全 文 ：分子植物育种，2014年，第 12卷，第 3期，第 509-516页
Molecular Plant Breeding, 2014, Vol.12, No.3, 509-516
研究报告
Research Report
紫花含笑新品种鉴别及与 4种含笑属植物亲缘关系分析
温强 宋晓琛 田径 肖复明 江香梅 *
江西省林业科学院,江西省植物生物技术重点实验室,南昌, 330032
*通讯作者, zjiang2013@126.com
摘 要 本研究以项目组选育的 3个紫花含笑新品种“荷瓣墨紫”、“蝶瓣墨紫”和“梅瓣墨紫”为对象，建立了
基于 ISSR标记的分子鉴别体系。3个 UBC系列 ISSR标记的扩增产物 UBC815-1 000 bp、UBC836-1 200 bp
及 UBC840-460 bp，可有效鉴别“荷瓣墨紫”、“梅瓣墨紫”和“蝶瓣墨紫”3个新品种；根据 UBC844扩增的谱
带，可将 3个新品种与紫花含笑其它个体区分开来；根据 UBC854-1 100 bp标记，可一次性将紫花含笑从含
笑、乐昌含笑、深山含笑和金叶含笑 4个近缘种中区别出来。ISSR检测结果还表明，含笑属 5个种的物种水
平的 Neis基因多样度(h)为 0.312 3，Shannon信息指数(I)为 0.471 2，显示物种间具有丰富的遗传多样性。5
个种种间的 Nei遗传距离在 0.169 3~0.778 7之间，相似系数在 0.483 6~0.786 9之间。采用 UPGMA聚类法以
遗传距离进行聚类，结果表明：含笑属 5个种中，同种的不同个体均能很好地聚在同一种下，显示在分子水平
上支持 5个种的传统分类方法；分析 5个种的亲缘关系，紫花含笑与含笑的亲缘关系最近，而与乐昌含笑的
亲缘关系最远，这与前两物种在表型上更为接近相一致。本研究可为紫花含笑杂交育种亲本的选配、嫁接繁
殖砧木的选择和种(或品种)的鉴别等提供重要依据。
关键词 紫花含笑,新品种,近缘种,亲缘关系, ISSR分析
Molecular Identification of New Cultivated Varieties in Michelia crassipes
and the Relationship Analysis with Four Relative Michelia Species
Wen Qiang Song Xiaochen Tian Jing Xiao Fuming Jiang Xiangmei *
Jiangxi Provincial Biotech Key Lab for Plant, Jiangxi Academy of Forestry, Nanchang, 330032
* Corresponding author, zjiang2013@126.com
DOI: 10.13271/j.mpb.012.000509
Abstract The identification system for three Michelia crassipes ornamental varieties,‘Heban’,‘Meiban’and
‘Dieban’was constructed based on ISSR (inter-simple sequence repeat) molecular marker. The results demonstra-
ted that three cultivated varieties can be identified by UBC815-1 000 bp, UBC836-1 200 bp and UBC840-460 bp
loci, respectively. Meanwhile, the three varieties can be identified from the other individuals in the species by
UBC844, and the M. crassipes can be identified from the four relative species, i.e. M. figo, M. chapensis, M.
maudiae and M. chapensis by UBC854-1 100 bp. The results showed that the Neis genetic diversity (h) at species
level was 0.312 3 while the Shannons information index (I) was 0.471 2, indicating that the genetic diversity among
the five Michelia species was relatively high. The genetic distance among and within the five species ranged from
0.121 9 to 0.778 7 and the similarity coefficient ranged from 0.459 0 to 0.844 3. Using UPGMA (unweighted pair
group method using arithmetic averages) method, the individuals of different species can be clustered in the same
branch, and it was supporting the traditional classification method at the molecular level. The relationship analysis
for five species showed that M. crassipes was most similar to M. figo, while M. crassipes and M. chapensis was
farthest. And it was according with the relativ e morphologies of the five species. This research can provide a
收稿日期：2013-08-21 接受日期：2013-12-29 网络出版日期：2014-01-27
URL: http://www.biopublisher.cn/index.php/mpbopa/article/view/1744
基金项目：本研究由江西省财政 2006林业重大科技专项“林木良种高效繁育体系研究”资助
图 1 UBC815扩增出“荷瓣墨紫”特异位点
注: 1:金叶含笑; 2:乐昌含笑; 3:深山含笑; 4~9:紫花含笑; 7:
“荷瓣墨紫”, 箭头指为 UBC815-1 000 bp特异位点; 10~12:
含笑
Figure 1 Specific locus of‘Heban Mozi’amplified by UBC815
Note: 1: M. foveolata; 2: M. chapensis; 3: M. maudiae; 4~9: M.
