全 文 ：沉香属植物基因组 DNA提取及
SSR反应体系的优化①
杨 云 1)② 孟 慧 1)③ 张 争 1,2)陈 波 1)
(1 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所海南分所/
海南省南药资源保护与开发重点实验室 海南万宁 571533;
2 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所 北京 100193)
摘 要 以白木香为材料， 研究沉香属植物基因组 DNA提取方法， 并优化 SSR-PCR反应体系。 通过改良 CTAB
法提取白木香叶片基因组 DNA， 经电泳和吸光度检测。 优化影响白木香 SSR-PCR主要参数， 确立适合沉香属
植物的 SSR-PCR反应体系和扩增条件： 在 20μL反应体系中， 模板 DNA、 引物、 Mg2+、 dNTP和 Taq DNA聚合酶
等 5种主要成分的最适浓度分别为 2.5 ng/μL、 1μmol/L、 2 mmol/L、 0.2 mmol/L、 1.2 U； 并用 9份沉香属植
物 DNA样品对 SSR-PCR反应体系验证， 能扩增清晰条带。 SSR优化系统的建立为进一步利用 SSR分子标记技术
进行白木香种群及不同地区沉香属种群遗传多样性研究提供基础。
关键词 沉香属植物 ； 白木香 ； DNA 提取 ； SSR
分类号 Q78
Extraction of Genomic DNA and Optimization of SSR Reaction Condition
for Aquilaria ssp.
YANG Yun1) MENG Hui1) ZHANG Zheng1,2) CHEN Bo1)
(1 Hainan Branch Institute of Medicinal Plant Development, CAMSPUMC/Hainan Provincial
Key Laboratory of Resources Conservation and Development
of Southern Medicine, Wanning, Hainan 571533, China;
2 Institute of Medicinal Plant Development, CAMSPUMC, Beijing 100193, China)
Abstract The extraction method of Aquilaria ssp. genomic DNA and optimization of SSR-PCR reaction
condition for Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg were studied. Genomic DNA was isolated using improved
CTAB method. Agarose gel electrophoresis and detection results showed that improved CTAB DNA
extraction produced DNA was an efficient DNA extraction method, which yielded high-quality DNA
with no degradation. It was effectively removed polysaccharide, polyphenols, and successfully inhibited
protein and such impurities as salt ion and RNA. These DNA can be used for SSR molecular marker.
The reaction system and amplified procedure suitable for A. sinensis were as follow: 20 μl amplification
reaction system, 2.5 ng/μL template DNA, 1 μmol/L primer, 2.0 mmol/L MgCl2, 200 μmol/L dNTPs and
1.2 U Taq DNA polymerase. Nine of Aquilaria ssp.. DNA samples were used to verify the SSR-PCR
reaction system, and could produced qualified fragments. The optimal system could provide a favor able
basis for further study on genetic of A. sinensis and Aquilaria ssp.. using SSR molecular marker.
Keywords Aquilaria ssp. ; Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg ; DNA extraction ; SSR
① 基金项目： 海南省自然科学基金(No.30835)； 十二五科技支撑计划项目(No.2011BAI01B07)。
