全 文 ：中 国 药 科 大 学 学 报
J ou r n a l of Ch in a Ph
a r ma ce u t iai CU
n i v e r si t y 1 9 94 ;2 5( 6 )
: 2 3 1~ 32 4 2 3 1
· 论 文 ·
两种红豆杉属植物细胞培养技术的建立和优化
高山林
(中国药科大学中药研究所 ,南京
T o w e t S G HN
21 0 009 ;
` 加拿大哥伦比亚大学植物系 )
摘 要 对两种红豆杉属植物细胞培养技术进行了研究 ,建立了 ,址沁 仍“ 自 和 , h刀绍俪抽如如 的
细胞培养技术和方法 . 通过培养基优化筛选试验成功地诱导获得了 12 个细胞株系 , 通过不同激素
试验使细胞生长量大幅度提高 ,细胞月增长 t 达 13 倍 , 每升培养墓每月干细胞产量达 1 6 . 1 1 9 , 取
得了较好的培养效果 ,为细胞培养工厂化生产提供了理论依据 , 为扩大高效抗庙植物资源红豆杉提
供了新途径 。
关镇词 红豆杉醉 ; 细胞培养
近年来药理研究表 明 , 紫杉醉 ( at x of )具
有独特的抗癌作用 ,但其自然资源短缺 , 限制
了紫杉醇的临床应用 , 红豆杉细胞培养生产
紫杉醇成为解决红豆杉资源短缺的重要途径
之一 。应用细胞培养技术 , 不仅可以直接生产
出紫杉醉 , 还可 以利用这一技术探讨紫杉醉
的生物合成途径 , 可利用细胞作为生物合成
紫杉醇的工厂 , 使难以合成或无法人工合成
的紫杉醇及其衍生物通过添加前体 , 在细胞
中合成排出或供人工提取 。 我们在原有红豆
杉细胞培养的基础 上进行协作研究 , 工作在
加拿大哥伦 比亚大学植物 系 T o w er s 实验室
进行 ,在细胞生长量 、诱发建立新细胞株系 、
真菌诱发紫杉醉合成和添加前体进行细胞生
物合成方面均取得 了较大进展 。 本文报道细
胞培养方法的建立 , 细胞生长速度测定和培
养基试验 。
材料与方法
1
.
1 外植休的采集及消毒方法
哥伦比亚大学位于太平洋沿岸温哥华 ,
是 , b翻吕 加邵 iof 必 主 产区 之一 。 我们采集了
7乞江刀 s 加代向阳如 及 7恤翻` 协配必 枝条作为外植体
供诱导愈伤组织 。 外植体刮去表面死组织放
入 70 % 乙醉中表面消毒 l一 Z m in , 取出后用
无菌水冲洗 3~ 5 次 , 然后浸入 30 %漂白粉
液中 10 ~ 20 m in (视外植体组织幼嫩程度而
定 ) 。 置于摇床上振荡以增强表面消毒效果 ,
最后用无菌水冲洗 5 次以上 , 供接种用 。
1
.
2 愈伤组织的诱导与细胞系的建立
将消毒的枝条切 成 1 ~ 1 . 5 c m 长 的小
段 , 在无 菌条件下接种 到 B : 琼脂培养基 上
义添加 N z 一 A m i n e 2 5 / L , 不 同浓 度 激素 , s u -
c r
OeS 2 0 5 / L
,
A s a r 8 9 / L )置于 2 5 ~ 2 6℃培养
箱中暗培养 , 20 d 后将诱导出的愈伤组织继
代培养到 B 。 培养基上 , 促进形成的愈伤细胞
不断生长增殖 , 经过 3~ 5 次继代后即形成一
定数量的细胞 ,然后放入 B 。 液体培养基中置
2 5 ℃恒温摇床上进行悬浮培养 , 选择分散性
好的细胞继代扩大 ,逐步形成细胞系 。根据不
同细胞系的来源及生长特征予以记录并编号
为 T b , , T b : , T b 3 , Tm , , T m Z , Tm : 等 。
1
.