crassipes; 7:‘Heban’, arrows indicate UBC815-1 000 bp specif-
ic band of‘Heban’; 10~12: M. figo
reliable basis for the selection of cross-breeding parental species and identification of varieties in M. crassipes.
Keywords Michelia crassipes, New cultivated variety, Relative species, ISSR analysis
紫花含笑(Michelia crassipes)是木兰科含笑属
(Michelia Linn.)中的一种常绿灌木或小乔木，花色紫
红色，花有似酒或苹果的清香，芳香宜人，花形美观，
开花早，始花期在 2月上旬，花期长达 80 d，花色丰
富、艳丽，能引起强烈的色感效应，具有极高的园林
观赏价值，深受人们喜爱。自然状态下紫花含笑多呈
零星分布，天然资源稀少(刘玉壶等, 1996;曹展波等,
2012)。但紫花含笑种内单株间花色、花形、叶色、叶
形、树形和冠形等性状存在丰富的变异，这为新品种
选育奠定了良好的物质基础。吉利等(2009)以紫花含
笑和灰岩含笑为亲本开展过种间杂交育种研究，并
从 F1代中筛选出了优良观赏新品种；廖菊阳(2007)
从紫花含笑芽变材料中也筛选出了观赏品种。目前
以紫花含笑为亲本选育的新品种，多侧重于植物学
特性介绍和形态特征描述，基于 DNA水平的品种划
分与鉴定尚属空白。
木兰科属种的分类问题是许多学者争论的热点
(孟爱平等, 2006)，而含笑属的系统分类问题更是热
点中的热点(张新华, 2007)。紫花含笑与含笑属内近
缘种间具有较多相似的生物学特性，尤其与含笑(M.
figo)相比，传统分类学者认为，两者的差异主要在于
花色，其次在于紫花含笑的雌蕊群不超过雄蕊群，在
其它外观形态方面两者极为相似，因此，在是否将其
列为种还是变种上，存在争议和分歧。传统种的划分
主要是根据表形性状，但若仅根据表形性状进行分
类，一些种的区分存在困难，如某些近缘种在天然分
布上存在重叠区域，在生殖上也不存在隔离，同时种
内的遗传变异较大，因此，许多形态性状用于种的分
类时并不十分可靠(Fowler et al., 1988)。另外，有些表
形性状的可塑性较大，有的性状的差异仅在一定的
生长发育阶段才表现出来(Donoghue and Sanderson,
1992)，这些都限制了表形性状在种的划分上的可靠
性。尤其对观赏植物来说，在长期栽培和遗传育种过
程中，育成品种的遗传背景通常都很复杂，这就给观
赏植物的起源追溯带来了更大难度。因而，在 DNA
水平上寻求分类依据显得尤为重要。
ISSR (inter-simple sequence repeat)分子标记技术
已广泛应用于植物品种鉴别，属、种、品种等不同分类
单元的亲缘关系分析等(赵谦等, 2007)。本研究旨在
以项目组成员通过多年观察研究选育出的花色艳丽、
花形美观、观赏点突出的 3个观赏新品种“荷瓣墨
紫”、“梅瓣墨紫”和“蝶瓣墨紫”为对象，在形态鉴别
的基础上，建立基于 ISSR标记的 3个新品种与紫花
含笑原种在 DNA水平上的鉴别体系；同时以包括紫
花含笑在内的含笑属 5个种为对象，研究其亲缘关
系，以期为紫花含笑品种或新品种的鉴别、杂交育种
亲本的选配及嫁接繁殖砧木的选择提供分子依据。
1结果与分析
1.1紫花含笑 ISSR扩增条件及多态性引物筛选
从 100条 UBC系列 ISSR引物中筛选出 23 条
扩增谱带清晰、产物丰富的引物；经进一步复筛，从
这 23条引物中选取 12条适合含笑属 5个种扩增的
多态性引物。结果表明，用 12条引物共扩增出总位
点数 122个，其中物种水平的多态位点数 110个，多
态位点百分比为 90.16%。各引物序列参数及扩增位
点数见表 1。
1.2紫花含笑新品种鉴别体系建立
1.2.1紫花含笑 3个新品种分子鉴别
从复筛选出的 12条 ISSR多态性引物中，可用
UBC815、UBC836 和 UBC840 3 条引物的扩增结果
来鉴别 3个新品种。其中：UBC815可扩增出“荷瓣墨
紫”区别于紫花含笑及其它品种的特异位点 UBC815-
1 000 bp (图 1 箭头所示位点)；UBC836 可扩增出
