全 文 ：微 生 物 学 报 2 4( 4): 3 15一 3 9 1, 1 9 8 4
A e r口 M i c r o 石i o l o g i e a iS n i ca
沙棘和胡颓子属根瘤放线菌的分离和回接
杨慧凡 蒋建德 黄家彬 朱宝琴
钟玉华 刘惠昌杨碧芳 赵振英
(中国科学院林业土壤研究所 , 沈阳 )
从胡颓子属 ( E I“ 。 a g o u , ) 黄果沙枣 ( E l a e a g , ,` 5 o x 夕`二 ,夕 a S e h l e e h t . ) 根瘤上分离得 , }放线
菌 F,` 。 左, a s p · oE c s , 、 F r a碱` a s p · oE c 8 1 1。 从沙棘 ( H , 户。 户h a。 ,·为a , , ,。 o记 e , ) 根瘤 。11分离得
到放线菌 F r a碱 i口 s p . H r e 9 7 、 rF a碱 i a s p · H r e 9 2 2 。 又从多花胡颓子 ( E la o a g , ,` s , ,宋 u l z i j l o r “
、 , a r . o , a z a
) 及角花胡颓子 ( E l a。叮 , 。 , 窟。 。 , a , t`。 ) `的根瘤中分离得到 石 r a n友t 、 , , . E , , 1` , e z Z r l
和 斤阴杠。 sP . E g c l 盯 , 均获得纯培养。 用光学显微镜和扫描电镜观察其形态特征 , 确认是
属具有抱囊的放线菌 。 该菌慢生长型 ,无气生菌丝体 ,基内菌丝体发育好。 液体培养 ,在底部生
长 ,属于微好气性 。 抱囊形状不规则 , 囊内包着大量的不游动的抱囊抱子。 菌丝分枝有阳 , 粗
细不匀 , 革兰氏阳性 。 将分离菌 勘 c 8 5 、 ocE 5 1 1 、 H r e 9 7 、 E n 、 o e 1 2 z x 、 E g c l , ) 7 回接其宿
主 , 均感染结瘤 。 根瘤的乙炔还原活力分别为 : 6 . 0 5 、 2 · 6 “ 、 0 . 6 3 、 7 . 1 5 、 3 · 5 , 户 , , , ` , l C 2 1 , ; / g ·
鲜重 · h o
关键词 沙棘 ;胡颓子属 ;弗兰克氏菌
自从 19 7 8年由美国的 C a ! l a h a m 等首
次从香旅木根瘤中分离出 内生 菌之 后 〔lJ ,
在许多国家 也相继分离得到 .)F an 尽。 菌的
离体培养 。 1 9 81 年我们用蔗糖离 心 法 从
四川恺木根瘤中分得第一株纯培养的 rF a -
刀尽“ 菌 。 19 8 2 年又曾多次从非豆科 固 氮
树木根瘤 中获得 rF 助砂召 放线菌 。 用所分
得的菌株 , 回接到原宿主苗木 , 形成根瘤 ,
有固氮活性 。
材 料 与 方 法
(一 ) 树木根瘤
黄果沙枣 ( E l a 。 。 g , , , , o ` , c a r夕a s c h l e c h t · ) 、 沙
棘 (月萝, , o户 “ 。 r乃 a二 , o id 。 ) 根瘤采自温室外沙
培盆栽的三年生苗木 ;多花胡颓子 ( E . 二ul ift ;lo `
v a r
.
