全 文 ：浙 江 林 学 院 学 报　2008, 25(3):298-303
JournalofZhejiangForestryColege
我国紫薇属植物 AFLP分子标记体系的优化
顾翠花 1 , 王守先2 , 张启翔 3
(1.北京林业大学 园林学院 , 北京 100083;2.浙江林学院 信息工程学院 , 浙江 临安 311300;
3.北京林业大学 国家花卉工程技术中心 , 北京 100083)
收稿日期:2007-04-09;修回日期:2007-10-09
基金项目:“十一五” 国家科技攻关计划项目(2004BA525B11)
作者简介:顾翠花 , 博士研究生 , 从事园林植物遗传育种研究。 E-mail:gchwsx11@ 126.com。通信作者:张启
翔 , 教授 , 博士生导师 , 从事园林植物遗传育种研究。 E-mail:zqx@bjfu.edu.cn
摘要:以采自广西 、 云南和河南等地的紫薇属 Lagerstroemia植物紫薇 L.indica, 南紫薇 L.subcostata, 福建紫薇 L.
limii和桂林紫薇 L.guilinensis叶片为材料 , 利用改良 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取叶片基因组 DNA, 获得了
高质量的紫薇叶片 DNA, 并以其基因组 DNA为模板进行了酶切连接 , 利用酶切连接的产物稀释一定倍数作为预扩增
的模板 , 最后以稀释一定倍数的预扩增产物进行选择性扩增 , 进行紫薇和南紫薇的 AFLP(扩增片段长度多态性)银染
反应体系的优化。 AFLP体系中每一步反应都设置了不同的反应体系 , 采用了 160对引物作为初选引物 , 筛选出了 10
对适合紫薇基因组扩增的引物 。结果表明 , 适宜紫薇基因组扩增的最佳酶切 、 预扩增和选择性扩增体系为:酶切连接
体系 1;预扩体系 3;选扩体系 3, 反应体系中 Mg2+质量浓度为 1.2×10-6 kg·L-1时扩增效果较好。图 1表 7参 20
关键词:植物学;紫薇;DNA提取;AFLP;分子标记
中图分类号:S718.4　　　文献标志码:A 文章编号:1000-5692(2008)03-0298-06
OptimizationofAFLPmolecularmarkersysteminLagerstroemiaplantsinChina
GUCui-hua1 , WANGShou-xian2 , ZHANGQi-xiang3
(1.ColegeofLandscapeArchitecture, BeijingForestryUniversity, Beijing100083, China;2.Schoolof
InformationEngineering, ZhejiangForestryCollege, Linan 311300, Zhejiang, China; 3.StateFlower
EngineeringCenter, BeijingForestryUniversity, Beijing100083, China)
Abstract:Thisstudydealtwithoptimizationofamplifiedfragmentlengthpolymorphism(AFLP)analysis
basedonthehighqualityDNAextractedbytheimprovedcetyltrimethylammoniumbromide(CTAB)method
fromtheleavesofLagerstroemiaindica, L.subcostata, L.limiandL.guilinensiswhichweregatheredin
Guangxi, YunnanandHenanProvince.AndtheirDNAwereusedasthetemplatetocaryonrestriction-ligase
reaction, thentheproductwasdilutedthecertainmultipleastemplatetotakepre-amplification, finalythe
productwasdilutedandusedastemplatetocaryonselectiveamplification, andthebestsystemofrestriction-
ligasereaction, pre-amplicationandsilverstainingsuitforL.indicahadbeenoptimized.IntheAFLPsystem
eachstepofresponsehadestablisheddiferentreactingsystem.The10pairsofprimersuitforL.indicawere
selectedfrom160 pairsofelementaryprimer.Theresultindicatedthat, thebestsystemssuitableforthe
Lagerstroemiagenegroupwereasfolows:restriction-ligasereactionsystem1;pre-amplificationsystem3;
selectiveamplificationsystem3, inreactingsystemthebestMg2+ concentrationwas1.2 ×10-6 kg· L-1.
[ Ch, 1 fig.7 tab.20 ref.]