“梅瓣墨紫”区别于紫花含笑及其它品种的特异位点
紫花含笑新品种鉴别及与 4种含笑属植物亲缘关系分析
New Cultivated Varieties in Michelia crassipes and the Relationship Analysis with Four Relative Michelia Species 510
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
表 1 ISSR标记 12个多态性引物扩增结果
Table 1 Amplified results of 12 polymorphic primers on ISSR marker
引物
Primer
UBC807
UBC811
UBC815
UBC834
UBC835
UBC836
UBC840
UBC841
UBC844
UBC849
UBC851
UBC854
引物序列
Primer sequences
AGAGAGAGAGAGAGAGT
GAGAGAGAGAGAGAGAC
CTCTCTCTCTCTCTCTG
AGAGAGAGAGAGAGAGYT
AGAGAGAGAGAGAGAGYC
AGAGAGAGAGAGAGAGYA
GAGAGAGAGAGAGAGAYT
GAGAGAGAGAGAGAGAYC
CTCTCTCTCTCTCTCTRC
GTGTGTGTGTGTGTGTYA
GTGTGTGTGTGTGTGTYG
TCTCTCTCTCTCTCTCRG
总带数
Total bands
6
14
11
6
7
12
14
10
12
8
14
8
多态带数
Polymorphic bands
5
13
11
4
6
10
11
10
12
8
13
7
退火温度(℃)
TM (℃)
56
52
53
54
55
52
52
52
54
58
56
52
图 2 UBC836扩增出“梅瓣墨紫”特异位点
注 : 1~2: 含笑 ; 3~8: 紫花含笑 ; 6: “梅瓣墨紫”, 箭头指为
UBC836-1 200 bp特异位点; 9:深山含笑; 10:乐昌含笑; 11:
金叶含笑
Figure 2 Specific locus of‘Meiban Mozi’amplified by UBC836
Note: 1~2:M. figo; 3~8: M. crassipes; 6:‘Meiban’, arrows indica-
te UBC836-1 200 bp specific band of‘Meiban’; 9: M. maudiae;
10: M. chapensis; 11: M. foveolata
UBC836-1 200 bp (图 2箭头所示位点)；UBC840可
扩增出“蝶瓣墨紫”区别于紫花含笑及其它品种的特
异位点 UBC840-4 60 bp (图3箭头所示位点)。
1.2.2紫花含笑原种与 3个新品种分子鉴别
利用 UBC844引物扩增结果可一次性构建紫花
含笑原种与 3个新品种的指纹鉴别图谱，PCR产物
电泳结果见图 4。电泳图中 4~9号泳道对应供试紫花
含笑样本，6个样本共能稳定扩增出 8个位点，位点
片段长度在 400~1 350 bp之间，其中 6号泳道“荷瓣
墨紫”能扩增出 6个清晰位点，在 1 100 bp与 400 bp
两处缺失；7号泳道“梅瓣墨紫”有别于其他紫花含笑
供试样本的是在 1 200 bp、1 100 bp和 800 bp处缺失；
8号泳道“蝶瓣墨紫”则在 1 100 bp和 1 000 bp两处
缺失。而在代表紫花含笑原种的 3个样本中，4号样
本同时在位点 800 bp和 400 bp两处缺失，5号样本
仅缺失 1 100 bp位点，9号样本则同时缺失 1 100 bp、
1 000 bp和 700 bp 3个位点。由电泳图构建的紫花含
笑新品种鉴别指纹见表 2。
1.2.3紫花含笑及其新品种与同属 4个近缘种的分子
鉴别
用 ISSR多态性引物 UBC854可扩增出紫花含
笑及其新品种区别于 4个近缘种的特异位点 UBC-
854-1 100 bp，结果见图 5箭头所示位点。
1.3紫花含笑种内及含笑属 5个种间遗传多样性分析
采用表 1所示12条 ISSR多态性引物对紫花含
图 3 UBC840扩增出“蝶瓣墨紫”特异位点
注: 1:含笑; 2~7:紫花含笑; 6:“蝶瓣墨紫”,箭头指为 UBC-