收稿日期： 2012-03-20； 责任编辑/古小玲； 编辑部 E-mail： rdnk@163.com。
② 杨 云(1981～)， 男， 硕士， 助理研究员， 研究方向为南药生物技术。
③ 通讯作者： 孟 慧， E-mail: huiziqq@163.com
Vol．32, No．5
2012年5月 热 带 农 业 科 学
CHINESE JOURNAL OF TROPICAL AGRICULTURE
第32卷第5期
May． 2012
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杨 云 等 沉香属植物基因组DNA提取及SSR反应体系的优化
沉香是中国、 日本、 印度以及其他东南亚国家
的传统药材和名贵天然香料， 其药用、 精油、 香料
等方面市场需求量巨大， 原料远销中东、 欧美、 日
韩等国家和地区。 沉香来源于瑞香科沉香属所有植
物， 共15种， 分布于缅甸、 泰国、 越南、 老挝、 柬
埔寨、 印度、 印度尼西亚、 中国等地。 中国有2种，
分别为白木香[Aquilaria sinensis (Lour.)Gilg]和云
南沉香(Aquilaria yunnanensis S.C.Huang)[1]。 其中，
白木香以其含树脂的木材入药， 是中药沉香的来
源， 自古就有 “海南沉香， 一片万钱， 冠绝天下”
的美称， 也是生产中药沉香的唯一植物资源[2-3]。
据统计， 全世界沉香及其加工产品的贸易额达 200
亿元以上； 国内沉香市场统货每千克 3 000元以
上， 优质沉香价格甚至超过黄金。 由于沉香药材
的高价值且国际市场需求极大， 长期以来白木香
遭到掠夺式过度砍伐， 其原始林已经基本破坏殆
尽， 在1999年就被列为国家二级濒危保护植物[4]，
2000年列入 《世界自然保护联盟受威胁植物红色
名录》， 2005年起所有沉香属植物均被列入 《濒危
野生动植物种国际贸易公约》。 为更好地保护和利
用沉香属植物资源及其物种的多样性， 中国学者在
白木香形态学表型多样性[5-6]、 细胞学水平染色体多
样性[6-8]、 生化水平等位酶多样性[9]、 分子水平 DNA
多态性[10-19]等方面已开展大量研究。
作为近年来发展起来的一种以特异引物PCR为
基础的分子标记技术——SSR(Simple Sequence
Repeats)标记 ， 也称为微卫星 DNA(Microsatel-
lite DNA)， 是一类由几个核苷酸(一般为 1-6个)为
重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序
列。 微卫星具有数量多且均匀分布在基因组中、 多
态性丰富、 位点检测可以显示纯合子和杂合子、 检
测容易、 重复性较好、 省时、 适合于进行自动化分析
等特点。 目前， 该技术在植物的指纹图谱、 遗传多
样性、 遗传作图和基因定位研究中得到了广泛应用。
本研究将在优化传统 DNA提取方法的基础上，
开展SSR反应参数摸索， 以建立适合SSR-PCR反应
的沉香属植物DNA提取方法和SSR反应体系， 为进
一步开展SSR-PCR分析白木香种群乃至沉香属种群
遗传多样性提供参考。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 叶片
白木香(A. sinensis)， 云南沉香(A. yunnanen-
sis)， 越南沉香(A.crassna)叶片 均采自中国医学科
学院药用植物研究所海南分所南药园。 其中， 云南沉
香于2009年从云南西双版纳景洪引种； 越南沉香于
2010年从越南河内引种。 所有叶片材料均现采现用。
1. 1. 2 试剂
CTAB、 Tris、 EDTA、 Tris饱和酚、 氯仿和异戊
醇均购自上海生物技术工程公司； Taq酶和 DNTP
为MBI产品； 琼脂糖产自西班牙； 其余常规试剂均
为国产分析纯。
1. 1. 3 DNA提取液
CTAB提取缓冲液： 100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，
1.4mol/LNaCl， 2%CTAB(m/V)， 20mmol/LEDTA， 1%
β-巯基乙醇(V/V， 用前加)DNA洗涤溶液： 100mmol/L
Tris-HCl(pH8.0)， .14mol/LNaCl， 20mmol/LED-
TA， 1%β-巯基乙醇(V/V， 用前加)。
1. 2 方法
1. 2. 1 改良 CTAB法提取叶片基因组 DNA
参考赵翾等[10]的方法， 对部分操作进行优化。
基本步骤如下 ： (1)取鲜样 0.5 g， 加 2%不溶性
PVP， 置研钵中， 加液氮研磨至粉末状， 转入 2mL
离心管 ； (2)加入 1.5 mL洗涤溶液 ， 充分混匀 ，
4℃， 10000r/min， 离心 10min， 弃上清； (3)重
复步骤(2)直至上清液澄清； (4)加入0.7mL65℃预
热的CTAB提取液， 混匀， 65℃水浴30min； (5)加
入 0.7mL酚∶氯仿∶异戊醇(V∶V∶V， 25∶24∶1)，
混匀， 室温， 10000r/min， 离心10min； (6)取上
清液， 重复步骤(3)2次； (7)取上清液， 加等体积
预冷异丙醇 ， 置 -20℃冰箱 2 h， 沉淀 DNA； (8)
4℃， 10000r/min， 离心 10min， 弃上清， 70%酒
