全 文 ：第 30卷 江 西 农业大 学学 报 Vol.30
2008年 4月 ActaAgriculturaeUniversitatisJiangxiensis Apr., 2008
文章编号:1000-2286(2008)02-0343-05　　　　　＊
RAPD技术在决明属牧草上的应用
陈志彤 ,黄毅斌＊ ,应朝阳 ,罗旭辉
(福建省农业科学院 农业生态研究所 /福建省山地草业工程技术研究中心 , 福建 福州 350013)
摘要:应用 RAPD技术对 34个决明属牧草进行分析 ,筛选出 3个能有效体现多态性和重复性的随机引物。并
利用 QualityOne软件 , 用类平均法(UPMGA)建立了 34份决明属牧草的遗传关系聚类图。结果显示:在遗传距
离 0.13上 , 34份种质分Ⅰ、Ⅱ2个大簇 , 第Ⅰ簇 4个品种 , 第Ⅱ簇 30个品种;在遗传距离 0.25上 , 簇Ⅰ分 2个亚簇 , Ⅰ
A、Ⅰ B;簇Ⅱ分 3个亚簇。分析结果与形态学分类基本一致 , 能很好地用于决明属牧草种质资源的分析。
关键词:RAPD;豆科牧草;决明属
中图分类号:S718.55 +4　　文献标识码:A
ApplicationofRAPDTechniquetoLegumeForage
ofChamaecristaspp.
CHENZhi-tong, HUANGYi-bin＊ , YINGZhao-yang, LUOXu-hui
(AgriculturalEcologyResearchInstitute, FAFU, FujianEngineeringandTechnologyResearchCenterfor
HilyPrataculture, Fujian350013, China)
Abstract:Thegeneticdiversityof34 legumeforagesofChamaecristaspp.wasstudiedbyRAPDtech-
nique.3 randomprimerswhichshowedgoodpolymorphismandrepetitionwereselected.BasedonQuality
Onesoftware, byusingUPMGAthemoleculardendrogramfor34legumeforagesofChamaecristaspp.wases-
tablished.Theresultsshowedthatwhenthecoeficientwas0.13 , these34 accessionsweredividedintotwo
groups, GroupⅠ andⅡ.Whenthecoeficientwas0.25, GroupⅠ wasdividedintosectionⅠ AandⅠ B
andGroupⅡ wasdividedinto3sections.TheresultsofRAPDweremostlythesameasclassificationofmor-
phology.SoRAPDcanberegardedasagoodtechniqueforstudyingthegeneticdiversityoflegumeforagesof
Chamaecristaspp.
Keywords:RAPD;legumeforage;Chamaecristaspp.
决明属(Cassia)牧草为豆目(Fabales)、苏木科(云实科)(Caesalpinioideae)植物。全世界决明属植
物约 600种 ,分布于热带 、亚热带和温带地区[ 1] 。我国约 10余种 ,福建省有 8种 ,目前国内对决明属牧草
研究较多的主要有圆叶决明 (Cassiarotundifolia)、草决明 (Cassiaobtusifolia)[ 2] 、豆茶决明(Cassia
nomam.(Sieb)Kitag)[ 3] 、羽叶决明 (C.nictitans)[ 4] 、伞房决明(Cassiacorymbosa)[ 5] 等 。
由于决明属牧草耐旱 、耐酸 、耐瘠薄 ,固氮能力强 ,适应性广 ,覆盖度好 ,产量高 ,品质佳 ,粗蛋白质和
粗脂肪含量位于豆科之首 ,并含有丰富的钙 、磷等无机养分等优点 [ 6] 。因此 ,它是一种可用于饲养畜
