全 文 ：畜牧兽医学报　2008 , 39(6):701-704
Acta Veterinaria et Zootechnica S inica
中国牛属 4个物种MSTN基因的遗传变异研究
冀德君 ,常　洪＊ ,常春芳 ,耿荣庆 ,李永红
(扬州大学动物科学与技术学院 , 扬州 225009)
摘　要:针对牛肌肉生长抑制素基因(MS TN)3 个外显子区设计引物 , 通过 PCR 扩增及测序 , 以蒙古牛 、雷琼牛 、
独龙牛 、巴音郭楞州牦牛共 66 个样本为材料检测了中国普通牛 、瘤牛 、大额牛和牦牛 4 个牛属该基因外显子区核
苷酸序列的变异。结果显示 , 4 个中国牛种的 MS TN 基因外显子 1 、2 和 3 分别含 375 、372 、381 个碱基对 , 在所检
样本中 ,发现 7 个核苷酸多态位点 , 定义 17 种单倍型;种内核苷酸歧异度(Pi)在 0.000 36 ～ 0.001 03 间 , 种间核苷
酸歧异度(Dxy)在 0.000 76～ 0.003 22 间 ,说明群体内遗传多样性程度低;以单倍型序列为基础构建的分子进化
树表明 ,牦牛的分化早于黄牛中普通牛和瘤牛的分化;大额牛明显分为 2 个类群 , 很可能是由于杂交造成的。
关键词:肌肉生长抑制素;牛属;核苷酸歧异度
中图分类号:S823.2　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:0366-6964(2008)06-0701-04
收稿日期:2008-01-16
基金项目:国家自然科学基金(30571323)
作者简介:冀德君(1973-),男 ,江苏盐城人 , 讲师 , 博士生 ,主要从事家畜生态学 、动物遗传资源保护教学研究工作 , E-m ail:jidejun7346@si-
na.com
＊通讯作者:常　洪(1939-),教授 ,博士生导师 ,主要从事动物遗传资源评价 、保护与利用方面的研究 , E-mai l:hoch@yz cn.net
Genetic Variation of Myostatin Gene in 4 Bos Species in China
JI De-jun ,CHANG Hong＊ , CHANG Chun-fang , GENG Rong-qing , LI Yong-hong
(Collegeo f Animal Science and Technology , Y angzhou Universi ty , Yangzhou 225009 ,China)
Abstract:Through designing the primers to the three exons of the myostat in(MST N)gene and
using the methods of PCR amplification and sequencing , variations of the MS TN gene w ere de-
tected in 4 Chinese Bos specie s , no rmal cat t le (Mongolia cat tle), zebu(Leiqiong cat tle), yak
(Bayingo lin), and gayal(Dulong gayal).The results showed that 375 , 372 ,381 base pairs w ere
detected respectively in the exon 1 , 2 and 3 of the MST N gene , and 7 nucleo tide polymorphic
sites w ere observed wi th 17 haplotypes in the 4 Bovinae populations.The nucleo tide diversit ie s
wi thin the 4 species(Pi)ranged from 0.000 36 to 0.001 03 , and betw een the 4 species (Dxy)
ranged from 0.000 76 to 0.003 22 , indicating a low int rapopulat ion genetic diversi ty.Const ruc-
tion of the phy logenic tree based on these MST N haplo types indicated that yak w as diverg ed ear-
lier than yellow cat tle (no rmal cat t le and zebu);gayals were cluste red into tw o g roups , probably
due to hybridization.