o , a ` a
) 和角花胡颓子 ( E . 9 0 。 , a , t` 。 ) 根瘤
是取自温室内土培盆栽的三年生苗木 , 当年形成
的根瘤。
(二 ) 分离方法
取新鲜根瘤 ,洗净 ,在 0 . 1% 酸性 斤汞溶液中
表面灭菌 5一 10 分钟 ,用无菌水冲洗除去消毒剂 。
切下根瘤瓣 , 置于研钵中研磨 , 加少许无菌水 , 研
匀 , 通过玻璃棉滤去根瘤碎片 。 取滤液稀 释至
20 一 30 倍「” 。 再取稀释液 1一 2 滴接种于琼脂斜
面或平板上 ,在 26 一 28 ℃ 培养。 也可用 0 . 1% 澳
水表面灭菌 ,将根瘤切成薄片 ,置 f 琼脂斜而或 平
板上 。
培养基 : 用 Q M O D 的基本成分 , 加 少 准 微
量元素和维生素等 〔 ’ 一 , ’ 。
(三 ) 回接宿主试验
1
. 宿主幼苗的培育 :
将黄果沙枣种子用热水浸泡 , 过氧化氛消毒
10 分钟 , 播种于水洗过并灭菌的沙子上 , 待 长出
幼苗 , 移至 s i d e r i s一 , o u n g l / 2 氮营养液的水培瓶
中培养〔` J。 待幼苗根系生长正常时 , 即用于回接
试验 。 沙棘 、 角花胡颓子 、 多花胡颓 子采用水培
插条的幼苗 , 待很系生长至 6一丁cn 、 时 ,用于回接
试验 。
本文于 I q 8 3年 3 月 2 3 日收到。
扫描电镜照片由毕庶春同志拍摄 , 谨致谢意 。
DOI : 10. 13343 /j . cnki . wsxb. 1984. 04. 005
微 生 物 学 报 2 4卷
回接试验所用之容器与营养液均经灭菌 。
2
. 回接感染试验 :
取纯培养 1一 2个月的分离菌 , 用无菌水洗掉
菌体上的培养基 ,而后研匀 , 加少量无菌水 , 接种
于幼苗根系上 。
将接种 肠 c 85 、 玩 s n 菌株的黄果 沙 枣
幼苗栽于二种基质上 : 一组 用无氮 水培 ; 另一
组栽于经水洗过 , 高压灭菌的膨化珍珠岩上。 对
照不接菌 。 沙棘 、 多花胡颓子 、 角花胡颓子接种分
离菌后 , 分别栽于水培瓶或珍珠岩基质上 ,对照不
接菌 。 以上苗木均以无氮的 s ide r i、 一 y o u n g 营 养
液浇灌 。
上述试验在控制生长环境的培养室 中培养。
光一暗循环分 别 为 1 6一 8 小 时 , 昼 夜温度 18 一
2 5 ℃ , 光照为 2 , 5 0 0一 3 , 6 0 0 L u x ( z D 一 l [ 型照度
计 ) 。
结 果
(一 ) 分离菌的一般特征
1 9 8 2 年 8一 12 月先后用系列 稀 释 法
和切片法从黄果沙枣根瘤中分离得到 2 株
放线菌 , 定名 F r a n友i a s p . E o c 8 5 、 F , 4 a n左i a
sP
·
Eoc 8 1 1
。 从沙棘根瘤中分得二株内生
菌: F r a n 夜i a s p . H r c 9 7 、 F r a , ,女1 7 s p . H r e
9 2 2 。 从角花胡颓子与多花胡颓子根瘤上
分离出内生菌分别为 : F ,· a n左i a s p · E g c 1 0 7 、
F r a n友i。 : p . E m o e 1 2 1 1。 它们的形态特征基
本相似 。 2一 3 周长出肉眼可见 的 白色菌
落 ,致密 ,呈丝状放射形生长 。 基内菌丝体
发育好 , 无气生菌丝体。 液体培养在底部
呈团絮状生长 ,培养液不混浊 , 该菌属微好
气性 , 慢生长型 , 革兰氏染色阳性 。 经光学
显微镜和扫描电镜观察 , 确认是属于具有
抱囊特征的放线菌 。 它们的形态特征是 :
菌丝弯曲 , 分枝有隔 ,粗细不匀 , 直径 0 . 6一
1
.