禽 、改良土壤 、培肥地力 、保持水土的多用途先锋牧草 ,还可作为饲料茶果园套种作为培养料 ,是一种适
＊ 　　收稿日期:2007-11-20　　修回日期:2007-12-18
基金项目:福建省科技厅资助项目(B0510029, 2005N029, 2005YZ1004)和热带作物种质资源标准化整理 、整合及共
享试点项目(2005DKA21000-5-24)
作者简介:陈志彤(1979-), 男 ,硕士 , 主要从事牧草育种及分子生物学研究 , E-mail:crczt@163.com;＊通讯作者:
黄毅斌 , 研究员。
DOI :10.13836/j.j jau.2008070
宜于南方红壤丘陵区荒山荒地种植的优良草种 。鉴于决明属植物的多样性以及从国外引进的多个品系
的决明属牧草 ,为了探讨决明属植物不同种间的系统关系 ,并获得种内不同地域来源的决明品系间遗传
变异或生物多样性状况 ,结合田间实验决明属牧草的形态学特征 、生物学性状等详细资料及其品质分析
等因素 ,我们引入分子标记技术对这些种质资源作深入的评价 ,以求阐明决明属牧草不同品系间的系统
关系和遗传多样性状况 ,在决明属牧草的选种 、育种上提供理论基础。
表 1　供试决明品系的来源及形态学特征
Tab.1　OriginoftestedChamaecristastrainsandtheirmorphologicalcharacteristics
试验
编号 AusTRCF编号 拉丁名
地理分布 茎叶形态特征
国家 纬度 经度 茎 叶 形 复叶类型
1 AusTRCF319555 C.rotundifolia 巴西 12°25′S 38°54′W 半直立 倒卵形 三出复叶
2 AusTRCF319578 C.rotundifolia 哥伦比亚 2°33′N 75°51′W 直立 倒卵形 三出复叶
3 AusTRCF319561 C.rotundifolia 巴西 12°24′S 46°27′W 半直立 倒卵形 三出复叶
4 AusTRCF319195 C.rotundifolia 巴拉圭 23°17′S 57°20′W 匍匐 倒卵形 三出复叶
5 AusTRCF85836 C.rotundifolia 墨西哥 16°45′N 99°30′W 直立 倒卵形 三出复叶
6 AusTRCF319580 C.rotundifolia 哥伦比亚 3°05′N 75°06′W 直立 倒卵形 三出复叶
7 AusTRCF319191 C.nictitans 巴拉圭 25°30′S 56°25′W 直立 条形 羽状复叶
8 AusTRCF319581 C.rotundifolia 哥伦比亚 1°16′N 75°42′W 直立 倒卵形 三出复叶
9 AusTRCF319193 C.nictitans 巴拉圭 27°05′S 56°40′W 直立 条形 羽状复叶
10 AusTRCF57503 C.pilosa 巴西 10°29′S 64°12′W 半直立 倒卵形 羽状复叶
11 AusTRCF319204 C.serpens 巴拉圭 22°20′S 60°01′W 匍匐 倒卵形 三出复叶
12 AusTRCF78355 C.rotundifolia 阿根廷 28°53′S 58°45′W 匍匐 倒卵形 三出复叶
13 AusTRCF319510 C.rotundifolia 阿根廷 25°40′S 58°05′W 半直立 倒卵形 三出复叶
14 AusTRCF92985 C.rotundifolia 巴西 25°36′S 49°48′W 半直立 倒卵形 三出复叶
15 AusTRCF319183 C.rotundifolia 巴拉圭 20°57′S 61°48′W 半直立 倒卵形 三出复叶
16 AusTRCF319185 C.serpens 巴拉圭 23°06′S 57°06′W 匍匐 倒卵形 三出复叶
17 AusTRCF319551 C.rotundifolia 巴西 15°45′S 47°53′W 半直立 倒卵形 三出复叶
18 AusTRCF90809 C.rotundifolia 墨西哥 22°55′S 104°00′W 匍匐 倒卵形 三出复叶
19 AusTRCF86178 C.rotundifolia 墨西哥 19°35′N 104°25′W 半直立 倒卵形 三出复叶
