全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(12): 2121−2125 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家重点基础研究发展计划(973计划)前期项目(2006CB708208)；国家科技支撑计划项目(2006BAD01A02)
作者简介: 吴金华(1978–), 女, 山西朔州人, 博士, 主要从事小麦抗病育种及其分子生物学研究。E-mail: wjhua2@126.com
*
通讯作者(Corresponding author): 吉万全, 男, 博士, 教授, 博士生导师, 主要从事小麦遗传育种与分子生物学研究。
E-mail: jiwanquan2003@126.com
Received(收稿日期): 2008-03-07; Accepted(接受日期): 2008-06-05.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.02121
小麦抗白粉病 SSH-cDNA文库中差异基因的表达模式
吴金华 1,2 胡银岗 2 王新茹 3 张 宏 2 王长有 2 王秋英 2 吉万全 2,*
(1 河北农业大学农学院, 河北保定 071001; 2 西北农林科技大学农学院 / 陕西省农业分子生物学重点实验室 / 国家小麦改良中心杨
凌分中心, 陕西杨凌 712100; 3 陕西省农药管理检定所, 陕西西安 710003)
摘 要 : 为了解白粉菌诱导下抗白粉病小麦的抗病机制 , 构建了白粉菌接种初期的抑制性消减杂交 cDNA
(SSH-cDNA)文库。从中随机挑取 140个阳性克隆进行测序, 去除冗余序列和重复序列后, 得到 94条 EST, 利用 NCBI
的 BLAST在线序列比对工具对 GenBank的蛋白质数据库进行同源性比对及功能分类。结果表明, 49个 EST与已知
功能蛋白同源性较高, 主要涉及初级代谢(2%)、能量代谢(24%)、细胞结构(2%)、转录(2%)、蛋白质合成加工与储藏
(16%)、转运(4%)、信号转导(4%)和抗病与防御(30%)。经文库比较, 筛选出与病程相关蛋白基因同源的 EST(Z25-1)
和与谷胱甘肽硫转移酶同源的 EST(Z440-1), GenBank登录号为 EX567369和 EX567360。以其 EST序列为依据设计
引物, 通过 RT-PCR分析它们在白粉菌诱导下的表达模式, 结果该 2基因表达存在明显差异。其中, Z25-1在未接种白
粉菌时具有一定的表达量, 白粉菌侵染后表达量开始上升, 侵染 72 h时表达量最高, 然后下降; Z440-1在未接种时也
具有一定的表达量, 但在接种初期表达微弱, 甚至不表达, 24 h后表达开始上升, 到 72 h时达最高, 然后下降。本研
究表明, 病程相关蛋白和谷胱甘肽硫转移酶属于诱导型表达基因, 且参与白粉病抗病反应, 在白粉菌诱导 72 h 时表
达量最高。
关键词: 小麦; 白粉病; 抑制性消减杂交(SSH); 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)
Expression Pattern of Special Genes Resistant to Powdery Mildew
(Blumeria graminis f. sp. tritici) in SSH-cDNA Library of Wheat
WU Jin-Hua1,2, HU Yin-Gang2, WANG Xin-Ru3, ZHANG Hong2, WANG Chang-You2, WANG
Qiu-Ying2, and JI Wan-Quan2,*
(1 College of Agronomy, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, Hebei; 2 College of Agronomy, Northwest A&F University / Yangling
Branch of China Wheat Improvement Center / Shaanxi Provincial Key Laboratory of Molecular Biology for Agriculture, Yangling 712100, Shaanxi;
3 Institute for Control of Agrochemicals of Shaanxi Province, Xi’an 710003, Shaanxi, China)
Abstract: Powdery mildew, caused by Blumeria graminis f. sp. tritici, is one of the most important fungal diseases of common
wheat (Triticum aestivum L.) worldwide and causes severe yield losses. Wheat germplasm N9436, developed by our research
group, is a resistant material to powdery mildew. In the present study, a suppression subtraction hybridization (SSH) cDNA library
was constructed with cDNA from N9436 leaf inoculated by Blumeria graminis as the tester and cDNA from N9436 healthy leaf as
the driver. A total of 140 positive clones were randomly chosen from the SSH-cDNA library and were amplified with sp6 and t7
primers to examine the insert size, which ranged from 200 to 1 000 bp with an average of 238 bp. After screening repeat and re-
dundancy sequences, 94 expressed sequence tags (ESTs) were acquired. Protein homology search in nr-protein database revealed
that 49 ESTs were highly homologous with known proteins functioning in primary metabolism (2%), energy metabolism (24%),
cell structure (2%), transcription (2%), protein synthesis and processing (16%), transport (4%), signal transduction (4%), and dis-
ease resistance and defenses (30%). Compared with the EST sequences among the SSH-cDNA library, two ESTs (GenBank ac-
cession numbers: EX567369 and EX567360) were highly similar to pathogenesis-related protein (Z25-1) and glu-
tathione-S-transferase (Z440-1), respectively. On the basis of the EST sequences, two pairs of primers were designed and used to
2122 作 物 学 报 第 34卷

