆了系列肿瘤
特异表达基因[ 5] .近年来开始应用于禾本科 、甜菜
等一些重要植物发育 、突变体以及病原菌侵染诱导
表达的特异基因的分离研究[ 6 ～ 10] .本试验中我们采
用抑制性消减杂交方法研究“湘棉 18”特殊腺体发
育形成相关基因 ,从分子水平上探讨其形成机制 ,为
有效调控棉属腺体及棉酚等相关次生代谢途径奠定
基础.
1 材料与方法
1.1 取材及镜检
试验材料“湘棉 18”是从国家杂交棉研究中心
(湖南)引进的具有特殊腺体的棉属突变新材料.取
该种子用 70%乙醇和 15%H2O2 消毒 ,用无菌水浸
涨 ,室温条件下于超净工作台上剥壳后置于放有灭
菌滤纸和适量的无菌水的培养皿中发芽.用解剖显
微镜观察种子发芽和腺体形成过程 ,分别取从消毒
浸种开始至 36 h左右的种子作为 Driver(时期 Ⅰ)和
52 h左右的种子作为 Tester(时期Ⅱ),时期Ⅱ的下胚
轴(已伸长 2 cm 左右)刚开始和即将开始出现小的
红色腺体或少许黑色腺体.用这两个时期的萌发种
子材料分别提取总 RNA .
1.2 RNA的提取和 mRNA的分离 、纯化
总RNA提取按照上海华舜生物工程有限公司
植物 RNA大量提取试剂盒的方法提取总 RNA , mR-
NA按照 QIAGEN 试剂盒 Oligotex 方法从总 RNA中
分离纯化.检测mRNA的浓度 、纯度与完整性 ,用乙
醇法浓缩 Driver 和 Tester 的 mRNA均为 0.5 μg μL.
1.3 试 剂
CLONTECH PCR-SelectTM cDNA Subtraction kit
购自 CLONTECH 公司 , mRNA Purification Kit 购自
QIAGEN 公司 , 杂交后的 PCR反应所需的 Advantage
cDNA Polymerase 购自 CLONTECH 公司 , pMD 18-T
Vector 购自 TaKaRa 公司 , Dig-High Labeling and De-
tection Starter Kit Ⅱ购自 Roche Molecular Biochemicals
公司 , M-MLV 反转录酶 、Taq酶购自TaKaRa 公司.
1.4 抑制性消减杂交与 SSH cDNA 文库的构建(T
A克隆)
cDNA的合成 、Rsa Ⅰ消化 、接头连接 、第一次杂
交 、第二次杂交和两次 PCR反应均按照 CLONTECH
PCR--SelectTM cDNA Subtraction Kit手册进行.将正向
差减杂交和反向差减杂交的 PCR产物分别克隆至
T-Vector pMD 18-T 中 ,保存于 JM109 菌株中 ,建立
正向和反向差异 cDNA文库.
1.5 制备差示筛选探针和杂交差示筛选
(1)差示探针的制备.分别将正向差减杂交产
物 、正向未减产物和反向差减产物 、反向未减产物这
4种 SSH 第 2轮 PCR反应产物 ,用 QIAGENE 公司
QIAquick PCR Purification Kit 纯化后 ,按照 Dig-High
Labeling and Detection Starter kit Ⅱ制备探针和进行标
记效率检测.
(2)差示筛选.挑取 PCR阳性克隆 68个 ,每个
克隆 PCR产物 ,加入相同体积的 0.6 mol NaOH混匀
后 ,取1μL点印于带正电荷的 4张尼龙膜上 ,分别与
4种不同的探针杂交.烤膜 、预杂交 、杂交 、洗膜均
按照 Dig-High Labeling andDetection Starter Kit Ⅱ操作
进行.
(3)反式Northern杂交.取 Diver和Tester总 RNA
各 1μg经反转录后用地高辛进行探针标记 ,取每个
克隆 PCR产物 ,加入相同体积的 0.6 mol NaOH混匀
后 ,取1μL点印于带正电荷的 4张尼龙膜上 ,分别与
Tester和 Driver的 cDNA 探针进行杂交.烤膜 、预杂
交 、杂交 、洗膜均按照上述操作进行.