840-460 bp特异位点; 8:深山含笑; 9:乐昌含笑; 10:金叶含笑
Figure 3 Specific locus of‘Dieban Mozi’amplified by UBC840
Note: 1: M. figo; 2~7: M. crassipes; 6:‘Dieban’, arrows indicate
UBC840-460 bp specific band of‘Dieban’; 8: M. maudiae; 9:
M. chapensis; 10: M. foveolata
511
图 4紫花含笑与 3个新品种的 UBC844指纹鉴别图谱
注: 1~3:含笑; 4,5,9:紫花含笑 3个原种; 6~8:“荷瓣墨紫”,“梅
瓣墨紫”和“蝶瓣墨紫”; 10:深山含笑; 11:乐昌含笑; 12:金叶
含笑
Figure 4 ISSR fingerprint for varieties amplified by UBC844
Note: 1~3: M. figo; 4,5,9: M. crassipes; 6~8:‘Heban’,‘Meiban’
and‘Dieban’; 10:M. maudiae; 11:M. chapensis; 12:M. foveolata
表 2紫花含笑原种与 3个新品种的 ISSR-UBC844指纹
Table 2 Identifying pattern of ISSR fingerprint for varieties in Michelia crassipes
引物及其扩增位点
Loci of primers
UBC844-1 350 bp
UBC844-1 200 bp
UBC844-1 100 bp
UBC844-1 000 bp
UBC844-800 bp
UBC844-700 bp
UBC844-600 bp
UBC844-400 bp
原种 1
M. crassipes-1
+
-
+
+
-
+
+
-
原种 2
M. crassipes-2
+
+
-
+
+
+
+
+
荷瓣墨紫
Heiban
+
+
-
+
+
+
+
-
梅瓣墨紫
Meiban
+
-
-
+
-
+
+
+
蝶瓣墨紫
Dieban
+
+
-
-
+
+
+
+
原种 3
M. crassipes-3
+
+
-
-
+
-
+
+
注: +:有带;-:无带;原种 1~3: 3个随机的紫花含笑普通个体(紫花含笑原种)
Note: +: With band;-: No band;M. crassipes-1~M. crassipes-3: Three random individuals of M. crassipes
图 5 UBC854扩增出的紫花含笑的特异位点
注: 1~3: 含笑; 4~9: 紫花含笑, 箭头指为紫花含笑 UBC854-
1 100 bp特异位点; 6~8:“荷瓣含笑”,“梅瓣含笑”和“蝶瓣含
笑”; 10:深山含笑; 11:乐昌含笑; 12:金叶含笑
Figure 5 Specific locus amplified by UBC854 in M. crassipes
Note: 1~3: M. figo; 4~9: M. crassipes, arrows indicate UBC854-
1 100 bp specific band of M. crassipes; 6~8:‘Heban’,‘Meiban’
and‘Dieban’; 10:M. maudiae; 11:M. chapensis; 12:M. foveolata
笑及其 4个近缘种的 DNA进行 PCR扩增，扩增结
果用 Popgene32软件进行统计分析。结果表明：含笑
属 5 个种在物种水平上的基因多样度为 0.312 3，
Shannon多样性指数为 0.471 2，说明含笑属 5个种
间具有相对丰富的遗传多样性。结果还表明，紫花含
笑种内水平的基因多样度为 0.179 4，Shannon 多样
性指数为 0.269 0，说明紫花含笑种内个体间或品种
间也存在着较丰富的遗传多样性，这与紫花含笑种
内个体间存在较丰富的形态多样性是一致的，即形
态多样性是 DNA水平遗传多样性的外在表现。
1.4 紫花含笑及其 3 个新品种与同属 4 个近缘种的
亲缘关系分析
采用 NTSYSpc 软件统计分析紫花含笑及其 3
个新品种与同属 4个近缘种的亲缘关系，结果显示，