20 AusTRCF86134 C.rotundifolia 墨西哥 20°45′N 103°35′W 半直立 倒卵形 三出复叶
21 AusTRCF319203 C.rotundifolia 巴拉圭 26°23′S 57°04′W 匍匐 倒卵形 三出复叶
22 AusTRCF319571 C.rotundifolia 巴西 18°01′S 39°51′W 半直立 倒卵形 三出复叶
23 AusTRCF319196 C.rotundifolia 巴西 18°46′S 39°51′W 直立 倒卵形 三出复叶
24 AusTRCF319567 C.rotundifolia 巴西 19°24′S 40°02′W 匍匐 倒卵形 三出复叶
25 AusTRCF319566 C.rotundifolia 巴西 13°58′S 40°11′W 匍匐 倒卵形 三出复叶
26 AusTRCF319583 C.rotundifolia 哥伦比亚 1°35′N 73°27′W 直立 倒卵形 三出复叶
27 AusTRCF319197 C.rotundifolia 巴拉圭 25°30′S 56°25′W 匍匐 倒卵形 三出复叶
28 AusTRCF319200 C.rotundifolia 巴拉圭 27°14′S 56°04′W 匍匐 倒卵形 三出复叶
29 AusTRCF319570 C.rotundifolia 巴拉圭 23°58′S 56°42′W 匍匐 倒卵形 三出复叶
30 AusTRCF319202 C.rotundifolia 巴拉圭 27°20′S 57°05′W 匍匐 倒卵形 三出复叶
31 AusTRCF319584 C.rotundifolia 哥伦比亚 2°45′N 75°33′W 直立 倒卵形 三出复叶
32 AusTRCF319568 C.rotundifolia 巴西 19°36′S 54°23′W 半直立 倒卵形 三出复叶
33 AusTRCF34721 C.rotundifolia 巴西 22°54′S 47°03′W 匍匐 倒卵形 三出复叶
34 AusTRCF86172 C.rotundifolia 墨西哥 19°15′N 104°40′W 半直立 倒卵形 三出复叶
1　试验方法
1.1　植物材料的采集
供试的决明属牧草由澳大利亚热带牧草品种资源中心(ATFGRC)提供原种。 ATFGRC是国际上收
集决明牧草品种最多的国际机构 ,保存有从世界各地收集的决明属牧草 184个品系 ,本研究从 ATFGRC
所保存的决明牧草中筛选出 34个较低矮的灌木状品系 ,其中 29个 C.rotundifolia品种 , 2个 C.serpens品
种 , 2个 C.nictitans品种 , 1个 C.pilosa品种 ,分别收集自巴西 、巴拉圭 、墨西哥 、哥伦比亚 、阿根廷等 5个
南美国家。分布于南纬 7°22′S,至 27°20′S,北纬 1°16′N至 28°53′N;西经 36°30′W至 104°40′W,具有较
广泛的品种多样性和地理分布代表性(表 1)。
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1.2　DNA的提取
采用改进的 CTAB法 。具体方法为取新鲜牧草叶片数片 ,用液氮研磨 ,取约 0.1 g粉状叶片于离心
管中 ,加入 700 μL65 ℃预热的 CTAB提取缓冲液(100 mmol/LTris-HCl, 20mmol/LEDTA, 1.4 mol/L
NaCl, φ=2% CTAB,临用前加入 φ=2% β -巯基乙醇),轻轻混匀 ,加入 1 /10体积的 65℃预热饱和酚 ,
轻轻混匀;加入等体积氯仿 ,混匀 , 65℃水浴 30min,并不时轻轻摇动;离心(12 000r/min, 15min),取水
相;加 0.8倍体积的预冷异丙醇 , -20℃沉淀 DNA30 min;离心(12 000 r/min, 10 min);收集沉淀;用 φ
=70%乙醇洗涤 DNA沉淀 ,干燥;加入 100μL无菌水溶解 DNA;加入 1μL5mg/mLRNaseA, 37℃保温
30 min;补水 300μL,加等倍体 V积氯仿∶V异戊醇(24∶1),离心 ,取上清;加 2倍体积冷冻无水乙醇及 1 /10体