Keywords:botany;Lagerstroemia;DNAextraction;amplifiedfragmentlengthpolymorphism(AFLP);
molecularmarker
紫薇 Lagerstroemiaspp.是我国夏季主要的观花小乔木 [ 1] , 枝干光滑 , 枝条柔软 , 花色艳丽多彩 ,
花朵繁茂 , 且在群花凋谢时开放 , 花期长约 3个月 , 有时甚至达 5个月 , 正大量地应用于园林绿化
中 [ 2] 。但其分子方面的研究在我国才刚刚起步 , 利用 AFLP(扩增片段长度多态性)技术对紫薇的研究
还不成熟。笔者拟主要对紫薇 AFLP反应体系进行优化 , 以期为后续进一步的紫薇基因研究奠定
基础。
1　材料与方法
1.1　材料
紫薇属植物样品采自广西 、云南和河南等地 , 包括紫薇 Lagerstroemiaindica, 南紫薇 L.subcostata,
福建紫薇 L.limi和桂林紫薇 L.guilinensis, 于 2006年 6-8月取幼嫩叶片放置在 10倍于其体积的硅胶
中干燥后 , 置室温保存备用 , 或用冰盒保存后迅速放到 -78 ℃超低温冰箱中 , 实验时取出。
1.2　方法
1.2.1　紫薇模板 DNA的制备　实验采用 3种方法提取紫薇 DNA, 其中 CTAB(十六烷基三甲基溴化
铵)法和 SDS(十二烷基磺酸钠)法分别参照文献 [ 3]和文献 [ 4]进行操作。改良 CTAB法具体操作步
骤如下:①在研钵中加入干燥叶片 , 研磨成粉末状 , 分装到 2×10-3 L离心管中 , 分别加入 7×10-4
LCTAB65℃预热 , 缓冲液与 7×10-6 Lβ-巯基乙醇充分混匀。 ②65℃水浴 1 h冷却后加入 7×10-4 L
25∶24∶1=酚∶氯仿∶异戊醇 , 混匀 , 静置 15min, 1.3万 r·min-1离心 10min, 取上清液 5×10-4 L。
在上清液中加入 5×10-4 L24 ∶1=氯仿∶异戊醇 , 混匀 , 静置 15 min, 1.3万 r·min-1离心 10 min,
取上清液 3×10-4 L, 加入预冷异丙醇 2×10-4 L混匀 。 4 ℃静置 30 min以上沉淀 DNA。 1.3万 r·
min-1离心 10 min, 弃上清后用体积分数为 70%乙醇洗涤沉淀 3次 , 烘干 , 让异丙醇和乙醇挥发干净。
③加入 1×10-4 LddH2O(含 1×10-11 LRNAse)溶解 DNA, 37℃水浴 1 h去除 RNA。 ④加入 1×10-4
L24∶1=氯仿∶异戊醇去除残存蛋白和 RNA酶 , 1.3万 r·min-1离心 10min, 取上清液 8×10-5 L加
入 1.5×10-9L有 1×10-4 L预冷异丙醇的离心管中混匀 , 4℃静置 30 min沉淀 DNA, 1.3万 r·min-1
离心 10 min, 弃上清液 , 用无水乙醇洗涤沉淀 2次 , 吹干 DNA, 让异丙醇和乙醇挥发干净 。⑤加入 5
×10-5 LddH2O溶解 DNA, 经检测后将它 -20 ℃储存或放入 4 ℃待用。
1.2.2　DNA浓度与质量测定　用 BioRADSmartspecMT3000紫外分光光度仪测定样品光密度值 , 以
1 g·L-1琼脂糖凝胶检测 DNA主带质量:5×10-6 LDNA样品 +1×10-6 L溴酚蓝上样缓冲液 , 加样
于含溴化乙锭(EB)凝胶上 80V恒压下电泳 30 ～ 40 min, 在紫外凝胶成像系统下观察摄像 [ 5] 。
1.2.3　酶切连接　实验采用 MseI和 EcoRI等 2种限制性内切酶进行双酶切 , 然后用 T4DNA连接酶 ,
将 MseI和 EcoRI接头与酶切片断连接起来 , 酶切连接一步在 PCR仪上 37℃反应 3 h完成。构建成预
扩增模板 DNA, 该模板可用于扩增反应 。该实验采用 4种酶切连接体系 , 每个酶切连接反应体系为 5
×10-5L(表 1)。
表 1　酶切连接体系
Table1　Systemsofrestriction-ligasereaction
反应成分 体系 1 体系 2 体系 3 体系 4
模板 DNA(1×10-10 ～ 5×10-10 kg) /L 5.00×10-6 5.00×10-6 5.00×10-6 5.00×10-6
1.667×10-5 katEcorI/L 0.50 0.25 0.50 0.25
1.667×10-5 katMseI/L 0.50 0.25 0.50 0.25
5×10-6 mol·L-1 EcorIadaptor/L 1.00×10-6 1.00×10-6 1.00×10-6 1.00×10-6