detect the expression differences of the two genes when inoculating with powdery mildew by Reverse Transcriptase PCR
(RT-PCR). Z25-1 and Z440-1 were both expressed under inoculation. Their expression amounts were the largest in 72 h after
inoculation with powdery mildew. But their expression trends were different. At early stage of inoculation (24 h after inoculation),
the expression amount of Z440-1 was very a little, then increased in 72 h, and finally decreased in 96 h. The expression amount of
Z25-1 increased from 24 h to 72 h after inoculation and decreased after 96 h. It suggests that pathogenesis-related protein and
glutathione-S-transferase belong to inducible expression genes and are involved in the resistance to powdery mildew.
Keywords: Wheat; Powdery mildew; Suppression subtraction hybridization (SSH); Reverse transcriptase PCR
白粉病是由 Blumeria graminis f. sp. tritici引起
的世界性小麦真菌病害之一, 也是目前危害我国小
麦生产的一个主要病害。该病是大区性气传病害 ,
传播远, 流行广, 危害重。白粉病原菌的生理小种多,
毒性变异速度快, 很容易造成品种抗病性的丧失。
因此加强抗病反应机制研究、延长抗病品种的“寿
命”和拓宽抗病品种的抗病谱非常重要[1]。培育抗病
新品种的基本途径, 一是发现与利用新的抗病基因,
二是诱导防御基因的表达。抗病基因的产物决定抗
病系统能否打开或打开的程度, 而真正起抗病作用
的是防御基因[2]。由于系统获得性抗性(SAR)具有系
统性、持久性、广谱性的特点, 研究其作用机制不
仅有理论价值, 也有实际意义。
抑制性消减杂交(SSH)揭示不同条件下差异基
因的表达状况, 为相关候选基因的分离和克隆提供
理论基础。利用该技术, Wang 等[3]分析了大豆疫霉
(Phytophthora sojae)侵染初期基因表达差异 ; Chen
等[4]电子克隆了编码小麦抗坏血酸过氧化物酶的全
长 cDNA; Wong等[5]在红树植物上鉴定并分离了 126
个盐胁迫 cDNA; Yang等[6]根据微阵列结果鉴定了番
茄(Solanum lycopersicum)盐胁迫应激基因; Lin等[7]