积 3 mol/L醋酸钠 ,混匀 , -20 ℃沉淀 DNA过夜;离心(10 000r/min, 10 min),收集沉淀;用 φ=70%乙
醇洗涤 DNA沉淀 ,干燥 ,加入 40μLTE缓冲液溶解 DNA。
1.3　引物的选择
本实验所用的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。本实验随机筛选了以下以几个引
物(表 2):S3, S5, S6, S8, S11, S12, S13 , S19 , S26 , S28, S29, S78, S88, S108, S158 , S188, S198。
1.4　 PCR反应体系 表 2　随机引物序列
Tab.2　Primersusedintrialandtheirsequences
引物 序列 引物 序列
S3 CATCCCCCTG S26 GGTCCCTGAC
S5 TGCGCCCTTC S28 GTGACGTAGG
S6 TGCTCTGCCC S78 TGAGTGGGTG
S8 GTCCACACGG S88 TCACGTCCAC
S11 GTAGACCCGT S108 GAAACACCCC
S12 CCTTGACGCA S158 GGACTGCAGA
S13 TTCCCCCGCT S188 TTCAGGGTGG
S19 ACCCCCGAAG S198 CTGGCGAACT
在 EppendorfMastercyclergradientPCR仪上
扩增 ,扩增程序为 94 ℃预变性 5 min;94 ℃, 1
min;36 ℃, 1min;72℃, 2 min;45个循环 ,最后 72
℃延伸 7min。PCR反应体系总体积为 25μL,其
中包含:DNA模板 1 μL;dNTP(2 mmol/L)2.5
μL;10×bufer2.5 μL;引物 (5 pmol/μL)2 μL;
MgCl2 2μL;Taq酶 0.2 μL(5 U/μL),用蒸馏水
加足 25 μL。
1.5　电泳
用含 EB的 15g/L琼脂糖凝胶电泳检测 DNA,琼脂糖 AgaroseI-A购自上海生工生物工程有限公
司 ,电泳仪电源为安玛西亚 EPS301。
1.6　成像
在 UVPGDS-8000凝胶成像系统上观察并贮存图像 。
2　结果分析
2.1　电泳图
经实验程序的优化及随机引物的筛选中 ,其中 S3, S5, S29三个引物扩增待测样品能较好地体现多
态性和重复性(图 1 ～ 3)。对 34份材料的 DNA样品进行 RAPD分析 ,根据分子量 Marker, DNA片断的
长度大约在 200 ～ 1 600 bp之间 。
345　第 30卷 陈志彤等:RAPD技术在决明属牧草上的应用
2.2　聚类分析图
通过 QualityOne软件
用类平均法 (UPGAMA)对
以上 34种决明属牧草进行
聚类分析。利用 QualityOne
软件 , 用类平均法 (UPM-
GA)建立了 34份决明属牧
草的遗传关系聚类图 (图
4)。聚类图结果显示:在遗
传距离 0.13上 , 34个品种
分 Ⅰ 、Ⅱ 2个大簇 ,第 Ⅰ簇 4
个品种 ,第 Ⅱ簇 30个品种;
在遗传距离 0.25上 , 簇 Ⅰ
分 2个亚簇 , Ⅰ A、Ⅰ B;簇
Ⅱ分 3个亚簇 。其中 Ⅰ A
正好是拉丁名为 nictitans的
羽叶决明;Ⅰ B是拉丁名
为 serpens的决明。
3　讨　论
RAPD作为一种成熟的
分子标记技术 ,在品种鉴定 、分类研究 、系谱分析 、遗传图谱构建 、突变体检测 、基因定位等遗传 、育种领
域得到了广泛应用。但在牧草研究中的应用起步较晚 ,目前主要应用于温带牧草如苜蓿 [ 7] 、羊草(Ley-
muschinensis)[ 8] 、黑麦草(Lolimperenne)[ 9] 、无芒雀麦草(BromusinermisLeyss)、冰草(Agropyroncrtsta-
tum)[ 10] 、草地早熟禾(PoapratensisL.)[ 11]及草坪草[ 12]等种质资源的遗传多样性分析 、亲缘关系分析 、
品种及杂种纯度鉴定等。热带牧草方面 ,在狼尾草属(Pennisetumspp.)牧草资源 [ 13] 、种间遗传关系和
杂种 F1的 RAPD分析以及柱花草品种鉴定 [ 14] 、柱花草炭疽病原菌遗传多态性和炭疽病的抗性分析有