1.6 cDNA片段测序和 DNA序列分析
将筛选获得的阳性克隆送至上海基康生物技术
有限公司进行测序 ,产生的序列去除载体序列后用
BLASTn和 BLASTx 软件与 GeneBank 中的核酸数据
库及蛋白数据库进行同源对比分析.
2 结果与分析
2.1 棉属腺体发育过程的观察与 RNA提取
用解剖镜观察种子发芽和腺体形成过程 ,发现
“湘棉 18”在种子萌发过程中的前 2 d没有新腺体形
成 ,直到发芽 50 h左右(从消毒浸种开始)子叶初步
展开时才在下胚轴靠近子叶处开始出现红色的小腺
体 ,随着腺体数目的慢慢增加 ,大约再过 4 ～ 6 h ,红
色小腺体才逐渐变大 、变黑 ,此后腺体就沿着胚轴一
直向上生长 ,最终遍布植株全身.因此本试验分别
以从消毒浸种开始至 36 h 和 52 h的种子的 mRNA
作为 Driver和 Tester.
2.2 差减 cDNA 文库的构建及差示筛选
运用 SSH 技术 ,分别利用时期 Ⅰ的萌发种子为
7第 3期 蔡应繁等:抑制性消减杂交方法克隆棉属突变材料腺体发育相关的 cDNAs
Driver ,时期 Ⅱ的萌发种子为 Tester ,以及时期 Ⅱ的萌
发种子为Driver , 时期 Ⅰ的萌发种子为 Tester ,进行
正向和反向两次差减杂交 ,建立了两个差异 cDNA
文库(见图 1).差减效率检测结果显示 ,这次差减效
果很好(见图 2).采用正向和反向杂交后的 cDNA
群体标记探针 ,与随机挑取的阳性克隆进行杂交.
杂交结果显示 ,不同的克隆与正向和反向差减库杂
交的 ,出现了不同杂交信号 ,有的克隆的杂交信号很
强 ,有的则很弱(见图 3).结果表明 ,差减杂交有效
地富集了差异表达基因 ,同时有效地减弱了相同的
基因.选取仅与正向差减 cDNA探针(F)杂交的克
隆 ,或与 F 杂交信号明显强于反向差减 cDNA 探针
(R)的克隆进行测序分析.根据陆地棉 18s rRNA基
因设计引物 ,以未减产物(1 ～ 4)和正向差减产物(5
～ 8)为模板进行扩增.
1时期Ⅰ未减产物; 2 反向减法产物; 3 时期Ⅱ未减产物;
4 正向减法产物; M DNA Marker DL2000 , TaKaRa
图 1 时期Ⅰ和时期Ⅱ抑制性消减杂交后经两轮 PCR的结果
FIGURE 1 The results of the secondary PCR products of SSH
1 , 5 17个循环; 2 , 6 22个循环; 3 ,7 27个循环;
4 ,8 32个循环; M DNA Marker , DL2000 , TaKaRa
图 2 差减效率分析
FIGURE 2 Analysis of subtraction efficiency by PCR
2.3 反式 Northern杂交分析
将不同的克隆片段分别与 Tester 和 Driver 的反
转录 cDNA 探针杂交 , 结果表明 ,有的与 Tester 的
cDNA显示杂交信号 ,有的与 Driver cDNA 显示杂交
信号 ,但是很多克隆未显示任何信号 ,说明这些可能
来于低丰度的基因(见图 4).反式 Northern 杂交进
一步证实了SSH杂交的有效性.
3a 克隆 cDNA与正向差减产物探针杂交
3b克隆 cDNA与反向差减产物探针杂交
图 3 通过点杂交进行差示筛选(部分结果)
FIGURE 3 Differentially screening of positive clones
of the subtracted library.