鉴定了竹(Bambusa edulis)中白化突变体的差异表达
基因; Chen等[8]在含 Pm21的小麦(Yangmai 5)近等基
因系中分离了抗性基因。
反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)是一种直观、
简单易行的基因表达验证方法, 对实验条件要求不
高, 理论上有一个单拷贝 cDNA 模板即可完成扩增,
具有较高灵敏度 [9]。董宏平等 [10]用半定量 RT-PCR
方法研究了 18 个信号传导调控基因的表达及其可信
度, 表明该方法能够准确检测不同基因表达的相对
水平。孙晓红等[11]应用半定量 PCR分析了 4个冷诱
导相关基因的表达差异。张丽娜等[12]利用半定量技
术研究了与白粉病有关的小麦 TaMlo-A1c 基因的表
达。
本研究通过构建抗白粉病小麦在白粉菌接种前
后的抑制消减杂交文库, 并对文库中部分差异基因
进行 RT-PCR 分析, 为系统揭示小麦抗白粉病的分
子机制, 发现小麦抗白粉病的关键基因, 明确差异
基因的表达模式奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
以本研究室培育的小麦种质 N9436(多小穗, 高
抗白粉病)为试材, 将幼苗在温室内培养 3 周后, 采
用涂抹法接种陕西关中地区白粉菌优势小种关中 4
号, 以不接种为对照。接种后植株罩以透明塑料桶,
保湿保温以利于病原菌侵染。接种后 24、48、72和
96 h分别剪取对照和接种材料的叶片约 0.2 g, 置于
液氮中研磨, 提取总 RNA。
1.2 消减文库的构建
采用 BIOZOL总 RNA提取试剂(BIOZOL公司,
杭州)提取叶片总 RNA, 并用 DNase I (TaKaRa公司,
大连)去除残留的痕量 DNA。
采用 AMV 反转录酶(Promega 公司, 美国), 以
Oligo (dT)18为引物将总 RNA反转录合成 cDNA, 以
接种叶片的 cDNA 为 tester, 对照叶片的 cDNA 为
driver, 依 照 PCR Select cDNA Subtraction Kit
(Clontech公司, 美国)的说明书进行 SSH。
对经 2 次消减杂交的产物再进行 2 次巢式 PCR
扩增, 扩增得到的产物经纯化后, 与 pGEM-T easy 载
体(Promega, 美国)连接 , 转化大肠杆菌(Escherichia
coli) DH5α感受态细胞, 转化细胞经含 100 μg mL−1
氨苄青霉素的 LB/IPTG/X-gal 平板的筛选培养, 挑
选白色克隆进行以 Sp6和 T7启动子序列引物的菌落
PCR, 筛选阳性克隆并检测插入片段的大小。
1.3 序列测定及生物信息学分析
将阳性克隆过夜培养, 采用 HQ&Q质粒微量抽
提试剂盒(优晶公司, 安徽)提取质粒 DNA, 送上海
生工生物工程公司测序。测序所得序列去除载体和
接头序列, 利用 DNAstar 及 CAP3 软件去除冗余序
列和重复序列以及小于 100 bp 的序列 , 提交
GenBank数据库。
所得EST, 经NCBI的非冗余蛋白数据库BLASTx
比对后进行功能分类[13-14]。
第 12期 吴金华等: 小麦抗白粉病 SSH-cDNA文库中差异基因的表达模式 2123