4 拜m , 菌丝中间或末端 膨 大形 成 抱 囊
(图版 卜 5 、 6 ) 。 抱囊形状呈不规则 的 圆
形 、 椭圆形 、锥形等 ,大小不一 , 通常约 3一
35 产m , 表面不光滑 , 有的有粗大的抱囊柄 ,
柄上有横隔 (图版 I一 1一 3 及图 l 一 2 ) 。 成
熟的抱囊壁破裂释放出大的抱囊抱子 , 抱
子呈不规则的圆形 , 不游动 , 直径 1 . ,一 2
脚 (图版 I一 1 , 图 l 一 l ) 。 泡囊体 ( v e s i e les )
表面呈光滑的球形或卵形 , 着生在菌丝体
一侧的细小分枝上 (图版 I一 4 、 6 )直径 3一
4挤m 。 在诱导培养基上 , 有固氮酶活性 。
表 1 回接宿主感染结启和苗木生长情况
1
’
a b l e 1 N o d u l a t i o n a n d g r o w t l
l o f r e in f
e e t e d h o ,污
宿 主 名 称 生 长 雀质 菌株名称 结 )南数 苗木生长 乙炔还原 试验株数
(个 /株 ) 活力株高 性熏 拜 r n o l接菌情况 ( c 互n ) 气 g 声 c Z H ; /
g
· 鲜重 ·
1l
黄果沙枣 膨化珍 { : 。 。 8 5 接菌 4一 5 斗5 1
. 丁5 6 . 0 5 6
E
.
o r 夕 r , ` ,· P a 珠岩 J三o e 8 1 1 接菌 2一 3 4 0 ] . 任5 2 . 6 8 斗
对 照 不接菌 0 2 8 1 . 0 0 5
沙 棘 水 H r e 97 接菌 9一 1 1
:; : :
0一, :H . r力a 夕刀 n o i d亡` 对照 不接菌 0
角花胡颓子 水 Eg c 10 7 接菌 ,石8 4 . 5 , `: ’ `:E . 9 0 刀 y口 刀 z力打 对照 不接菌 2 5
多花胡颓子 膨化珍 Em o e 12 1 1 接菌 6一 7 4 5 7 . 5 7 . 1 5
:E . 二 “ I t矛j l o r a v a r . o v a t a 珠岩 对照 不接菌 U 3 4 6 . 1 0
注 : 表中数值以平均值计算 ;每个感染处长出的所有瘤瓣算一个瘤。
4期 杨慧凡等 :沙棘和胡颓子属根瘤放线菌的分离和回接 317
入 `
图 1 1.价 a。天萝 a, p . H r e 9 7 有柄的抱襄及抱弃壁破裂释放出抱囊抱子 ( 又 52 0) ; 2 . 介` ” 及` . , p . E m oc
12 1 有柄的抱襄与不规则的回形抱囊 ( 又 6 6 0) ; 3 .沙棘接种 rF 。 左抽 sP . H cr 97 感染结瘤株 (左 ) 与对照
株 (右 )的生长情况 ; 呼, 沙棘根系接菌感染形成的根瘤 ; , .黄果沙枣接种 rF a , 几抽 sP . oE o 8 1 感染结瘤株
(左 )与对照株 (右 )的生长情况 ; 6 .黄果沙枣根系接菌感染所结的根瘤。
F ig
.
1 1
.
T h e s p o r a n g ia w i t h , p o r a
:、 g io p h o r o o f F r a , 左f a s p . H r e 9 7 a n d t h e s p o r e s r e l e as e d f r o m
a b r o k e o s p o r a n g i u m ; 2
.
T h e s p o r a n g i a w iht
s p or
a n g i o p h o r e a n d th e s p h e r i c a l a n d i r r e g u l a s p o r a n g i`
o f rF
。 ,几10 s p . E m o e 12 1 1; 3 . 仆 e g ot w ht o f , o d u la t e d p l a n t 川 P户。户h a 。 , 为a二 , o i d。 ( l e f t ) b y in f e ·` d o n o f 价。 。天i a s p . H r c 9 7 a n d o f 比 。 co n t o l p la n t ( r ig h t ) ; 4. T h e n o d u i e s i n t h o r o o st o f 凡 .
r 汤a , . 记“ a ft e r in o c u l a t i o n ; 5 . T h e Bt o w ht o f n o d u la t e d p la o t E · o即 c` r户口 s c h l e c h t· ( l e f t ) 勿
`山“ 如 。 o f 斤。 . 左10 s p . 助 e 8 1 1 a dn o f ht e e o n tr o l p la n t ( r ig h t ) . 6 . 孔 e n o d u le s i n t h e r o o . o f
石 . 0勺 ` ar Pa 阮 h lac h t . a饭 r i眠 u la it o n .