2.4 cDNA克隆测序与序列分析
将筛选的 24个 cDNA 阳性克隆进行单向测序 ,
与GenBank中核酸和蛋白序列进行同源比较.结果
显示 ,24个克隆有 4 个克隆为重复检出的片段 ,可
见差减库中 80 %以上的克隆代表着不同的基因 ,表
明 cDNA差减群体内很少重复拷贝 ,不同基因间丰
度的差异得到了很好的均衡.表 1中列出了克隆的
部分 cDNA片段.试验筛选获得的 cDNA中 ,19个是
棉属中新发现的 ,6个是未知蛋白 ,其中 1个(clone-
12)在蛋白数据库中未找到任何同源序列;另有 4个
虽有同源序列 ,但是其同源区段太短仍难以确定其
功能.对于从 GenBank 中查不到任何对应的序列
cDNA ,可能是发现了全新基因 ,也可能是该克隆序
列位于基因变异丰富的 3′端而无法查到与其他物
种基因的同源性(见表 1).
通过比较分析 ,有 3个克隆分别为转录因子亮
氨酸拉链同源盒蛋白和推测的锌指蛋白.克隆 20
的 65个氨基酸的与拟南芥的推测锌指蛋白的一致
性达到 52 %(GenBank accession AY162374),其结构
域是较独特的锌指蛋白 ,它在棉属中属首次报道.克
隆 17与陆地棉纤维毛状体(Trichomes)发育中的同
8 北 京 林 业 大 学 学 报 第 25卷
源盒蛋白 161 个氨基酸读码框内的一致性达到
90%,同时通过其翻译蛋白最大阅读框与 Genbank
的保守域数据库比较 ,发现该序列与大麻腺体毛状
物(Glandular Trichomes)的分泌蛋白的结构域具有相
似性.这些转录因子很可能在棉属腺体发育形成过
程中具有重要调控作用.
4a 克隆 cDNA与Tester cDNA探针杂交 4b克隆 cDNA 与 Driver cDNA 杂交
图 4 反式 Northern杂交结果
FIGURE 4 Virtual northern blot analysis
表 1 部分 cDNA 序列分析和同源性比较结果
TABLE 1 Part of cDNA sequences differentially expressed and their identities
克隆编号及
插入片段大小 同源性比较结果
clone--17 531 bp 与核酸数据库中编号 AF5309.1长度为 430 bp的陆地棉同源盒蛋白GhHOX1序列同源性达到 99%与蛋白数据库中编号 AF530913的陆地棉纤维发育中的同源盒蛋白 161个氨基酸读码框内一致性达到 90%
clone--20 239 bp
与核酸数据库中编号 NM 112438 ,长度为 72 bp拟南芥的基因组序列同源性达到 92%
与蛋白数据库中编号NM 112438长度为 65个氨基酸的拟南芥的推测锌指蛋白的一致性达到 52%,该序列在棉属中属
首次报道
clone--37 266 bp
与核酸数据库中编号 AY063891.1 ,长度为 20 bp拟南芥电压依赖阴离子通道外膜蛋白一致性达 96%
与蛋白数据库中编号 NM 126150长度为 88个氨基酸的拟南芥的外膜蛋白(孔蛋白)的一致性达到 57%, 该序列在棉属
中属首次报道
clone--12 231 bp 与核酸数据库中编号 ATT8M16长度为 60 bp的拟南芥 DNA 基因组序列一致性达到 100%在蛋白数据库中未找到任何同源序列.该序列在棉属中属首次报道
clone--38 202 bp
与核酸数据库中编号 AL355392长度为 20 bp的人类位于 20号染色体 DNA 序列一致性达到 100%,该基因包含类似于家
鼠颌下腺腺体蛋白的新蛋白基因
与蛋白数据库中编号 XM 109892长度为 27个氨基酸的小家鼠的与胞吞有关的蛋白 epsins一致性达到 51%,该序列在棉
属中属首次报道
clone--10 500 bp 与核酸数据库中编号 AP005138.2长度为 24 bp的智人基因组 DNA序列一致性达到 95%与蛋白数据库中编号 NM 112562长度为 78个氨基酸的拟南芥未知蛋白一致性达到 50%,该序列在棉属中属首次报道
克隆 37与蛋白数据库中长度为 88个氨基酸的
拟南芥的外膜蛋白(孔蛋白)的同源性达到 57%,这
种外膜蛋白 ,如孔蛋白(porin),即电压依赖性阴离子
通道(voltage-dependent anion channel),与线粒体通透
性转变(mitochondrial permeability transition , MPT)引
起细胞死亡(包括坏死和凋亡)有关.该基因可能与
腺体形成过程中色素腺体细胞解体以便形成能够储
藏棉酚的腔状结构密切相关[ 11] .