精洗沉淀 2次， 风干， 用 50μLTE溶解； (9)加入
无 DNase的 RNase至终浓度 10μg/μL， 37℃保温
30min， -20℃保存备用。
1. 2. 2 DNA质量检测
DNA电泳分析： 取 5μL DNA样品用于 0.8%琼
脂糖凝胶电泳检测。
DNA样品紫外检测 ： 取 1μL DNA样品 ， 用
NanodropND-1000超微量核酸蛋白测定仪测量吸光
值及浓度。
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2012年5月 第32卷第5期热带农业科学
1. 2. 3 SSR-PCR反应体系
在SSR-PCR反应体系中， 对影响SSR-PCR扩增
的主要参数进行梯度试验， 以确定该参数对SSR结
果的影响。 反应体系为 20μL， 其中 DNA模板浓度
设10、20、30、40、50、60、70ng等7个梯度； dNTP
浓度设0.05、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6mmol/L
等 7个梯度 ； 引物浓度设 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、
1.0、 1.2、 1.4μmol/L等 7个梯度； Taq DNA聚合
酶设0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2、 1.4等7个梯
度 ； Mg2+浓度设 0.1、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、
3.0mmol/L等7个梯度。 引物序列参照白木香cD-
NA文库(未发表)设计， 由上海生物技术工程有限公
司合成。
1. 2. 4 SSR-PCR扩增程序
94℃， 预变性5min， 94℃变性30s， 52℃退火
45s， 72℃延伸1min， 35个循环， 72℃延伸10min。
PCR仪为Bio-RadPTC-200。
1. 2. 5 SSR-PCR产物的检测
配置含0.5g/mLGoldview染料的2%琼脂糖凝
胶， 取 SSR-PCR扩增产物 5μL加 1μL6倍上样缓
冲液混匀， 上样。 恒定电压 100 V， 电泳 60 min。
标准分子量标记为100bpDNALander。
2 结果与分析
2. 1 DNA样品提取分析
采用改良 CTAB法提取的白木香基因组DNA(见
图1)无RNA污染， 无降解现象。 经琼脂糖凝胶电泳
和核酸蛋白测定仪检测， 提取的白木香基因组DNA
无RNA污染， 无降解现象， 基因组DNA浓度在100～
300μg/mL， OD260/OD280比值介于1.8～2.0， 说明具
有较高的纯度， 无蛋白质、 酚类、 多糖和盐等杂质的
污染， 可以直接用于SSR-PCR反应。 该方法同样适
用于沉香属植物叶片基因组DNA提取(见图2)。
2. 2 不同 PCR参数对 SSR-PCR的影响
2. 2. 1 模板 DNA对 SSR反应的影响
模板 DNA含量是制约扩增结果的一个重要因
子。 浓度太低， 分子碰撞的几率低， 偶然性增大，
扩增产物不稳定； 模板含量过高时造成条带模糊，
甚至不能扩增出条带。 在20μL反应体系中， 模板
DNA10ng时条带较弱， 50ng时条带清晰稳定(见
图3)。 从经济实用的角度考虑， 选择50ngDNA含
量作为扩增体系适宜模板浓度。
2. 2. 2 dNTP浓度对 SSR反应的影响
dNTP浓度直接影响扩增产物的多少， 浓度过
低影响合成效率， 甚至会因 dNTP过早消耗而使产
物单链化； 浓度过高则容易拖尾， 甚至出现无条
带。 图 4为 7个浓度(0.05、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、
0.6mmol/L)的PCR扩增产物情况。 虽均有扩增产物，
但过量的 dNTPs会与聚合酶竞争结合 Mg2+， 抑制
图 1 DNA琼脂糖凝胶电泳
说明： 1-5， DNA上样量分别为 5、4、3、2、1μL； M， 100bp标
准分子质量 100bpDNAladder。 下同。
2000
250
100
1 2 3 4 5 M
图 2 沉香属植物 DNA琼脂糖凝胶电泳
说明： 1～7， 白木香(海南儋州、 海南演丰、 海南屯昌、 海南万
宁、 广东电白、 广东中山、 广东湛江)； 8， 云南沉香； 9， 越南沉香 。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M
图 3 模板 DNA浓度对 SSR扩增的影响
说明： 1-7， 模板DNA分别为10、 20、 30、 40、 50、 60、 70ng。
1 2 3 4 5 6 7 M
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杨 云 等 沉香属植物基因组DNA提取及SSR反应体系的优化
图 7 Mg2+浓度对 SSR扩增的影响
说明： 1-7， Mg2+浓度分别为 0.1、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、
3.0mmol/L。
1 2 3 4 5 6 7 M
图 4 dNTP浓度对 SSR扩增的影响
