全 文 ：第 21卷　第 12期 干　旱　区　资　源　与　环　境 Vol.21　N o.12
2007 年 12月 Journal o f Arid Land Resources and Environment Dec.2007
文章编号:1003-7578(2007)012-146-05
蒙古沙棘亚种和中国沙棘亚种
良种及其杂种 1 代 ISSR 分析＊
刘瑞香1 , 2 , 杨劼1 , 金争平3 , 卢顺光3 , 温秀凤3
(1.内蒙古大学省部共建国家重点实验室培育基地 内蒙古草地生态学重点实验室 , 呼和浩特 010021;
2.内蒙古农业大学 , 呼和浩特 010018;3.水利部沙棘开发管理中心 ,北京 100058)
　　提　要:利用 ISS R标记技术对蒙古沙棘亚种良种乌兰沙林和中国沙棘亚种良种丰宁雄
株极其 F1代进行遗传多样性分析 ,共检测到 72个位点 ,71个位点具有多态性。筛选后的 11
个引物中 10个引物的多态性都非常高 ,多态性达到 100%,适合多态性的检测。母本乌兰沙
林 、父本丰宁雄株的多态位点百分率分别为 38.89%和 68.06%, F1 代雌雄株的多态位点百
分率分别为 63.89%和 70.83%,由此可知 F1代具有较强的遗传多样性。而从遗传一致度和
树状图同样可知杂雌和杂雄的一致度最高 ,然后是父本 ,最后是母本 。
关键词:沙棘;ISSR;遗传标记;遗传多样性
中图分类号:Q945.11;S793.6 文献标识码:A
沙棘(Hippophae rhamnoides L)是胡颓子科沙棘属的一种生态幅度广 ,适应能力强的落叶浆果灌木
或小乔木 , 雌雄异株。从最新的分类学观点可知 , 沙棘属植物共有五个种八个亚种 ,中国是沙棘属植物
的分布中心 ,有五个种即沙棘 、柳叶沙棘 、江孜沙棘 、肋果沙棘和西藏沙棘 ,四个亚种即中国沙棘 、蒙古沙
棘 、中亚沙棘和云南沙棘[ 1] 。
沙棘在我国的分布地域很广 ,分布于东经 75o(新疆喀什)至 122o(内蒙古通辽),北纬 27o(云南边庆)
至 48o(新疆阿勒泰)之间 ,广泛的分布在我国西北干旱半干旱地区 。内蒙古是我国沙棘的主要分布区 ,集
中分布在乌兰察布市和赤峰市 。我国沙棘资源丰富 ,栽培与利用也有悠久的历史 , 柳叶沙棘和中国沙棘
是沙棘属中最原始的种类 ,喜马拉雅山及毗邻地区是沙棘属植物的类群分化中心 ,东喜马拉雅山─横断山
地区可能是沙棘的起源地 。内蒙古自治区有大量的沙棘天然林分布 ,同时又有大面积的人工栽培 ,所以沙
棘产业发展势头良好 。沙棘作为一种阳性树种 ,可以抗严寒 、风沙 、耐干旱和高温 ,其不择土壤 ,耐水湿和
盐碱 。沙棘生长很快 ,根系发达 ,萌蘖能力强 ,它具有根瘤菌 ,改土作用强 ,为优良的水土保持树种 ,也是重
要的薪炭林树种[ 2] 。沙棘雌雄异株 ,异花授粉 ,亚种间易于天然杂交 ,其分布地域辽阔 ,生境复杂 ,因此 ,在
种级以下产生了丰富的变异类型 ,这些类型是选育沙棘优良品种的宝贵资源。在优良品种选育中 ,不同个
体在遗传特征上表现出差异 ,而父母本及其杂交后代的遗传关系是优良品种选育的依据 。
遗传标记是指可以明确反映遗传多样性的生物特征。在经典遗传学中 ,遗传多样性是指等位基因的
变异 ,在现代遗传学中 ,遗传多样性是指基因组中任何坐位上的相对差异。 ISS R(inter-simple sequence
repeats)技术即简单序列重复区间 DNA 标记技术是由 Zietiewicz et al提出的 ,该技术检测的是两个 SSR
之间一段短 DNA 序列上的多态性 。利用真核生物基因组中广泛存在的 SSR序列 ,设计出各种能与 SSR
序列结合的 PCR引物 ,对两个相距较近 ,方向相反的 SSR序列之间的 DNA区段进行扩增[ 3] 。 ISSR被广
泛的应用于植物遗传分析的各个方面[ 8-12] 。本文采用 ISSR分子标记技术分析了乌兰沙林 、丰宁雄株及
其 F1代的遗传多样性和遗传距离 ,为杂交后代的选育提供科学依据 。
＊ 收稿日期:2006-10-20。
基金项目:教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-04-0260),博士基金(BJ 05-13)资助。