346 江 西农 业 大学 学 报 第 30卷　
一些研究。尚未见 RAPD分子标记技术在决明属牧草方面应用的报道 。
通过 RAPD实验对多条随机引物的筛选 , 34个品种分 Ⅰ 、Ⅱ 2个大簇 ,第 Ⅰ簇 4个品种 ,第 Ⅱ簇 30
个品种;在遗传距离 0.25上 ,簇Ⅰ分 2个亚簇 , Ⅰ A、Ⅰ B;簇Ⅱ分 3个亚簇 。其中 Ⅰ A正好是拉丁名
为 nictitans的羽叶决明;Ⅰ B是拉丁名为 serpens的决明;这与形态学分类相一致 。但是拉丁名为 pilosa
的 10号决明样品被分类到第Ⅱ簇圆叶决明中 ,这与形态学的特征略有差异 ,但经过分析 ,发现 10号样
品的叶子已略有向圆叶决明过渡的倾向 ,因此 ,总体说来 ,筛选出的引物能较好地反应 34个决明属品种
的遗传多态性。
RAPD作为一种快速灵敏的分子标记 ,已广泛应用于多种植物的种内和种间遗传多样性以及种性
鉴定等方面 ,并表现出了很强的多态性。生物的遗传多样性是生物多样性研究的核心 ,反映了物种的遗
传背景 ,育种潜力和利用价值 ,对优良种质的保护和发掘利用具有重要意义。然而 ,形态学鉴定和分子
生物学鉴定之间还会有一定的差异 ,这主要是因为形态分类是以几个主要的形态特征为依据 ,而控制这
几个形态特征的基因在整个基因组所占的比例较小;RAPD分析则是通过多个不同的引物扩增整个基
因组 ,反应的是整个基因组的结合位点的多态性变化。因此 ,为了更全面可靠的揭示植物遗传多样性和
种系亲缘关系 ,还需要摸索更为客观的方法 ,寻找两种方法最好的结合点。
参考文献:
[ 1] 福建省科学技术委员会《福建植物志》编写组.福建植物志(第三卷)[ M] .福州:福建科学技术出版社 , 1987, 27 -
32.
[ 2] 李金亭 , 姬晓明.大豆 、决明和玉米种子超氧化物歧化酶的同工酶分析 [ J] .河南师范大学学报:自然科学版 , 2002, 30
(2):114-115.
[ 3] 吴皓.豆茶决明提取物对 CHO-K1细胞系细胞周期的影响及其对丝裂霉素 C诱导染色体畸变的抑制作用 [ J] .国
外医学:中医中药分册 , 2004, 26(2):111.
[ 4] 冯发华.羽叶决明果园套种技术 [ J] .福建果树 , 2003(3):58.
[ 5] 邬秉左.伞房决明的引种和栽培应用 [ J] .植物杂志 , 2001(5):17.
[ 6] MupangwaJF, AcamovicdT.Contentofsolubleandboundcondensedtanninsofthreetropicalherbaceousforagelegumes
[ J] .AnimalFeedScienceandTechnology, 2000, 83(2):139-144.
[ 7] 徐子勤 , 贾敬芬.苜蓿红豆草属间体细胞杂种的分子生物学鉴定 [ J] .生物工程学报 , 2000, 16(2):173-178.
[ 8] 胡宝忠 , 刘娣.羊草遗传多样性的研究 [ J] .植物生态学报 , 2001, 25(1):83-89.
[ 9] 宁婷婷 , 张再君 , 金诚赞 , 等.用 RAPD分析多年生黑麦草品种间遗传多样性 [ J] .武汉植物学研究 , 2005, 23(1):
27-31.
[ 10] 李景欣 , 云锦凤 , 郭军.16个天然冰草种群遗传多样性 RAPD分析 [ J] .草地学报 , 2005, 13(3):190-193.
[ 11] 田志宏 , 邱永福 , 严寒 , 等.用 RAPD标记分析草地早熟禾遗传多样性 [ J] .草地学报 , 2006, 14(2):120-123.
[ 12] 邱永福 , 田志宏.RAPD分子标记技术及其在草坪植物研究中的应用 [ J] .湖北农学院学报 , 2004, 24(2):124 -
127.
[ 13] 钟小仙 , 顾洪如 , 向阳海 , 等.狼尾草属牧草资源的 RAPD分析 [ J] .江苏农业学报 , 2003, 19(2):109-113.
[ 14] 傅小霞 , 漆智平 , 何华玄.柱花草 RAPD品种鉴定方法 [ J] .种子 , 2005, 24(12):6-9.
347　第 30卷 陈志彤等:RAPD技术在决明属牧草上的应用