微 生 物 学 报 2呼 卷
( 二) 分离菌回接宿主试验结果
用分离菌 H c r9 7、 E gc1 0 7、 E o c m1 21 1 回接至原宿主幼苗 , 培养四周观察 , 均已形
成幼小根瘤 ,对照株未结瘤 。
Eoc 85
、
E oc 8 1 菌株回接于黄果沙
枣幼苗 , 无氮水培 4一 8 周 ,调查根系 , 无浸
染结瘤 。 但另一组幼苗接种分离菌后 , 栽
培在膨化珍珠岩上 , 四周时 ,每株根系上都
长出幼龄根瘤 , 不接菌对照株未结瘤 。 8
周后 ,调查浸染结瘤与生长情况 ,同时测定
根瘤的乙炔还原活力 , 结果见表 l (图 卜
3一 6 ) 。 实验结果证明 ,所分离得到的纯培
养菌是属有浸染性的共生固氮型弗兰克氏
属 ( F r a吐i a s p p . ) 放线菌 。
生态生理特性有关。 沙棘苗木接 种分 离
菌 , 用无氮水培 , 成功地感染结瘤 。 但是 ,
根瘤生长缓慢 , 所测得乙炔还原活力 ,显然
较黄果沙枣为低 。
3
. 所分离出的胡颓子属和沙棘属的根
瘤内生菌 , 纯培养菌的形态特征 与 lA nu ,
属的内生菌相似 , 与文献报道 的 rF 朋砂“
属的标准种符合 1 ,.7 8] 。
参 考 文 献
讨 论
1
. 在液体培养基中 , 抱囊的形成因宿
主而异 。 例如 : 黄果沙枣与沙棘内生菌 ,
培养 1一 2 个月观察 , 大抱囊较少 , 多是菌
丝与膨大的菌丝体 。 多花胡颓子与角花胡
颓子的内生菌则不同 ,与斜面培养一样 , 形
成较多的大抱囊 。
2
. 黄果沙枣幼苗 ,接种分离菌 ,用无氮
水培法 , 经二批试验均无感染结瘤 。 而在
膨化珍珠岩上生长的幼苗 , 接菌后 ,容易感
染结瘤 。 这可能是与胡颓子属的沙枣 , 能
在干旱痔薄土地上生长 , 不耐水湿条件的
[ 1 ]
[ 2 ]
[ 3 1
[ 4 ]
[ 5 ]
[ 6 ]
[ 7 ]
[ 8 ]
Cal
a ham
,
D
.
e t a l
.
: S c ie n c e
,
19
: 8 9 9一902 ,
1 97 8
.
G u a t h ie r
,
D
.
e t al
.
: A PP I
.
E
n p i r o n
. 似 ic r o -
b i o l , 41 : 306一30 8 , 198 1 .
L a l o n d
,
M
.
a n d H
.
E
.
C a l v e r t : S y m b i o t ic
N i t r
o g e n Fix a t i o n in t h e M a
n a g e m e n t o f
eT m p
e r a t e oF
r e s t s (
e
d
.
b y G o dr o
n ,
J
.
C
.
e t
a l
.
)
,
O r e g o n S t a t e U苗v e r s i t y P r e s s , o r e -
g o n
,
1 97 9
,
PP 95一 1 10 .
B lo m
,
J
.
e t a l
.
: F EM S M ic
, o b io lo舒 L e t t e r s ,
9 : 1 3 1一 13多, 1 980 .
Q u ls P el
,
A
.
a n d A
.
J
.
P
.
uB
r别芬a f : C u r ·
r en t P er s pe
e t i v es in N i tor g en iF ax it
o n , (
e d
.
b y iA an
,
H
.
an d E
.