作者简介:刘瑞香(1971-),女 ,汉族 ,博士 ,副教授 ,主要从事植物生理生态学研究。 Emai l:liuruix @126.com
DOI :10.13448/j.cnki.jal re.2007.12.020
1 材料与方法
1.1　植物材料采集和处理
实验材料选用中国沙棘和蒙古沙棘的优良品种丰宁雄株和乌兰沙林为父母本及杂交雌 、雄株各 12株
采集叶片 ,装入冰盒带回实验室 ,放入-80℃冰箱保存备用。
1.2 DNA提取与检测
DNA 的提取:将上述处理好的叶片样品称取 0.12g ,加入 0.05g PV P ,加少许液氮冷冻叶片 ,再加入
液氮迅速研磨为粉末状后移入 1.5m l装有 700ul 经 65℃预热的 CTAB 缓冲液中温浴 60分钟 ,每 5分钟
缓慢摇动两次;加等体积的氯仿:异戊醇(24∶1)充分混匀 ,4℃ 1000r/min 离心 10分钟;取上清液 ,加 2/3
体积的-20℃的异戊醇 ,充分混匀后置于-20℃ 30分钟以上 , 4℃ 10000r/min 离心 10 分钟;收集沉淀
风干 ,沉淀溶于 200ul 0.1 MTE 中后 ,用等体积的氯仿:异戊醇(24∶1)抽提 , 10000r/min离心 ,抽提两
次;取水相 ,加入 1/5体积的 NH 4AC ,再加 500ul冷冻的无水乙醇 , -20℃放 30分钟以上 ,10000r/min离
心5分钟 ,取沉淀;用 700ul 70%乙醇洗涤两次 ,10000r/min离心 5分钟 ,风干沉淀;加入 20ul 0.1 MTE溶
解沉淀 ,4℃放置一天后进行电泳检测 。
DNA 检测方法:取 1ul提取到的 DNA ,加 6ul d3H 2O , 3ul溴酚蓝 , 0.7%的琼脂糖凝胶点样后 ,
JY600C 型电泳仪80v电压稳压电泳20分钟 ,用DU-T 型紫外分光光度计和电泳-EB染色的荧光强度 ,
通过已知浓度的λDNA 为对照 ,确定 DNA 的浓度。
1.3 PCR反应条件与反应体系
参照Williams等(1990)的方法[ 14] ,通过对 DNA 的浓度 、引物等条件的初步调整 ,达到了优化的反应
条件 ,聚合酶链式反应(PCR)的条件设置为:94℃预变性 5min , 94℃变性 45秒 ,37℃退火1min , 72℃延
伸 1.5min ,44次循环 ,最后 72℃延伸 5min ,4℃保存。
根据韩冰(2003)的实验结果[ 6] ,确定了 25 μl的反应体系:
20ng 基因组 DNA 10×PCR Buf fer 2.5μl ,10m mo l/LMg 2+2μl , 0.2μM/μl引物 1μl , , 5μ/μl Taq酶
0.2μl , 10m mo l/L dNTPS 0.2μl ,d3H2O 18.1μl。ISSR反应在 Eppendorf热循环仪上进行。
1.4 引物筛选
以试验材料的 DNA 样品做模板 ,用最佳反应体系对 Sangon 公司生产的 20个 ISSR引物进行 PCR
扩增筛选 ,用于实验 。
1.5 扩增产物的分离与检测
DNA 扩增产物在含有溴化乙锭的 2.5%的琼脂糖凝胶中点样 , JY600C 型电泳仪 80v 电压稳压电泳
分离 2.5小时 , 在溴化乙锭溶液中染色 20分钟后在 Tanon GIS-2008凝胶成像系统中扫描检测。
1.6 谱带的统计
在确定双亲与 F1代亲缘关系中 ,分别把母本 、父本 、F1代视为 4个群体 ,来统计其 DNA 谱带的多态
性。同一引物的扩增产物在电泳中迁移率相同的条带被认为是同源性的 ,属于同一位点的条带将清晰可
见的强带和反复出现的弱带记为“1” ,否则记为“0”形成二元统计数据 。
ISSR条代采用 popgene32分析。
2 乌兰沙林 、丰宁雄株及其 F1代的 DNA 遗传多样性
2.1　不同引物的多态性信息
取乌兰沙林 、丰宁雄株叶片 DNA 采用 ISS R技术 ,从适合胡颓子科沙棘属植物扩增的引物中筛选出
条带清晰 ,稳定性好的 11个 ISS R引物对沙棘土著种和外来种进行 ISSR分析获得各引物扩增的位点数
及多态位点信息(表 1),共检测到 72个位点 ,其中 71个位点具有多态性。11个引物中 10 个引物的多态
性都非常高 ,多态性达到 100%,适合多态性的检测 。
2.2 不同沙棘的遗传多样性