1.4 RT-PCR中所用引物、反应体系及程序
以文库中部分 EST为模板, 利用 Primer Premier
5 进行引物设计(序列见表 1), 由上海生工生物工程
公司合成。
以 18S rRNA 为内参基因, 在内参基因 PCR 产
物进入平台期前结束 PCR, 根据 PCR的指数增长曲
线, 选择产量高而又位于平台期前的循环次数。对
反转录后的 cDNA, 用 18S rRNA作为内参基因调整
模板浓度。
反应体系包括经内参调整的适宜体积的 cDNA
模板, 10×PCR buffer 2 μL, 2 mmol L−1 dNTP 2 μL, 10
mmol L−1正向和反向引物各 0.5 μL, 5 U μL−1 Taq
DNA聚合酶 0.2 μL, 以 ddH2O补齐至 20 μL。通过
梯度 PCR确定每对引物的最适退火温度(表 1)。PCR
程序为 95℃预变性 2 min; 95 40 s, 50~57 (℃ ℃ 依引
物而异) 45 s, 72 40 s, ℃ 共 33个循环; 72℃延伸 10
min。反应后于 4℃保温, 扩增产物经 1%琼脂糖凝胶
电泳检测。

表 1 RT-PCR分析所用的引物序列及反应温度
Table 1 Primers sequence and Tm values of RT-PCR
引物
Primer
假定基因
Putative gene
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
退火温度
Annealing temperature ( )℃
L：ACCAGGGAGTAATGGAGACG Z25-1 Pathogenisis-related protein
R：GTTGCAGGTGATGAAGACG
56
L：ACTACTCCCTCCATGCCTAT Z440-1 Glutathione-S-transferase
R：CATCCCGTTCACCTTCTACT
50
L：CTTCTTAGAGGGACTATGGC 18S rRNA
R：TACGGAAACCTTGTTACGAC
53

2 结果与分析
2.1 SSH-cDNA文库的构建
经 Biozol提取的小麦叶片总 RNA中 25S rRNA
是 18S rRNA的 2倍(图 1)。经检测, A260/A280值介于
1.8~2.0, A260/A230值大于 2.0表明提取的总 RNA质量
良好, 达到建库要求。



图 1 接种白粉菌后不同时间的小麦叶片总 RNA
Fig. 1 Total RNA extracted from wheat leaf at different time
after inoculating with powdery mildew
CK: no inoculation with powdery mildew.

RNA经 AMV反转录酶合成的双链 cDNA后运
用 SSH技术进行正向差减杂交, 2次巢式 PCR扩增
的 cDNA片段采用 T/A克隆法构建 SSH-cDNA文库,
文库中随机挑取阳性克隆进行 PCR 扩增, 琼脂糖电
泳检测结果表明, 片段大小介于 200~1 000 bp之间
(图 2), 平均插入片段大小为 238 bp, 说明构建的文
库质量较好。
2.2 EST序列的比对分析
在经菌落 PCR鉴定的克隆中, 随机选取 140个
克隆进行测序, 去除冗余序列和重复序列以及小于
100 bp的序列后, 将获得的的 94个非重复序列提交


图 2 消减文库部分克隆的 PCR检测
Fig. 2 PCR identification of inserted fragments in the
SSH-cDNA library
M: DL2000; 1–16: 16 clones selected randomly.

GenBank。GenBank序列号为 EX567357~EX567450,
dbEST-Id为 50073321~50073414。
该 94 个 EST 在 NCBI 的非冗余蛋白数据库的
Blastx比对结果表明, 其中 49个(占 52.1%)与已知功
能蛋白同源性较高, 主要涉及初级代谢(2%)、能量
代谢(24%)、细胞结构(2%)、转录(2%)、蛋白质的合
成加工及储藏(16%)、转运(4%)、信号转导(4%)和抗
病与防御(30%); 此外, 未知功能的 EST占 16%。
2.3 cDNA模板浓度的确定
以 18S rRNA 为内参基因, 经过 PCR扩增确定
PCR 的循环数为 34 时进入平台期, 因此 PCR 取 33
个循环。用 18S rRNA调整模板用量, 当扩增产物的
亮度基本一致时, 可确定模板浓度一致(图 3), 以用
于特异性扩增。
2.4 表达模式分析
在内标基因表达一致的情况下 , Z25-1(病程相
关蛋白) RT-PCR 扩增结果表明, 未接种白粉菌时具
2124 作 物 学 报 第 34卷

有一定的表达量, 白粉菌侵染 24 h后表达量开始上
升, 一直到 72 h表达量达到最高, 96 h时又开始减少
(图 4)。Z440-1 (谷胱甘肽硫转移酶) RT-PCR扩增结
果表明, 未接种时具有一定的表达量, 接种白粉菌
初期表达微弱甚至不表达, 24 h后表达量开始上升,
72 h时表达量达到最高, 96 h时又开始下降(图 5)。
进一步表明, 病程相关蛋白和谷胱甘肽硫转移酶是
白粉菌诱导型相关基因, 参与抗白粉病反应。



图 3 不同接种时间调整后的模板浓度
Fig. 3 Template concentration after adjustment at different
time after inoculation
M: DL2000; CK: no inoculation with powdery mildew.