含笑属 5 个种种间及种内个体间的遗传距离在
0.121 9~0.778 7之间，相似系数在 0.459 0~0.844 3之
间(表 3)。其中，紫花含笑种内个体间亲缘关系存在
一定差异，个体间或品种间的遗传距离在 0.121 9~
0.282 2之间，以紫花含笑 3与蝶瓣墨紫间的遗传距
离最小，以紫花含笑 3与荷瓣墨紫间的遗传距离为
最大。而含笑属 5个种种间的遗传距离则在 0.304 2~
0.778 7之间，在表 3所列的各编号对应材料中，总趋
势显示紫花含笑与含笑的遗传距离最小，而紫花含
笑与乐昌含笑的遗传距离则最大；其他几个种间，以
深山含笑与金叶含笑遗传距离最小。
采用 UPGMA法以遗传距离进行聚类，各分支
节点上数值表示 Bootstrap值，结果显示(图 6)，主分
支 Bootstrap支持率达 100%，表明该分支下样品之
间聚类关系稳定，即含笑属内的 5个种均能明确的
紫花含笑新品种鉴别及与 4种含笑属植物亲缘关系分析
New Cultivated Varieties in Michelia crassipes and the Relationship Analysis with Four Relative Michelia Species 512
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 6 含笑属 5 个种种间及种内个体间 Neis 遗传距离 UPG-
MA聚类图
注: 1:蝶瓣墨紫; 2:紫花含笑 3; 3:荷瓣墨紫; 4:梅瓣墨紫; 5:
紫花含笑 2; 6:紫花含笑 1; 7:含笑 1; 8:含笑 2; 9:金叶含笑 1;
10:金叶含笑 2; 11:深山含笑; 12:乐昌含笑 1; 13:乐昌含笑 2
Figure 6 UPGMA dendrogram based on Neis genetic distances a-
mong and within five species in Michelia
Note: 1: Dieban; 2: M. crassipes-3; 3: Heban; 4: Meiban; 5: M.
crassipes-2; 6: M. crassipes-1; 7: M. figo-1; 8: M. figo-2; 9: M.
foveolata-1; 10: M. foveolata-2; 11: M. maudiae; 12: M. chapen-
sis-1; 13: M. chapensis-2
按传统分类法进行划分，同种的不同个体均能很好
地聚在同一种下，在分子水平上具有明确的证据支
持对含笑属 5个种的传统分类；即便如含笑与紫花
含笑在形态上极其相似，两物种分支节点支持率也
达 72.5%，ISSR分子检测的遗传距离足以将两者明
确地分为 2个种。另外，从种间遗传距离来看，以遗
传距离 0.41为阙值，可将 5个物种分成 3大类，首先
将乐昌含笑与其它 4个种分开，单独聚成 1类，深山
含笑与金叶含笑聚成 1类，而含笑与紫花含笑则聚
成另一类。试验数据显示，紫花含笑与含笑的亲缘关
系最近，这与两个种在表型上更为接近相一致；其次
与金叶含笑有较近的亲缘关系，这可能与这 2个种
在叶片、叶柄、枝条等上均被毛有一定的相关性；再
次是深山含笑；与乐昌含笑的亲缘关系最远。说明含
笑属种间亲缘关系存在一定的差别。
2讨论
花的形态特征、叶的着生方式及是否具有托叶
痕一直以来是含笑属植物分类的主要依据(孙卫邦和
周俊, 2004)。然而含笑属植物种类从原始到进化，各
部形态特征变化幅度较大，且存在较多中间过渡类
型(刘玉壶, 1984)。此外，该属大部分物种均可作为园
林绿化树种，长期人工栽培的选择作用使该属植物
种间及种内存在较为丰富的遗传变异，因而在园林
品种选育中仅依据形态学来区分种或品种较难，尤
表 3含笑属 5个种种间及种内个体间遗传距离与相似系数矩阵
Table 3 Neis unbiased genetic distances and similarity coefficient among and within five species in Michelia
编号
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
1
0.169 3
0.361 4
0.409 6
0.338 1