Key words:myostat in;Bos;nucleo tide polymo rphism
　　牛亚科(Bovinae)动物的分类方法历来并存不
同系统 ,三属和六属 2 个划分系统 。属的划分是影
响我国牛亚科家畜遗传资源评价 、保护和利用实践
的问题之一。牛亚科家畜根据三属的划分系统 ,牦
牛 、大额牛列为牛属(Bos)[ 1] 。对于中国牛属家畜的
遗传分化情况 ,国内学者已经取得了在微卫星 DNA
多态性[ 2] 、血液蛋白酶[ 3] 等指标方面众多种群的数
据结果 ,分别获得了黄牛(普通牛和瘤牛)、牦牛等许
多家畜群体的遗传分化情况。近年来 ,相关研究已
涉及到核 DNA[ 4] 和 mtDNA[ 5] 上基因的分化状况 ,
常受关注的有MST N 、IGF 、mtDN A D-loop 和Cy-
to-b 等基因 。MST N 基因所制约的表型变异明显
畜　牧　兽　医　学　报 39 卷　
承受着选择压力 。其外显子区不同位点的变异可能
导致该基因的活性降低或丧失而引起个体表现出
“双肌”性状 ,如皮埃蒙特牛(Piedmontese)[ 6] 和比利
时蓝牛(Belgian blue)[ 7] ,在该基因某些位点的变异
具有较高的比例。MSTN 基因的突变速率在核基
因中是比较高的 ,这类突变在外显子核苷酸序列中
的分布和所占比例 ,是探讨中立性分子进化和适应
性进化之间相互关系的切入点之一 。本研究旨在了
解牛属家畜 MST N 基因的遗传变异信息 ,为进一
步解决我国牛属家畜的宏观进化与分类以及初步探
讨 MSTN 基因分子进化提供部分试验依据 。
1　材料和方法
1.1　实验动物和基因组 DNA制备
　　　从牛属 4 个种群的中心产区对各牛种取血
样 ,取样规模和地点见表 1。按常规的酚-氯仿抽
提法提取基因组 DNA , TE 溶解后-20℃保存 。
表 1　牛亚科各物种样品数量及来源
Table 1　Source and size of 4 bovinae species samples
物种 Specie s 品种 Breed 数量 Number 地点 Site
普通牛 Bos taurus 蒙古牛 Mongo lia ca ttle(MG) 18 新疆维吾尔自治区和静县巴音布鲁克区
瘤牛 Bos indicus 雷琼牛 Leiqiong cattle(LQ) 18 广东省雷州市郊区
牦牛 Bos grunniens 巴州牦牛 Bazhou yak(MN) 18 新疆维吾尔自治区和静县巴音布鲁克区
大额牛 Bos f rontalis 独龙牛 Dulong gayal(DL) 12 云南省怒江州贡山县独龙牛场
1.2　PCR引物和扩增反应
　　参考普通牛 MST N 基因序列(GenBank A c-
cession No:AB076403)设计 3 对 PCR引物[ 8] (上
海基康生物技术有限公司合成)(P1上游:5′GGCT-
TGGCGT TACTCAAAAGC3′, P1 下游:5′CTC-
CTCCTTACA TACAAGCCAGCAG3′;P2 上游:5′
G TTCA TAGAT TGA TA TGGAGG TGT TCG3′,
P2 下游:5′ATAAGCACAGGAAACTGG TAG T-
TA T-T3′;P3 上游:5′GAAA TGTGACATAAG-
CAAAA TGAT TAG3′, P3 下游:5′A TACTCTA-
GGCT TATAGCCTG TGGT3′)。以各样本基因组
为模板 , PCR反应体系 25 μL ,其中含 1×buf fer ,
Mg
2+
2.5 μmo l/L ,dNTP 400 μmol/ L ,引物各 0.4
μmol/L , Taq DNA 酶 1 U , 以及模板 1 μL。循环
体系为:94℃3 min;94℃ 30 s , 51℃ 30 s , 72℃ 30
s ,34 cycles;72℃3 min;4℃保存 。
1.3　扩增片段的序列测定
　　PCR产物在 1.2%的琼脂糖凝胶或 10%PAGE
胶中电泳及银染检测大小 、纯度及浓度 。由上海
SANGON 生物技术有限公司进行 PCR产物的纯化
与测序。
1.4　基因序列比较分析
　　将所获得序列在 DNAstar 、DnaSP 和 Meg 3.1
软件上进行比较与统计分析。
1.5　系统树构建
　　采用 kimura双参数模型 ,以水牛(Bubalus bu-
balis ,GenBank Accession No:DQ091762)为外群 ,
邻接(NJ)法构建分子系统树 ,系统树各分枝的置信
度由 1 000次自检法重复检测所得 。
2　结　果
2.1　PCR扩增反应结果
　　应用所设计的引物 ,分别以各基因组 DNA 进
行 PCR 扩增反应 , 相应地获得了 3 个外显子的
PCR产物带[ 8] 。测序分析为目的条带 。
2.2　序列测定结果与统计分析
　　通过测序 ,获得所有 4个牛种MSTN 基因3个
外显子的序列并进行比对(表 2), 以外显子 1中起
始密码子 ATG 的 A为 1号位点(nt1),依次对外显