N七w ont )
,
uA
s t r a lia n
A e a d e m y o f S e ie n ce rP es
s , 0 功悦 r a , 1 98 1 ,
P P
.
2 2 9一2 36 .
E
.
J
. 休伊特 (崔激等译 ) : 《 植物 营养研究 的
砂培与水培法 , , 科学出版社 , 北京 , 91 页 , 1 9 6 5。
W h e l
e r , C
.
T
.
: C u r r e n t P e r s Pec t i v e s in
N it r o罗n F ix a t io n ( e d . b y lA a n , H , a n d E .
N ew
t o n )
,
A u s t r a l ia n A c a d e m y o f S e ie n e e
P er s s
,
Can b
e
r a
,
198 1
,
P P
.
252一2 56 .
B a k e r
,
D
.
e t al
.
: C a ,
.
J
. 妊 ic r o b i of . , 26 :
1072一 1 0 8 9 . 1 980 .
弓 期 杨慧凡等 :沙棘和胡颓子属根瘤放线菌的分离和回接31 9
I I T O S L AON N A DI N E ROI N T C U O L AON T EF Y E H O S P DOF
石叮尸尸 O PH滩 E RH通拟万I O DN E E S A DL AE A GN U S
Y :i ng Hj t li fa nJi a ngi Ja i i d eH ua ngi Ja b i ng
Z h n ugY
uh ua i LuH uih ca ngYa ngB i i f kng
Z h uRa o qi n
自
Z }i a oZ h oi lyi ng
了I 脚功翻 e / 0F o e s r卿 翻 d Ped o lo君 , , A “ J e牌动 万动 ,矶 勃阴押枯)
T h e e n d o P h y t e , F r a竹介艺a sP . E倪 8 5
a l l d F r a n k ia s P
.
E o o 8 1 1 w e r e s u e o e s s f u n y
i、司 a t e d f r o , n r o o t 1 1 0 (1, 210 o f E l a e a g ” 倪 s
o劣 , e a r尹a S e h l e o h t . T h。 。 n d o P I飞y t朗 外 a ” -
k乞a s p . I l r e 9 7 a n d F , · a ,去无ia sP . H r e 9 2 2
w o r o i s o l a t e d f r脚 H乞P尸o P h a e 犷无咖乙” o f d e s .
T h e e n d o P h对.es F r a ” 无艺a s P . E m o e 1 2 1 1
。 r l d F r a 怜无该a s P . E g e 1 0 7 w e r e is o l a et d
f r o n l E l a e a g 、 , ` s ” 。 ,。 I t坛f乙o r a v a r . o ” a t a a n d
E l a ` a 口, ` ,` 5 9 0 , 似 a 、 才h e s . U i l d e r t h e li g h t an d
、 e a , I n i一19 e l e e t r o n ,一11( 1· ( )、 (· ( . P e , a f t e r e u l -
t i v a t e d f o r o n e
一
t wo m
o n t h s
, a l l o f t li e m
w e r e id e n t i f i e d 拐 t h e A e t i , 、 o m理 e t e s w iht
s P o r a n g i a
.
T h e y b o l o n g t ( ) s l o w
一
gT
o初 n g
yt P。
, 诚 t h 「o u t a e r i a l m y e e五脚 , 诚 ht w e l l
d e v e l o 一〕 。 d 、 、 lb 、 t r a t e m y e e l i u n l , i n l i q u i d
m e d i a 9 1
、
o 从 , i n g in t h e b o t t o m , a n d t h e r e f
-
o r e 念瓦r e l zl i e r o a份 o P·于飞注1泣e . 日r) ( ) z、 : f 了l g ia 二l r 。
i r e gU l
a r , a n d ht 时 e a r 。 :门、 ) t · o f i m , n ( ) 1 11; ”
s p时朗 i n t h脚 . 11乃尸 p j l , , e b r , 1 1一。 } ]一`1, s 。、 l ) -
恤et , G疏m 一 p o 啦饭v e . T I一。` e c 资v ; : 1· ; ,《 · t o r i s t i c。
a r e 5 12、 l i l a r t o 恤 e F , , a 牲无i a 即P . l ) x· 、、 \ , i` )胎 l y
r印 o r t e d .