0.361 4
0.361 4
0.361 4
0.409 6
0.726 5
0.555 5
0.422 0
0.422 0
2
0.844 3
0.304 2
0.349 7
0.397 3
0.397 3
0.373 2
0.373 2
0.422 0
0.709 7
0.541 3
0.385 2
0.338 1
3
0.696 7
0.737 7
0.260 7
0.282 2
0.260 7
0.239 7
0.239 7
0.473 3
0.778 7
0.541 3
0.409 6
0.361 4
4
0.663 9
0.704 9
0.770 5
0.239 7
0.260 7
0.239 7
0.282 2
0.447 3
0.709 7
0.569 9
0.434 6
0.409 6
5
0.713 1
0.672 1
0.754 1
0.786 9
0.239 7
0.239 7
0.239 7
0.473 3
0.584 5
0.486 5
0.434 6
0.385 2
6
0.696 7
0.672 1
0.770 5
0.770 5
0.786 9
0.239 7
0.260 7
0.500 0
0.709 7
0.513 6
0.385 2
0.409 6
7
0.696 7
0.688 5
0.786 9
0.786 9
0.786 9
0.786 9
0.121 9
0.473 3
0.709 7
0.569 9
0.460 2
0.434 6
8
0.696 7
0.688 5
0.786 9
0.754 1
0.786 9
0.770 5
0.885 2
0.447 3
0.676 9
0.541 3
0.460 2
0.434 6
9
0.663 9
0.655 7
0.623 0
0.639 3
0.623 0
0.606 6
0.623 0
0.639 3
0.676 9
0.599 3
0.361 4
0.315 4
10
0.483 6
0.491 8
0.459 0
0.491 8
0.557 4
0.491 8
0.491 8
0.508 2
0.508 2
0.271 4
0.599 3
0.660 9
11
0.573 8
0.582 0
0.582 0
0.565 6
0.614 8
0.598 4
0.565 6
0.582 0
0.549 2
0.762 3
0.473 3
0.527 4
12
0.655 7
0.680 3
0.663 9
0.647 5
0.647 5
0.680 3
0.631 1
0.631 1
0.696 7
0.549 2
0.623 0
0.198 9
13
0.655 7
0.713 1
0.696 7
0.663 9
0.680 3
0.663 9
0.647 5
0.647 5
0.729 5
0.516 4
0.590 2
0.819 7
注: 1:含笑 1; 2:含笑 2; 3:紫花含笑 1; 4:紫花含笑 2; 5:荷瓣墨紫; 6:梅瓣墨紫; 7:蝶瓣墨紫; 8:紫花含笑 3; 9:深山含笑; 10:乐
昌含笑 1; 11:乐昌含笑 2; 12:金叶含笑 1; 13:金叶含笑 2;遗传相似系数:右上部分;遗传距离:左下部分
Note: 1: M. figo-1; 2: M. figo-2; 3: M. crassipes-1; 4: M. crassipes-2; 5: Heban; 6: Meiban; 7: Dieban; 8: M. crassipes-3; 9: M. maudi-
ae; 10: M. chapensis-1; 11: M. chapensis-2; 12: M. foveolata-1; 13: M. foveolata-2; Genetic similarity coefficient: The upper-right part
of the table; Genetic distance: The lower-left part of the table
513
其给商品苗的鉴别带来一定的困难。本研究采用
ISSR分子标记技术对紫花含笑种内个体及品种间进
行鉴别，同时与其同属内的 4个近缘种进行比较，结
果显示，只用 UBC854-1 100 bp一个标记，就可将紫
花含笑与其他 4个种区分开来，该标记有望未来进
一步开发为 SCAR标记，应用于紫花含笑种的甄别；