5×10-5 mol·L-1 MseIadaptor/L 1.00×10-5 1.00×10-5 1.00×10-5 1.00×10-5
10kg·L-1 ATP/L 1.00×10-6 1.00×10-6 1.00×10-6 1.00×10-6
10×NEBbuffer2缓冲液 /L 5.00×10-6 5.00×10-6 5.00×10-6 5.00×10-6
16.67 ×10-9 katT4 DNA连接酶 /L 1.00×10-6 1.00×10-6 0.50×10-6 0.50×10-6
1×10-5 kg·L-1 BSA/L 0.25×10-6 0.25×10-6 0.25×10-6 0.25×10-6
ddH2O/L 34.75×10-6 35.25×10-6 35.25×10-6 35.25×10-6
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1.2.4　预扩增　由于 Mg2+能与 dNTPs(三碳酸脘氧核糖核苷酸)结合而影响 PCR(聚合酶链式反应)
反应液中游离的 Mg2 +质量浓度[ 6] , 因而 MgCl2质量浓度在不同反应体系中应适当调整 , 优化质量浓
度 。一般反应中 Mg2 +质量浓度至少应比 dNTP总质量浓度高 0.5×10-6 ～ 1.0×10-6 kg·L-1 [ 7] 。为了
探讨紫薇的最佳预扩增体系 , 本实验预扩体系 (每个预扩增反应体系为 2×10-5 L)有 4种方
案(表 2)。
表 2　预扩增体系方案
Table2　Systemsofpre-amplification
反应成分 体系 1 体系 2 体系 3 体系 4
酶切连接后模板 DNA/L 5.0×10-6 5.0×10-6 5.0×10-6 5.0×10-6
5×10-5 kg·L-1 EcorIprimer/L 0.6×10-6 0.6×10-6 0.6×10-6 0.6×10-6
5×10-5 kg·L-1 MseIprimer/L 0.6×10-6 0.6×10-6 0.6×10-6 0.6×10-6
10-5 kg·L-1 dNTPs/L 0.4×10-6 0.4×10-6 0.4×10-6 0.4×10-6
2.5×10-7 kg·L-1 Mg2+/L 1.0×10-6 1.1×10-6 1.2×10-6 1.3×10-6
10×PCRbufer/L 2.0×10-6 2.0×10-6 2.0×10-6 2.0×10-6
9.165×10-11 katTaqpolymerase/L 0.2×10-6 0.2×10-6 0.2×10-6 0.2×10-6
ddH
2
O/L 10.2×10-6 10.1×10-6 10.0×10-6 9.9×10-6
　　说明:预扩增 PCR反应程序:94℃, 30s;56℃, 30s;72℃, 60s, 共 24个循环。
1.2.5　选择性扩增　本实验的选扩体系(每个选扩反应体系为 2×10-5 L)也采用 4种方案(表 3)。
表 3　选扩体系方案
Table3　Systemsofselectiveamplification
反应成分 体系 1 体系 2 体系 3 体系 4
预扩产物 10倍稀释模板 /L 5.0×10-6 5.0×10-6 5.0×10-6 5.0×10-6
5×10-5 kg·L-1 MseIprimer/L 1.0×10-6 1.0×10-6 1.0×10-6 1.0×10-6
5×10-5 kg·L-1 EcorIprimer/L 1.0×10-6 1.0×10-6 1.0×10-6 1.0×10-6
10-5 kg·L-1 dNTPs/L 0.4×10-6 0.4×10-6 0.4×10-6 0.4×10-6
2.5×10-7 kg·L-1 Mg2+/L 1.0×10-6 1.1×10-6 1.2×10-6 1.3×10-6
10×PCRbufer/L 2.0×10-6 2.0×10-6 2.0×10-6 2.0×10-6
9.165×10-11 katTaqpolymerase/L 0.2×10-6 0.2×10-6 0.2×10-6 0.2×10-6
ddH2O/L 9.4×10-6 9.3×10-6 9.2×10-6 9.1×10-6
　　说明:选择性扩增 PCR反应程序:梯度 PCR(12个循环): 94℃, 变性 30s; 65～ 56℃, 退火 30s, 每个循环降温 0.7 ℃; 72
℃, 延伸 60s;接着进行下列 24个循环: 94℃, 变性 30s;56℃, 退火 30s; 72℃, 延伸 60s。