子区计数 。经过比对分析 ,在所检 66个样本中 ,存
在 7个核苷酸多态位点 ,共计 1个位点(aa235)发生
组氨酸(His)到精氨酸(Arg)的变异。定义 17种单
倍型 , 4 个 牛 种 (GenBank 登 录 号:雷琼 牛
EF438802 -EF438819 和 蒙古牛 EF467376 -
EF467393 ,牦牛 EU372977 , 独龙牛已提交 Gen-
Bank)共有 1 种单倍型 ,雷琼牛与牦牛共有另 1种
单倍型 。
　　统计不同位点的核苷酸变异情况(表 3),4个牛
种 MSTN 基因 3个外显子的序列群体内核苷酸歧
异度(P i)以大额牛最低(0.000 36), 瘤牛最高
(0.001 03);群体间核苷酸歧异度(D xy)以牦牛-大
702
　6期 冀德君等:中国牛属 4个物种 MS TN 基因的遗传变异研究
表 2　牛属 4 个物种MSTN基因外显子序列比较
Table 2　Sequence analysis of MSTN exons
in 4 bovinae species
单倍型
H aplo type
1
1
1
4
1
4
6
3
9
7
0
4
7
9
8
1
0
7
7
1
0
8
3
群内比例/ %
Ratio w ithin
population
MG1 G C G A A A C 55.6
MG4 · T · · · · · 44.4
LQ14 · · · · · · · 5.55
LQ9 · · · · · C · 11.1
LQ2 C · · · · C · 5.55
LQ1 · · · · · C T 25
LQ3 · · · · · · T 8.35
LQ5 C · · · · · T 8.35
LQ4 C · · · · C T 36.1
MN1 · · · G · · · 11.1
MN2 · · · · · · · 66.7
MN4 · · · G G · T 5.55
MN6 · · · · · · T 5.55
MN09 · T · · G · T 5.55
MN10 · · · G G · · 5.55
DL1 · · A · · · · 25
DL3 · · · · · · · 75
额牛最低(0.000 76),牦牛-瘤牛最高(0.003 22)(表
4)。
2.3　系统发育关系分析
　　以水牛为外群 ,构建了基于 kimura双参数模型
邻接(NJ)树(图 1)。牦牛与一支蒙古牛聚成一类 ,
雷琼牛在不同水平上和其它牛分支相聚后 ,再与牦
牛独龙牛相聚 , 最后与水牛相聚 。结果说明 , 就
MSTN 基因外显子序列而言 ,亚洲水牛与其它 4个
物种间 ,普通牛 、瘤牛与牦牛 、大额牛间 ,以及普通牛
与瘤牛间的分化水平不在同一层次上;普通牛与瘤
牛最近 ,其次是两者与牦牛 、大额牛间的关系 ,而四
者与亚洲水牛关系最远。独龙大额牛分为 2支 ,其
中一支包含普通牛瘤牛以及牦牛类群 。
3　讨　论
　　4个牛属物种群体 MS TN 基因外显子序列的
种间和种内变异含有 1个氨基酸位点的变异 ,而牛
属家畜 MSTN 基因 3个外显子在总长约 7.7 kb的
基因序列中仅占很小区段。本研究结果表明 ,结构
基因的分子变异可能只有极少部分能为选择提供材
料 ,绝大部分仍然是中立和随机的。本研究中 ,以核
表 3　4 个牛属群体内MSTN基因外显子序列歧异度
Table 3　Polymorphism of MSTN exons within each 4 bovinae population
物种
Species
数量
Number
序列大小/ bp
Sequence size
多态位点数
Number o f
polymo rphic sites
群内核苷酸歧异度
Nucleo tide dive rsity
w ithin population(Pi)
单倍型数
Number o f
Haplotypes
单倍型多样性
Haplotype
dive rsity
普通牛 Bos taurus 18 1 128 1 0.000 46 2 0.523
瘤牛 Bos indicus 18 1 128 3 0.001 03 7 0.614
大额牛 Bos f rontalis 12 1 128 1 0.000 36 2 0.409
牦牛 Bos grunniens 18 1 128 4 0.000 94 6 0.562
表 4　4 个牛属群体间 MSTN 基因外显子序列歧异度(Dxy)
Table 4　Interpopulation polymorphism of MSTN exons among 4 bovinae populat ions
物种 Species 普通牛 Bos taurus 瘤牛 Bos indicus 大额牛 Bos f rontalis 牦牛 Bos grunniens
普通牛 Bos taurus
瘤牛 Bos indicus 0.002 41
大额牛 Bos f rontalis 0.001 50 0.003 13