图 4 Z25-1在白粉菌不同处理时间的表达模式
Fig. 4 Expression profile of Z25-1 at different time after inocula-
tion with powdery mildew
M: DL2000; CK: no inoculation with powdery mildew.



图 5 Z440-1在白粉菌不同处理时间的表达模式
Fig. 5 Expression profile of Z440-1 at different time after inocula-
tion with powdery mildew
M: DL2000; CK: no inoculation with powdery mildew.
3 讨论
3.1 植物与白粉菌互作机制
植物抗白粉病是一个复杂系统的过程, 涉及生
理、生化途径的多个方面, 体现了生命活动在整体
上的协调性。因此, 抗病过程不仅仅是抗病基因的
识别和开启, 更重要的是这一过程中抗病相关基因
的表达以及抗病信号的传递。在病菌与寄主互作中,
植物主要是通过防卫基因的表达、过敏反应和系统
获得性抗性等来抵抗病菌的入侵, 如谷胱甘肽硫转
移酶以及病程相关蛋白等都与植物抗病性的表达密
切相关。曹爱忠等[15]研究表明, 白粉菌诱导后簇毛
麦中的防卫反应基因细胞色素、热激蛋白、乙醛酸
脱氢酶等, 病程相关蛋白类甜蛋白、β-1,3-葡聚糖酶
等, 活性氧清除基因谷胱甘肽硫转移酶、过氧化物
酶等, 信号传导因子丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶等表达
量增加超过 2 倍。骆蒙等[16]在所构建的白粉菌混合
文库中, 出现大量抗病相关蛋白。本文所构建的 SSH-
cDNA 文库中, 抗病与防御基因所占比例最高, 说明
小麦经白粉菌诱导 72 h 后其抗病及防御机制明显加
强, 在植物体内积累一套病程相关基因, 诱导植物的
全面防卫反应, 有效抑制病原生长、繁殖和扩散。
3.2 抗性相关基因
骆蒙等[16]为了获得 SAR 启动与持续发挥作用
相关基因, 特别是相关信号传导途径, 构建了接种
24、48和 72 h的混合文库。曹爱忠等[15]利用大麦基
因芯片, 将接种白粉菌 24、48和 72 h的簇毛麦叶片
提取 RNA后等量混合, 筛选簇毛麦抗白粉病相关基
因。何道一等[17]以接种白粉菌的小麦—长穗偃麦草
异代换系山农551为材料, 利用代表性 cDNA库的扩
增(cDNA RDA)和快速 cDNA末端扩增法(RACE)技
术克隆了 2 个相关的新基因 WRP1 和 RPW2。马金
彪等[18]构建的小麦条锈菌 cDNA文库中有谷胱甘肽
硫转移酶的表达。谷胱甘肽硫转移酶是系统获得性
抗性体系诱导防卫蛋白, 在细胞质中能清除植物抗
病过程中积累的还原性氧类(ROS), 减少 ROS 的毒性
和破坏性作用, 参与毒素的分解代谢, 从而保护植
物细胞[19]。Enayati 等[20]证明 GST 与昆虫抗药性有
关, 可作为杀虫剂的三大解毒代谢酶系之一。本研
究通过半定量 RT-PCR 分析, 表明谷胱甘肽硫转移
酶和病程相关蛋白均属白粉病抗病相关蛋白, 其作
用机制有待进一步研究。
4 结论
采用抑制性消减杂交技术构建了白粉菌接种初
期小麦抗性种质 N9436的 SSH-cDNA文库, 并对文
库中部分差异基因进行了 RT-PCR 分析, 明确了其
表达模式。病程相关蛋白和谷胱甘肽硫转移酶属于
诱导型表达基因, 在白粉菌诱导 72 h表达量最高。
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