W h
e n t l z e r O ts o f , e o d li l l g 、 ( ) f }l拐 t
P l a n tS w e r e i n f e e t e d b y E O e 8 5 E o
、 8 1 1
H此 9 7 , E m o e 12 11 an d E卿 1 () 7 , 份一e 刊 o t
n o dul 图 w e r e f o r m e d 〔) , 1 t h e m . T h e i r n i -
t r o g e n韶 e a e t i v i沈i e 、 ( t , 2 1 1: r e d u e t i o n ) :、悦
6
.
0 5
,
2
.
6 8
,
0
.
6 3
,
7
.
1 5 a l ; 〔 1 3
.
5 3 (厂: 11 : “ m o ]“ /
f r
.
g /h )
.
K e y w o r d s
H了P P o夕h a e r h a , , ` 1 00 1。了。、 ,. E la e o g外林 ` ;
F 犷 a ?之无心
杨慧凡等 :
Y an g Hu if
an
沙棘和胡颓子属根瘤放线菌的分离和回接
et a l
.
:Is ol
at i on andr eiu c n olat i n o of n ed
op hy r es of HI PP oPh a
e
。 nd E la eag刀u ,
图版 1
,
·
h a切 n o i d已
P!
a t e l
l
.
F , a n左i a s p . 助 c 8 1 1 大抱囊的表面形态 ( 宿主 : 黄果沙枣 , x 3 , 0 0 0 ) ; 2 . F r a 。友r a , p . E m o e 1 2 1 1 大
抱班的表面形态 (宿主 : 多花胡颓子 , 又 3 , 0 0 0;) 3 . F o n 左扭 sP . 几。 1 07 发育中的抱囊 (宿主 : 角花胡颓
子 , 丫 3 , 0 0 0) ; 4 . F r a n 天i a , p . H , e 9 7 泡囊体着生在菌丝体的一侧 (宿主 : 沙棘 , 又 10 . 0 00 ) ; 5 . F , a 。 及i a
, p
.
H r e 9 7 菌丝膨大形成 早期 无隔的抱囊 ( 宿主 : 沙棘 , 义 3 , 0 0 0 ) ; 6 . F r a 。夜i a s p . E m o c 12 1 1 发育初期
的抱囊形 态 (宿主 : 多花胡颓子 , 义 5 , 0 0 0 ) 。
l一 ’ h e s u r f a c e . 1、 o r p h o l o g y o f , , , a c r o s p o r a g n : a o f F , a n 左i a s p . E o c 8 1 1 ( H o s t: E . o即 e a r P a s e h l e e h t . ) ;
2
.
`
r h 。 , u r f a e e m o r p h o lg 犷 。 f o l a e r o : p o r a o g i a o f 厂, a n 友i a , p . E , n o c 12 1 1 ( H o : 七: E . 二 “ lit f io ar v a r ,
o ` ,a t a
)
; 3
.
D
e v e l o p i n g s p o r a n g i a o f F , a , 左i a s p . f g c 10 7 ( H o , t : E . 9 0 。 夕a n t h 。 : B o n t l、 ) . 4 . v e s i c l e s o f
F r a 。 天i a 5 1、 . H r e 9 7 , f o r : 、 , e d o n t h e s id e o f 11 y p h a e ( H o , t : H . r h a , 。 o , d 。 , ) ; 5 . ’ r l l e e a r l y s p o r a n g i a
0 f F r a n 友i a , p . H r e 9 7 w i r l l o u t s e p t a , f o r m e d b y , w o l l e n h y l〕 h a e . ( H o s t : H . , 人a 。 。 o i d e s ) : 6 . r h e
s p o r a n g i a o f F r a n 夜i a s p . E m o c 1 2 1 1 d u r i n g e a r l y d e v e l o p i o g s t a g 。 ( H o “ t : E . , u l ti f l o r a v a r . o v a t a ) ·