3 细胞生长童的测定方法
为了准确测定不同激素配比的培养基细
胞生长量的差异 ,分别于接种前后 , 收获前后
四次测定每一培养皿的重量 , 从而准确地测
收稿 日期 1 99 4一 0 3一 14
中 国 药 科 大 学 学 报
J o u r na lo C f hi na P h
a rm a ce u tiCai U
ni ve rsi ty 1 9 9 4; 5 2( 6)
: 31 2 ~3 2 43 21
· 论 文 ·
两种红豆杉属植物细胞培养技术的建立和优化
高山林
(中国药科大学中药研究所 ,南京
T o w e t S G HN
21 0 009 ;
` 加拿大哥伦比亚大学植物系 )
摘 要 对两种红豆杉属植物细胞培养技术进行了研究 ,建立了 ,址沁 仍“ 自 和 , h刀绍俪抽如如 的
细胞培养技术和方法 . 通过培养基优化筛选试验成功地诱导获得了 12 个细胞株系 , 通过不同激素
试验使细胞生长量大幅度提高 ,细胞月增长 t 达 13 倍 , 每升培养墓每月干细胞产量达 1 6 . 1 1 9 , 取
得了较好的培养效果 ,为细胞培养工厂化生产提供了理论依据 , 为扩大高效抗庙植物资源红豆杉提
供了新途径 。
关镇词 红豆杉醉 ; 细胞培养
近年来药理研究表 明 , 紫杉醉 ( at x of )具
有独特的抗癌作用 ,但其自然资源短缺 , 限制
了紫杉醇的临床应用 , 红豆杉细胞培养生产
紫杉醇成为解决红豆杉资源短缺的重要途径
之一 。应用细胞培养技术 , 不仅可以直接生产
出紫杉醉 , 还可 以利用这一技术探讨紫杉醉
的生物合成途径 , 可利用细胞作为生物合成
紫杉醇的工厂 , 使难以合成或无法人工合成
的紫杉醇及其衍生物通过添加前体 , 在细胞
中合成排出或供人工提取 。 我们在原有红豆
杉细胞培养的基础 上进行协作研究 , 工作在
加拿大哥伦 比亚大学植物 系 T o w er s 实验室
进行 ,在细胞生长量 、诱发建立新细胞株系 、
真菌诱发紫杉醉合成和添加前体进行细胞生
物合成方面均取得 了较大进展 。 本文报道细
胞培养方法的建立 , 细胞生长速度测定和培
养基试验 。
材料与方法
1
.
1 外植休的采集及消毒方法
哥伦比亚大学位于太平洋沿岸温哥华 ,
是 , b翻吕 加邵 iof 必 主 产区 之一 。 我们采集了
7乞江刀 s 加代向阳如 及 7恤翻` 协配必 枝条作为外植体
供诱导愈伤组织 。 外植体刮去表面死组织放
入 70 % 乙醉中表面消毒 l一 Z m in , 取出后用
无菌水冲洗 3~ 5 次 , 然后浸入 30 %漂白粉
液中 10 ~ 20 m in (视外植体组织幼嫩程度而
定 ) 。 置于摇床上振荡以增强表面消毒效果 ,
最后用无菌水冲洗 5 次以上 , 供接种用 。
1
.
2 愈伤组织的诱导与细胞系的建立
将消毒的枝条切 成 1 ~ 1 . 5 c m 长 的小
段 , 在无 菌条件下接种 到 B : 琼脂培养基 上
义添加 N z 一 A m i n e 2 5 / L , 不 同浓 度 激素 , s u -
c r
OeS 2 0 5 / L
,
A s a r 8 9 / L )置于 2 5 ~ 2 6℃培养
箱中暗培养 , 20 d 后将诱导出的愈伤组织继
代培养到 B 。 培养基上 , 促进形成的愈伤细胞
不断生长增殖 , 经过 3~ 5 次继代后即形成一
定数量的细胞 ,然后放入 B 。 液体培养基中置
2 5 ℃恒温摇床上进行悬浮培养 , 选择分散性
好的细胞继代扩大 ,逐步形成细胞系 。根据不
同细胞系的来源及生长特征予以记录并编号
为 T b , , T b : , T b 3 , Tm , , T m Z , Tm : 等 。
1
.
3 细胞生长童的测定方法
为了准确测定不同激素配比的培养基细
胞生长量的差异 ,分别于接种前后 , 收获前后
四次测定每一培养皿的重量 , 从而准确地测
收稿 日期 1 99 4一 0 3一 14
6期 高山林等 :两种红豆杉属植物细胞培养技术的建立和优化 3 3 2
Ta b 2
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G r o w th a re t
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M e d诬 a C doe 碑
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.
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.
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.
4 5士 0 . 0 7
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.
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.
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13
.
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13
.
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.
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.
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.
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9
.
4 9士 0 . 3 6
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.
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7
.
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8
.
9 4士 0 . 7 0
14
.
19士 0 . 7 1
9
.
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8
.
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.
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.
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G r o w t h r a et
(
: 士召 E )
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.
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.
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.
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.
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7
.
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.
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.