牦牛 Bos grunniens 0.001 78 0.003 22 0.000 76
编码基因序列分析为基础 ,发现牦牛在 2个位点上
存在区别于瘤牛和普通牛独特碱基 ,初步说明牦牛
与黄牛(普通牛和瘤牛)的分化是显著的 ,与它们的
亲缘关系较瘤牛和普通牛间关系要远 ,也为六属划
分系统中牦牛划为属提供了一定的支持 。
　　关于大额牛的起源 ,有研究认为独龙牛起源于
雄性野牛和雌性瘤牛[ 9] ,也有研究认为独龙牛是一
个多起源的牛种[ 10] ,另据当地民间流传的说法 ,独
龙牛是野牛被拘捕后经长期驯化而成的半野生半家
养类型 ,其驯化时间至少在数百年以上 。大额牛具
703
畜　牧　兽　医　学　报 39 卷　
图 1　基于 kimura 双参数模型构建的 4 个牛属群体
的邻接(NJ)树
Fig.1　NJ tree based on kimura 2-parameter model
for 4 Chinese Bos populations
有一定的与瘤牛 、普通牛和牦牛的杂交能育性[ 11] 。
独龙大额牛作为大额牛物种中特色鲜明的种群 ,是
我国目前充分控制的唯一大额牛资源 ,已由初始的
77头繁育到目前的约 3 000头 。
　　大额牛未独立分为单支 ,而是分为两支 ,其原因
可能有两种:其一是杂交的影响;其二 ,它可能是牛
亚科物种中一个更古老种群的遗族 。这一问题有待
从多个角度进一步探讨。
参考文献:
[ 1 ] 　郑丕留.中国牛品种志[ M] .上海:上海科学技术出版
社 , 1986.
[ 2 ] 　SUN W B , CH EN H , LEI C Z , e t al.Study on popu-
lation genetic characteristics of qinchuan cows using
micro satellite marker s[ J] .Journal o f Genetics and
Genomics , 2007 , 34(1):17-25.
[ 3] 　武　彬.秦川 、晋南和南阳黄牛血清乳酸脱氢酶谱型
的初步研究[ J] .畜牧兽医学报 , 1988 , 19(1):18-22.
[ 4] 　MA Z J , ZHONG J C , CH ENG Z H , e t a l.Se-
quence va riation and mo lecular evolution o f ho rmone-
sensitive lipase gene s in specie s of bovidae[ J] .Jour-
nal of Genetics and Genomics , 2007 , 34(1):26-34.
[ 5] 　雷初朝.中国 4 个畜种黄牛水牛牦牛家驴线粒体
DNA 遗传多样性研究[ D] .杨凌:西北农林科技大
学 , 2002.
[ 6] 　MCPH ERRON A C , LEE S J.Double muscling in
cattle due to mutations in the myostatin gene [ J] .
P roc Natl Acad Sci USA , 1997 , 94 (23):12 457-
12 461.
[ 7] 　KAMBADU R R , SH ARMA M , SM ITH T P , et al.
Mutations in myostatin (GDF-8) in double-muscled
Belgian Blue and Piedmontese cattle[ J] .Genet Res ,
1997 , 7:910-916.
[ 8] 　TAY G K , IASCHI S P A , BELLINGE R H S , et
al.The development of sequence-ba sed-typing o f my-
ostatin (GDF-8)to identify the double muscling phe-
no type in the goat [ J] .Small Ruminant Resear ch ,
2004 , 52:1-12.
[ 9] 　WINTER H , MAYR B , SC HLEGER W , et al.Kar-
yo typing , red blood cell and haemog lobin typing o f
the mithun(Bos f rontalis), its w ild ancesto r and its
hybrids[ J] .Research in Ve te rinary Science , 1984 ,
36(3):276-283.
[ 10] 　兰　宏 , 雄习昆 ,林世英 , 等.云南黄牛和大额牛 mtD-
NA 多态性研究[ J] .遗传学报 , 1993 , 20(5):419-
425.
[ 11] 　赵开典 , 欧茶海 ,黄玉路 , 等.云南省珍稀畜种资源—
独龙牛保护与研究工作现状及对策[ J] .黄牛杂志 ,
2003 , 29(2):71-74.
704