1.2.6　聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测　反应结束后在 2×10-5 L反应体系中加入 5×10-6 L加样缓
冲液 , 95 ℃变性 8min后迅速放于冰上 , 然后置于 -20℃用于电泳检测 。本实验采用聚丙烯酰胺凝
胶电泳和银染进行检测。银染后的胶板晾干后在 X线胶片灯下观察 , 选择那些条带清晰 、易计数的
引物作为 AFLP反应的适宜引物 [ 8] 。
2　结果与分析
2.1　基因组 DNA提取结果与检测
实验采用 3种方法均能提取紫薇基因组 DNA。但从表 4和图 1可以看出 , 采用改良 CTAB法提取
的紫薇基因组 DNA, 其光密度值 A260 /光密度值 A280比值为 1.8左右 , 表明蛋白质等杂质去除较干净 ,
300 浙 江 林 学 院 学 报　　　　　　　　　　　　　　　2008年 6月　
DNA纯度较高;用 10g·L-1琼脂糖凝胶检测 , 提取的 DNA不含 RNA, 无降解 , 点样孔干净 , 纯度符
合 AFLP分析要求 。SDS法和 CTAB法所获得的 DNA, 光密度值 A260 /光密度值 A280偏低 , DNA样品受
蛋白污染较严重 , 电泳结果为点样孔发亮 , CTAB法提取的 DNA有轻微降解 [ 9] 。作者认为 , 改良
CTAB法最适合紫薇基因组提取 。采用改良 CTAB法对 4个紫薇种的成熟叶和嫩叶进行了 DNA提取 ,
琼脂糖凝胶结果表明嫩叶提取 DNA质量和纯度明显高于成熟叶 。由方差分析结果(表 5)和 LSD法多
重比较结果(表 6)可以看出 , 改良的 CTAB法达 0.05的显著水平 , 因此 , 此法效果明显优于其他 2
种方法 。
表 4　不同提取方法所得紫薇 DNA检测结果显著性差异分析
Table4　ThesignificancetestingresultsofLagerstroemiaspp.leavesbydiferentmethodsofDNAextraction
样品 改良 CTAB法 DNA质量浓度 / (kg·L-1)
CTAB法 DNA质量
浓度 / (kg·L-1)
SDS法 DNA质量
浓度 / (kg·L-1)
紫薇　　 3.068×10-3 2.152×10-3 2.626×10-3
南紫薇　 5.569×10-3 4.042×10-3 2.348×10-3
福建紫薇 1.872×10-3 2.712×10-3 3.016×10-3
桂林紫薇 2.380×10-3 3.006×10-3 4.979×10-3
图 1　不同提取方法提取紫薇 DNA的琼脂糖凝胶电泳结果
Figure1　DNAelectropherogramsofdiferentmethodsofLagerstroemiaspp.DNAextraction
表 5　3种方法得到的 DNA检测结果方差分析表
Table5　Tableofvarianceanalysisofresultsbythreemethods
变异来源 平方和 自由度 均　方 F值 显著水平
处理间 7.028 5 2 3.514 2 4.308 0.048 7
处理内 7.341 1 9 0.815 7
总变异 14.369 6 11
表 6　LSD法多重比较 3种提取方法
Table6　TheLSDlawmultiplecomparisonofthreemethods
处理 均值 5%显著水平 1%极显著水平
CTAB法 4.158 a A
改良 CTAB法 2.978 ab A
SDS法 2.306 b A
2.2　紫薇 AFLP最佳反应体系的建立
酶切连接是否完全直接影响实验结果的正确性 [ 10] , 非完全酶切必然造成相应指纹片断的缺失 ,
得出不完整的片断信息导致失真 , 同时也会使大片段增多不便于数带 。酶切时间也不能过长 , 否则会
出现 DNA部分降解 , 造成小片段过多 [ 11] 。因此 , 本实验采用了 4种方案来对酶切反应体系进行优
化 , 酶切连接产物经凝胶电泳检测可知体系 1的效果较好 , 在凝胶上呈现均匀弥散。
预扩增:这一步所用引物不带选择性碱基 , 通过扩增达到富集 DNA的目的 , 同时通过预扩增产
物检测酶切连接效果 [ 12] 。如果前几步反应完全 , 则预扩增后 DNA片断多 , 在胶上可以看到长而均匀
的条带;若扩增片断少 , 且集中分布于较小的碱基数值范围内 , 则说明限制性双酶切不完全[ 13] 。这
样的预扩增产物不适合进行下一步反应。因此 , 本实验亦采用 4种方案来探讨适于紫薇预扩增的最佳