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. C e 汤15 w e r e e u l t u r曰 3 0 d o n so l id m目 i a
M目 i a co m p o s i t i o n s : B s+ S u e r o se 30 9 / L十 N Z 一 A m i n e 2 9 / L+ A g ar 8 5 / L a d i n s ce r协 i n a m o u n t o f p h y tho o rm o n es
C u扭t u r e co n d i` 五o n : ( 2 5士 1 )℃ i n i n e u ba to r (da r k )
表 2 可见 , 细胞生长速度以 C L 培养基最
快 , 3 0 d 的生长速率为 13 倍 。 其次为 e : 3 , e , ;
和 C 3 培养基 , 每个生长速率均在 10 倍以上 ,
都是适合红豆杉细胞生长的培养基 。
每升培养基可净增细胞干重 , 以 c , `为最
高 , 每月每升培养基的细胞产量 16 . 1 1 9 ,其
次为 C I。 , C 3 和 C : 3 , 每升培养基 的细胞 产量
均在 13 9 以上 。
综合以上指标来看 , 最适 培养基为 lC ; ,
cl
。 , C , , cl
3 , 其 中 C : 虽生长速率最高 , 但是
每升培养基产量仅居第 5 位 ,原 因是细胞生
长过快 、 含水量较高 。 而 C , 。培养基上尽管生
长率不是最高 , 但细胞折干率高 , 因此细胞产
量最高 。 可见在细胞培养 中既要考虑细胞生
长速率 , 同时也要考虑干物质积累水平 ,才能
取得最佳效果 。
长速度提高 ,干物质大量积累 , 从而接近或达
到工厂生产的要求 。
我们在完成生长量优化试验的基础上还
进行了紫杉醇的含量测定和提高紫杉醇含量
的试验 , 初步结果表明 , 在细胞培养过程中紫
杉醇含量随生长速度的加快呈下降趋势 ,紫
杉醇含量为 0 . 0 01 % 一 0 . 03 % 。 除培养基组
成 、 培养条件 、 时间 、 方法影响外 , 添加前体产
物和特异真菌的刺激诱导都对细胞中紫杉醇
含量产生影响 , 这说明 at xo l 的生物合成比较
复杂 ,需要进行更多更深入的研究 , 才能达到
有效调控的 目的 。
参 考 文 献
3 结 论
本研究结果表明 ,红豆杉细胞培养在方 3
法技术上是可行的 ,通过方法技术的改进 , 培
养基组成及激素配 比的优化 , 可以使细胞生
E r i e k s on D
,
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G i b s o n D M
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34 2中 国 药 科 大 学 学 报 5 2卷
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A s t u d y o n e e l e u l t u r e o f 全at 欢” 仍妞自 a n d T . 加钱动加 , w ih e h m a i n ly gt o w in N or ht A m e r ica n w i t h
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址 hg as 1 3 tim e s in 3 0 d b y o Pt加恤it o n e x ep r ime n st on s u i at bl e m ed in e om Po s i ti o n s , e on e e n t ar it on of
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.
T h e o b at in ed r es u l st P r vo id
e t h e ep 昭 l b il i t y o f e e l l e u it u r e in in d us t r扭 1 sca l e Pr od u e
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K e y w o r ds aT
x o l ; C e l l e u l t u r e ; 1乞比之绍 ”以必 ; 全h 刀绍 加曰幼痴
【文摘 。 5 4】 中药沙参类商品药材调查 屠鹅 飞 ,
徐 国钧 , 徐路珊等 . 中 国中药杂志 , 19 94 , l 9( 1 l ) : 646
对全国 15 个省区沙参商品及 17 个省区莱阳参
(北沙参 )商品进行了调查 ,从 60 件商品沙参中鉴定
出沙参属 (人如曰户胭 )植物 9 种 4 亚种 , 主流商品为沙
参 A如明血即 “ ` 加 , 无柄沙参 A . 以 r `勿 及如 , . 碑倪司承建如 ,
泡沙参 A . 尸如俪 ,杏叶沙参 月 . 九口如翻绍. 的根 . 并对 62
件商品莱阳参进行了鉴定 , 全为珊瑚菜 ` 如俪如 翻怕甲创抬
的根 。
【文摘 。 5 5】 鼓褪石解化学成分研究 马国祥 , 徐
国钧 , 徐路珊等 . 药学学报 , 19 9扭, 2。 ( 一。 ) : 7 6 3一 7 6 6
自中药鼓褪石解 (刃匕“汽` 油” 已分终白m . 尤云园 . )茎
中分离到 5 个化合物 , 经光谱 ( u v , IR , M s , , H N M R ,
DI FN O E 和 ’ 3 c N M R ) 分 析 , 分 别 鉴 定为 卜 谷 幽醇
( I )
、 鼓褪 菲 ( c h r y so t o xe n e , I ) 、 毛 兰 素 ( e r ian i n ,
一 ) 、 毛 兰菲 ( co n r u sa r in , I v ) 和 鼓褪联 节 ( e h r y so t-o
ib 比 n yz l , v ) 。 . 是新化合物 , v 是新天然产物 。