同时获得的 UBC815-1 000 bp、UBC836-1 200 bp及
UBC840-460 bp特异位点，可将“荷瓣墨紫”、“梅瓣
墨紫”和“蝶瓣墨此”3个紫花含笑新品种区分出来，
而仅用 UBC844标记构建的 DNA指纹可一次性将
3个新品种从原种中鉴别出来，以上研究结果可为紫
花含笑新品种知识产权保护奠定良好的技术基础。
近年来，含笑属的系统分类问题依然存在争议
和分歧。含笑属目前存在两套分类系统：刘玉壶系统
(刘玉壶等, 1996)及 Nooteboom&Chen系统(Chen and
Nooteboom, 1993)。前者将含笑属分为含笑亚属(su-
bg. Micheli)和后生含笑亚属(subg. Metamichelia) 2个
亚属，其中：含笑亚属又分为含笑组(sect. Michelia)与
肖含笑组(sect. Micheliopsis)；后生含笑亚属又分为双
被组(sect. Dichlamys)和异被组(sect. Anisochlamys)；
而后者的系统中次级划分与前者相同，但对属内植
物种作了大量的归并，认为从属于后生含笑亚属的
异被组的大部分物种应与含笑组进行归并，而保留
的异被组中仅剩香子含笑(M. hedyosperma)一种，同
时还对双被组及肖含笑组中的某些种进行了合并，
如将肖含笑组中的紫花含笑作为含笑的变种处理。
本研究利用 ISSR分子标记技术初步开展了含笑属 5
个近缘种的系统发育关系分析。依照刘玉壶的分类
系统，本研究材料包括含笑亚属肖含笑组的含笑与
紫花含笑 2种，后生含笑亚属双被组的乐昌含笑，以
及异被组的金叶含笑和深山含笑 2种。结果显示，5
个种的基因多样度为 0.312 3，同时种间遗传距离在
0.304 2~0.778 7之间，反应了含笑属内种间具有较宽
幅的遗传变异，这与其属内种间丰富的表型变异一
致。遗传距离的 UPGMA聚类分析结果表明，含笑属
5个种聚成 2大类：将后生含笑亚属双被组的乐昌含
笑单独聚成 1类，而将该亚属异被组的金叶含笑和
深山含笑、含笑亚属肖含笑组的含笑与紫花含笑 4
个种聚成第二大类，结果显示从属于刘玉壶系统异
被组的金叶含笑和深山含笑与含笑亚属物种具有较
近的遗传关系，支持 Nooteboom & Chen系统的分类
方法；对 4个种聚在一起的大类进一步细分，即将肖
含笑组的含笑与紫花含笑聚成一类，而异被组中的
金叶含笑和深山含笑聚成另 1类，显示后两者遗传
关系更为接近，这一结果支持包淑云等(2002)的研
究。包淑云等(2002)在对含笑属叶片解剖学的比较研
究中发现，与含笑组植物不同，异被组中深山含笑、
金叶含笑等物种叶片厚度一般大于 200 μm，且上表
皮具下皮，可见相近的遗传关系正是两者形态特征
更为接近的主要原因。此外，本研究中对于紫花含笑
与含笑两种的聚类分支节点支持率达 72.5%，同时种
内的遗传距离小于种间水平，因而支持将紫花含笑
作为独立的种而非含笑变种的分类方法。
3材料与方法
3.1试验材料
供试材料包括项目组选育的紫花含笑 3个观赏
新品种“荷瓣墨紫”(Heban)、“梅瓣墨紫”(Meiban)和
“蝶瓣墨紫”(Dieban)，品种来源于紫花含笑的自由授
粉后代中花型、花色表现特异的不同个体，经无性系
繁殖后性状稳定、一致，已审定为省级良种。紫花含
笑的 4个近缘种包括含笑、乐昌含笑(M. chapensis)、
深山含笑(M. maudiae)及金叶含笑(M. foveolata)。3个
紫花含笑品种随机选取 1株无性系单株作为各品种
的代表植株，同时从紫花含笑自由授粉实生苗中随
机选取 3株代表紫花含笑原种；4个近缘种每种随机
采集 1~2株作为代表该植物种的试样。试验材料均
采自江西省林业科学院木兰科植物基因库中。
3.2试验方法
3.2.1总 DNA制备及 ISSR-PCR反应体系建立
总基因组 DNA采用改进的 CTAB高盐法提取
(温强等, 2006)。通过单因素优化试验，筛选出含笑
属植物 ISSR-PCR的适宜反应条件：在 20 μL反应
体系中，包含 50 ng DNA模板，2.5 mmol/L的 Mg2+，
0.20 mmol/L 的 dNTPs，0.5 μmol/L 的引物，1 U 的
Taq酶。扩增程序经优化后为：94℃下预变性 3 min；
经 38个反应循环，包括：94℃变性 30 s，在引物相应