克隆 38与蛋白数据库中长度为 27个氨基酸的
小家鼠的与胞吞有关的蛋白 epsins 同源性达到
9第 3期 蔡应繁等:抑制性消减杂交方法克隆棉属突变材料腺体发育相关的 cDNAs
51%,与核酸数据库中长度为 20 bp的人类位于 20
号染色体 DNA 序列同源性达到 100%,该基因是包
含类似于家鼠颌下腺腺体蛋白的新蛋白基因.从这
点推测 ,植物腺体与动物腺体在发生起源上可能存
在相同或相似的很短的保守区段 ,在进化的历史长
河中仍可能留下痕迹.
分析表明 ,本实验主要获得了与发育调控 、细胞
凋亡 、蛋白质合成 、信号传导等有关联的 cDNAs ,涉
及具有保守结构域的调控因子 、孔蛋白 、腺体蛋白以
及某些未知确切功能的系列新基因 ,目前已有部分
cDNA 序 列 在 GenBank 登 记 注 册 (AY162374 ,
AY221646 , AY221647等).
3 讨 论
(1)棉属植物色素腺体内含有以棉酚为主的次
生代谢物质 ,棉酚不仅是棉属的重要抗性物质 ,而且
在医药上是重要的男性抗生育药物和某些肿瘤的抑
制药物 ,国内外一直高度重视棉酚的代谢途径和腺
体的有关研究[ 12 ～ 15] .棉属色素腺体具有多样性 ,
“湘棉 18”就是种子无腺体而植株有腺体的特殊材
料 ,它与澳大利亚二倍体野生棉种的子叶色素腺体
延缓性状(the delayed gland morphogenesis trait)具有
相似性.本研究选用棉属突变材料“湘棉 18”这种特
殊腺体的发育形成时期作为研究对象 ,探明棉属植
物这种特殊腺体发育形成的分子机制及其与相关次
生代谢的关系 ,从分子水平上调控腺体和棉酚 ,使之
真正实现集粮 、棉 、油三位于一体.
(2)抑制性消减杂交(SSH)技术自 Diatchenko等
于1996年发明开始一直主要应用于人类及动物研
究 ,近年来开始应用于植物研究中[ 8 ～ 11] .该技术是
目前克隆研究差异表达基因的甚为理想的技术 ,它
所构建的消减文库具有高特异性 ,假阳性率低 ,其均
一化处理(normalization)使之能够克隆到低丰度基因
等突出的优点[ 5] .在植物领域 , SSH 尤其适合于研
究不同发育时期 、个体内不同器官之间 、生物和非生
物环境因子诱导的差异表达基因的克隆 ,特别是能
够成功地克隆生物发育中一些低丰度的调控因
子[ 5 ,9] (如本研究获得的克隆 20与 17),较之以往其
他方法更具有独特的优势.试验首次在棉属研究中
运用 SSH 技术 ,获得了一些腺体形成时期特异表达
或优势表达的 cDNAs , 以及多个未知新蛋白 cDNA
部分序列 ,为深入研究其功能 ,探索腺体发育形成的
分子机制提供了重要信息.
致谢 承蒙国家杂交棉研究中心张雪林先生提供试验种子材料 ,谨
此致谢.
参 考 文 献
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(责任编辑 赵 勃)
10 北 京 林 业 大 学 学 报 第 25卷