由表 2可知乌兰沙林 、丰宁雄株及其 F1代均检测到 72个位点 ,母本 、父本的多态位点分别为 28和 49 ,
多态位点百分率为 38.89%和68.06%,F1代雌雄株的多态位点分别为 46和 51 ,多态位点百分率分别为 63.
89%和68.06%,由此可知杂雄的遗传多样性最强 ,其次是父本 ,然后是杂雌 ,母本的遗传多样性最小 。
·147·第 12期 刘瑞香等　蒙古沙棘亚种和中国沙棘亚种良种及其杂种 1代 ISSR分析
通过表 3可知:杂雄的 Nei指数最
高 ,其次是杂雌 ,然后是父本 ,母本的最
小。根据估测的等位基因频率计算的
Nei 遗传分化指标(表 4)。
群居每代迁移数(Nm , the number
of mig rants per generation)是测定基因
流的一种方法 , Nm =(1 -Gst)/4Gst
(梅里尔 ,1991)[ 5] ,因此 ,当 Nm 值升高
时 ,Gst值就降低 。由表 4可以看出 ,不
同引物计算得出 Nm 值差异很大 ,从 0.
3579到 6.0286 不等。Wright 认为[ 4] ,
当 Nm >1 时 , 基因流就可以防止由遗
传漂变引起的群居之间的分化 。这里平
均是 2.5016>1 ,所以可以初步认为沙
棘群居之间没有由遗传漂变引起的群居
之间的分化。
2.3 不同沙棘的遗传一致度及遗传距离
根据 Nei(1973)的遗传一致度和遗传
距离的计算方法(结果表 5),母本和父本
的遗传系数是0.6268 ,杂雄和杂雌的遗传
相似系数是 0.8664。其中杂雌与母本的
遗传相似系数为 0.7055 ,而与父本的遗传
相似系数为 0.7047;杂雄与母本的遗传相
似系数为 0.7465 ,而与父本的遗传相似系
数为 0.7621。这说明从遗传一致度可知
杂雌和杂雄的遗传一致度最高 ,杂种与父
母本在遗传关系上比父母本之间更近。
表 5 遗传一致度及遗传距离
Tab.5 Neis original measur es o f genetic
identity and genetic distance
种群 杂雌 母本 杂雄 父本
杂雌 ＊＊＊＊ 0.7055 0.8664 0.7047
母本 0.3489 ＊＊＊＊ 0.7465 0.6268
杂雄 0.1434 0.2924 ＊＊＊＊ 0.7621
父本 0.3500 0.4671 0.2717 ＊＊＊＊
注:右上角为遗传一致度 ,左下角为遗传距离
2.4 基于遗传距离的树状图
从遗传一致度和树状图可知杂雌和
杂雄的一致度最高 ,聚类时首先聚为一
类 ,然后和父本聚为一类 ,最后才和母本
聚在一起 。
图 1 基于遗传距离的树状图
Fig.1 Dendrogram based on Neis(1972)genetic distance
表 1 引物序列及扩增结果
Tab.1 List of prime r labels , primer sequence and amplifica tion results
引物名称 核苷酸序列 总位点数 多态位点数 多态位点百分率
AW77938 GAGAGAGAG AGAGAGAA 5 5 100%
AW64754 AGAGAGAGAG 1 0 0
AW77934 AGAGAGAGAGAGAGAGC 5 5 100%
AW77939 AGAGAGAGAGAGAGAG TC 8 8 100%
AW77940 GAGAGAGAGAGAGAGAGG 11 11 100%
AW77943 GGAGAGGAGAGGAGA 7 7 100%
AW22894 ACACACACACACACACT 7 7 100%
AW64748 ACACACACACACACACTG 5 5 100%
AW64749 TG TGTGTG TGTGTG TGC 5 5 100%
AW64750 CTCCTCCT CCTCCTCCTC 5 5 100%
AW64751 T AT TAT TAT TA TT AT TAT 13 13 100%
T otal 72 71 98.61%
表 2 不同沙棘种群的遗传变异
Tab.2 Genetic v aria tion of different seabuckthorns
种群 样本数 多态位点数 多态位点百分率
杂雌 28 46 63.89%
母本 20 28 38.89%
杂雄 25 51 70.83%