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反应体系。预扩增产物经凝胶电泳检测发现体系 3的效果较好。
选择性扩增:这一步反应与预扩增一样 , 所不同的是选用的引物带有 1 ～ 3个选择碱基 。该步骤
的影响因子均与一般 PCR反应相同 , 其中 Mg2+的质量浓度和 Taq酶的质量和浓度是最主要的影响因
子 [ 14] 。本实验对最适于紫薇扩增的 Mg2+质量浓度进行了摸索 , 发现 Mg2+质量浓度为 1.2×10-6 kg·
L-1时扩增效果较好 。
2.3　AFLP引物筛选分析
AFLP技术与 RAPD技术一样用的是通用型引物 , 但不是所有引物组合都能很好地扩增并且多态
性高 , 不同引物组合对扩增条带有明显影响 [ 15] 。因此 , 具体到某一材料 , 应根据基因组的具体情况
筛选选择性引物组合 [ 16] 。
表 7　引物序列与扩增结果　　　　　
Table7　Sequencesandamplificationresultsoftwentyprimers　
引物序号 选择碱基 扩增位点 /个
多态性位点 /
个
多态性位点
比例 /%
64-94 GAC-TTT 47 28 59.5
23-46 TA-ATT 40 22 55.0
23-47 TA-CAA 32 20 63.6
24-46 TC-CAA 44 27 61.3
24-75 TC-GTA 52 31 59.6
25-46 TG-ATT 41 24 59.1
25-47 TG-CAA 39 23 57.8
41-47 AGG-CAA 56 31 54.9
41-94 AGG-TTT 34 21 61.7
64-46 GAC-ATT 38 21 55.3
由于缺乏有关紫薇基因组信息资料 , 所以
选用了如下引物筛选策略:“2+2” , “2+3” ,
“ 3+2” 和 “3 +3”, 每个引物组合都选择若
干对。选择紫薇和南紫薇为试材筛选引物 , 共
筛选引物组合 160对 , 以确定合适引物。从
160对 AFLP引物中筛选出 10对多态性较高 ,
带型质量较好 , 分辨率较高的引物。其引物序
号 分 别 为: M64E94, M23E46 , M23E47,
M24E46, M24E75, M25E46, M25E47,
M41E47和 M41E94, M64E46(表 7)。由引物
筛选结果可知 , “ 2+2” 引物组合条带较少 ,
多态性不丰富 , “3+3” 和 “3+2” 引物组合
产生条带较多 , 不利于统计 , 而 “ 2+3” 的
引物组合产生的条带粗细适中 , 多态性强分辨
率高且条带分布均匀 。因此本实验主要选取具
有 2个选择性核苷酸与 3个选择性核苷酸的引
物组合 。从引物筛选实验中还可看出 , 预扩增产物稀释倍数(本实验设置了 0 , 5, 10, 20倍 4个稀释
梯度)对选择性扩增没有太大影响。
3　讨论
AFLP技术结合了 RFLP(限制性片段长度多态性)和 RAPD(随机扩增多态性 DNA)技术的优
点 [ 17] , 它既有 RFLP的高度稳定性 , 又具有 RAPD的多态性高的特点 [ 18] , 这两个突出特点在本实验
中得到充分验证 , 但 AFLP操作过程繁琐 , 所用药品和仪器较多 , 每一步反应都密切相关 , 其中 DNA
提取这步是整个实验关键所在 [ 19] 。紫薇叶片含糖相对较多 , 这在某种程度上增加了紫薇叶片 DNA的
提取难度。由于北京现无紫薇种质资源圃 , 从外地采样再带回北京的叶片其 DNA提取的质量稍差于
新鲜叶片 , 因此 , 采用何种方法提取 DNA把这种差别降到最小 , 是紫薇 DNA提取的关键。本实验在
提取 DNA的过程中 , 采用 2次抽提来充分去除直接影响扩增中 Taq酶活性的氯仿和异戊醇等物质 ,
在去除 RNA后 , 增加一次抽提 , 以去除残存的 RNA酶蛋白 , 保证 DNA的高纯度。
多态性和稳定性好的引物是决定扩增成败的关键[ 20] , 尤其是种内的扩增 , 因为种内的个体除自
然变异外基因型没有太大差异 , 所以没有多态性强 、稳定性好的引物很难区别个体内的差异 , 需要在
大量引物中筛选才能得到理想结果。本实验采用 160对引物作初选引物 , 筛选出 10对适合紫薇基因
组扩增的引物 , 同时又摸索出适宜紫薇基因扩增的最佳酶切 、预扩增和选扩体系 , 所有这些工作都为
今后进行紫薇品种分子鉴定和紫薇野生居群遗传多样性分析提供了有益资料。
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303　第 25卷第 3期 顾翠花等:我国紫薇属植物 AFLP分子标记体系的优化