说明 ： 1-7， dNTP浓度分别为 0.05、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、
0.5、 0.6 mmol/L。
1 2 3 4 5 6 7 M
PCR反应(见图4)。 通过比较， 选择 0.2mmol/L时
扩增条带最清晰稳定。
2. 2. 3 引物浓度对 SSR反应的影响
在设计的引物浓度范围内均可扩增出全部产
物， 引物浓度对DNA条带的影响较小， 没有明显差
异 。 图 5为引物 7个浓度(0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0、
1.2、 1.4μmol/L)的 PCR扩增产物情况。 随着引物浓
度升高， PCR产物随之增加(见图 5)。 当引物浓度
为1.0μmol/L时， 可扩增出最清晰稳定条带。
2. 2. 4 TaqDNA聚合酶对 SSR反应的影响
TaqDNA聚合酶是PCR反应中的一个重要因素，
浓度过低则合成产物效率下降， 浓度过高容易引起
非特异性产物的扩增。 图6中显示20μL反应体系
TaqDNA聚合酶在 0.2～1.4U浓度范围的 PCR扩增
产物情况。 当 TaqDNA聚合酶为 1.2U时扩增条带
最清晰稳定(见图6)。
2. 2. 5 Mg2+浓度对 SSR反应的影响
Mg2+浓度在SSR反应中也非常重要， 是PCR中
DNA聚合酶的活性所必须的辅助因子， 通过影响
TaqDNA聚合酶活性而间接影响 PCR扩增， 因此其
浓度在每一引物与模板配对中均应达到最适量。 图
7为 Mg2+浓度在 0.1～3.0mmol/L的扩增分析。 结
果表明： Mg2+浓度在2.0mmol/L时可获得最好的扩
增结果(见图7)。
2. 3 不同地区沉香属植物 DNA样品 SSR-PCR分析
分别提取9份沉香属植物DNA样品， 利用新建
立的SSR-PCR反应体系进行分析。 图8为沉香属植
物DNA样品SSR扩增情况。 结果显示： 该反应体系
适用于不同沉香属样品， 能扩增出所有样品的条
带， 且条带清晰(见图8)。
图 6 TaqDNA聚合酶浓度对 SSR扩增的影响
说明： 1-7， TaqDNA聚合酶浓度分别为 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、
1.0、 1.2、 1.4U。
1 2 3 4 5 6 7 M
图 5 引物浓度对 SSR扩增的影响
说明： 1-7， 引物浓度分别为 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2、
1.4μmol/L。
1 2 3 4 5 6 7 M
图 8 沉香属植物 DNA样品 SSR扩增
说明： 1～7， 白木香(海南儋州、 海南演丰、 海南屯昌、 海南
万宁、 广东电白、 广东中山、 广东湛江)； 8， 云南沉香； 9， 越南
沉香。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M
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3 结论与讨论
本研究通过改良CTAB法提取白木香以及其他沉
香属植物基因组DNA， 经琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白
测定仪检测， 基因组 DNA浓度在 100～300μg/mL，
OD260/OD280比值介于1.8～2.0， 无RNA污染， 无降
解现象。 证明本研究提出的改良CTAB法是一种适合
沉香属植物基因组DNA高效提取方法， DNA样品可用
于SSR等为基础的DNA多态性标记。 在优化影响白木
香SSR-PCR主要参数研究中， 确立了适合沉香属植物
SSR-PCR反应体系和扩增条件。 20μL反应体中， 模
板DNA、 引物、 Mg2+、 dNTP和TaqDNA聚合酶等5种
主要成分的最适浓度分别为2.5ng/μL、1.0μmol/L、
2.0mmol/L、 0.2mmol/L、1.2U。
热带亚热带地区植物由于其生长环境影响， 植
物体内次生代谢物含量很高。 为了得到高纯度植物
基因组DNA， 如何有效去除植物体内的蛋白质、 酚
类、 多糖和盐类等杂质成为需要解决的重要问题。 本
研究所述在前人研究基础上改良CTAB法， 增加样品
洗涤步骤， 较好地去除叶片中的次生代谢物， 提高
了基因组DNA质量。 为沉香属植物SSR-PCR反应体
系的确立及引物在沉香属种间多态性分析提供保障。
在沉香属植物SSR-PCR反应体系中， 离子浓度
对PCR的特异性及扩增效率有较大的影响。 如Mg2+
浓度过高会增加非特异性产物， 过低则扩增出的条
带很弱或无扩增； dNTP浓度过高时扩增错误掺入率
也会增加， 过低则在反应中过早消耗完， 直接影响
扩增产物量。 引物浓度过高， 会引起与模板非特异
性配对， 造成扩增背景模糊， 并易形成引物二聚
体； 过低时， 引物与模板的结合率低， 扩增反应过
早终止， 从而导致扩增无产物， 或产物量太少。 通
过此实验确定的沉香属植物SSR-PCR反应体系， 经
群体检测， 结果可靠， 带型稳定， 完全适用于下一
步研究工作。
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