父本 20 49 68.06%
总种群 93 71 98.96%
表 3 不同沙棘的遗传多样性
Tab .3 Genetic diversity of Chinese seabucktho rn and Russian seabuckthorn
种群 观察位点数 有效位点数 Nei指数 Shannon指数
杂雌 Mean 1.6429 1.3626 0.2072 0.3117
St.Dev 0.4880 0.4079 0.2069 0.2883
母本 Mean 1.3929 1.2244 0.1297 0.1956
St.Dev 0.4937 0.3607 0.1908 0.2733
杂雄 Mean 0.7143 1.4634 0.2693 0.3986
St.Dev 0.4600 0.3961 0.1972 0.2793
父本 Mean 1.6786 1.2577 0.1630 0.2606
St.Dev 0.4756 0.3179 0.1739 0.2473
总种群 Mean 1.9643 1.6305 0.3548 0.5194
St.Dev 0.1890 0.3345 0.1634 0.2161
表 4 不同沙棘种群内 、种群间的遗传多样性及遗传分化
Tab.4 Genetic dive rsity betw een and w ithin o f Chinese seabucktho rn
and Russian seabucktho rn populations and varia tions
引物 种群的基因多样性 H t
种群内基因
多样性 Hs
种群间基因
多样性 Gst 基因流 Nm
AW77938 0.3608 0.1412 0.5165 0.8309
AW64754 0 0 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊＊
AW77934 0.3315 0.1357 0.4485 6.0286
AW77939 0.4729 0.1965 0.5856 0.3579
AW77940 0.4325 0.2781 0.3469 1.7564
AW77943 0.3204 0.2345 0.1996 5.0964
AW22894 0.3305 0.0960 0.3137 3.6932
AW64748 0.3426 0.2216 0.4432 0.9871
AW64749 0.3678 0.1456 0.4718 1.0231
AW64750 0.4152 0.1732 0.5001 2.0321
AW64751 0.3218 0.2013 0.4213 3.2101
平均 0.3549 0.1923 0.4581 2.5016
标准差 0.0268 0.0125
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3 结论
(1)父母本的多态位点少于 F1代 ,由此可知杂雄的遗传多样性最强 ,其次是父本 ,然后是杂雌 ,母本的
遗传多样性最小 。
(2)根据 Nei指数得杂雄最高 ,其次是杂雌 ,然后是父本 ,母本的最小。
(3)根据群居每代迁移指数得沙棘群居之间没有分化。
(4)从遗传一致度和树状图可知杂雌和杂雄的一致度最高 ,然后是父本 ,最后是母本 。
4 讨论
物种在漫长的演化过程中 ,环境筛选淘汰了许多与之不相适应的个体 ,而保留下来的都是通过不同方
式与其目前生存环境相适应的个体 。这种环境对生物体的选择和物种对环境的适应是在不同层次和水平
上进行的 ,而物种的适应性从根本上是该物种的遗传适应 。因为只有遗传上的适应才能决定物种在不断
变化的环境中的发展命运 ,其它水平上的适应如果无法得以遗传 ,对该物种的进化来说 ,并无多大的意义 。
因为遗传是一个物种对外界干扰进行成功反应的决定性因素 ,一个物种的遗传多样性越高 ,对环境变化的
适应能力就越强 ,越容易扩展其分布范围和开拓新的环境。不管生长在自然条件下还是人工栽培条件下 ,
植物均因其环境的影响而发生变异 ,变异的大小取决于植物本身的特性和外界干扰的强度 。钟章成认为
物种内部的种群遗传分化是物种分化的前奏 ,也是种群动态调控的基础。
物种的遗传变异是适应环境变化的基础 ,是进化改变的本质 ,遗传多样性高的物种其进化潜力和适应