退火温度下退火 45 s，72℃延伸 90 s；最后 72℃延伸
7 min。在 PTC-200温度梯度 PCR仪(Bio-Rad公司)
上进行 PCR扩增反应。用来构建含笑属种及紫花含
笑品种指纹的 ISSR引物序列来至 UBC系列引物。
引物由生工公司合成，所用酶及试剂来自于宝生生
物公司。PCR扩增产物采用 1.5%琼脂糖凝胶电泳进
行检测，以 GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (Ther-
mo)作为标准分子量参考，电泳产物采用 BIO-RAD
凝胶成像仪观察拍照。
紫花含笑新品种鉴别及与 4种含笑属植物亲缘关系分析
New Cultivated Varieties in Michelia crassipes and the Relationship Analysis with Four Relative Michelia Species 514
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
3.2.2数据整理和统计分析
ISSR扩增谱带按 1/0进行数字化处理，统计谱
带，有带记为“1”，无或条带模糊不清记为“0”，最终
得到 1/0数据矩阵。同时，根据分子量大小标准标记
可用于比较种间及种内个体间差异的特征谱带。利
用 popgen32软件(Yeh et al., 2000, http://www.ualber
ta.ca/~fyeh/popgene.pdf)计算基因多样度及 Shannon
信息指数等遗传参数。采用 NTSYSpc Version 2.10
软件(Rohlf, 2004)的 SIMQUAL (similarity for qualitat
ive data)法计算种间及种内水平的遗传相似系数(F)，
其中 Nei的遗传相似系数、遗传距离的聚类参考温
强等(2008)的方法。同时，基于 Nei 遗传距离(Nei,
1978)，利用 TFPGA软件(Miller, 1997, http://www.ccg.
unam.mx/~vinuesa/tlem09/docs/TFPGADOC.PDF)对
各样品进行非加权平均成组配对法(unweighted pair
group method using arithmetic averages, UPGMA)聚
类分析，绘制各样品间的遗传关系树状聚类图，并对
聚类图进行 Bootstrap分析，重复 1 000次抽样运算，
以此评价聚类图中各分支的支持率。
作者贡献
温强是本研究的实验设计和实验研究的执行
人，并完成论文初稿的写作；宋晓琛、田径和肖复明
参与实验设计，试验结果分析；江香梅是项目的构思
者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与
修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由江西省财政 2006林业重大科技专项
“林木良种高效繁育体系研究”资助。江西省赣州市
龙南县荣华苗圃在本研究的紫花含笑新品种试验材
料采集方面给予了大力支持，在此表示感谢。
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《基因组学与应用生物学》征稿启事
《基因组学与应用生物学》由中国农业大学教授李宁院士任主编，北京大学教授朱玉贤院士和海南省热
带农业资源研究所所长方宣钧博士任执行主编。
本刊设置固定栏目和随机栏目。固定栏目常设研究论文和研究报告，主要发表最新的原始研究成果。随
机栏目根据稿源可能设研究资源、数据分析、技术专题和评述与展望等栏目，还可能设置刊登有关科学新
闻、科技简讯、专利、短评和书评等方面的栏目。今天特向您征集：
研究论文：报道相对比较完整、全面的原始研究工作，其结论代表着在一个重要问题的认识上有了实质
性进展，并且具有及时而深远的影响。论文篇幅要求在 8个印刷页面以上。
研究报告：简洁报道有重要结果的原始研究工作，其重要性意味着其它领域的科学家对本研究结果也
有兴趣。论文篇幅要求在 6个印刷页面左右。
评述与展望：告诉广大读者在生命科学、医学、农业科学和环境科学等领域最新的重要进展。论文篇幅要求
在 6个印刷页面左右。
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