环境的能力也就大。沙棘种群的遗传结构也是随着环境的改变其长期演化形成的 ,并与生活史特征有着
密切的关系 ,它一方面反映了沙棘的进化历史 ,另一方面又决定了沙棘在未来发展中的适应潜力。环境的
选择和物种的适应伴随整个物种的产生 、发展 、消亡的全过程 ,研究沙棘物种的遗传多样性 ,对物种的保
护 、管理 、种群恢复以及发展趋势的预测都具有重要意义。俄罗斯沙棘是中亚沙棘和蒙古沙棘亚种的杂交
后代 ,因此 ,俄罗斯沙棘的遗传多样性高于中国沙棘 ,这种遗传多样性的差异是俄罗斯沙棘在诸多生物学
特性优于中国沙棘的遗传基础 ,这为杂交育种提供了丰富的材料。在沙棘良种选育过程中利用分子标记
的方法研究亲代和子代的遗传多样性 ,结合表型性状的研究 ,对杂交育种过程中的亲本选择 、子代测定 ,优
树选择和新品种的选育具有重要的实践价值 。
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·149·第 12期 刘瑞香等　蒙古沙棘亚种和中国沙棘亚种良种及其杂种 1代 ISSR分析
ISSR Analysis on Chinese Seabuckthorn ,
Monglian Seabuckthorn and Their F1
LIU Rui-xiang 1 , 2 , YANG Jie1 , JING Zheng-ping3 ,
LU Shun-guang3 , WEN Xiu-feng3
(1.The C ult ivat ion Base for the S tat Key Laborato ry— Inner Mongolia Grassland Ecology Laboratory , Inner M ongolia Universi ty ,
H ohhot 010021;2.College of Ecology En vi ronmen t , Inner Mongolia Agriculture Universi ty , H ohhot , Inner Mongolia 010018;
3.The Seabuck th orn Development and M anagem en t Cen ter of Water Conservancy Department , Beijing 100058 , China)
Abstract
　　The genetic diver sity of the improved variety o f Chine se seabuckthorn—Feng-ning ,Monglian sea-
bucktho rn—Wu-lan-sha-lin and thei r F1 w ere analyzed by ISSR ,72 loci w ere detected wi th 11 prim-
ers in the ISSR analy sis , 71 loci of w hich w ere polymorphic.On the genetic po lymo rphism o f individuals
in the populat ions , the male of F1 had the highest polymorphic loci percentage (70.83%), then the
male parent Feng-ning(68.06%), female of F1(63.89%), and the female parent Wu-lan-sha-lin
(38.89%).It w as found that F1 had high polymorphic.Genetic distance betw een the male and the fe-
male of F1w as nearer , the male parent and F1 w as also nearer.Gentic distance betw een the Famale parent
and F1 w as longer.
Key words:Hippophae;ISS R;genetics marker;genetic diversi ty
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