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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(7):93-98
EST-SSR 又称表达序列标签微卫星（EST-based
microsatellite），是在 SSR 标记基础上发展出来的一
种新的标记方法。EST-SSR 标记是指在已知的 EST
序列中，筛选出含有 SSR 的序列，根据简单重复序
列两端的保守序列设计引物进行 PCR 扩增，由于植
物上不同物种间微卫星重复单元的碱基组成和拷贝
数不同而显现出多态性［1］。由于 EST-SSR 侧翼序列
在物种之间高度保守，EST-SSR 标记可在不同物种
之间通用［2］。EST-SSR 具有开发过程简单、成本低、
能够反映出转录区的差异等优点，所以成为微卫星
标记的引物重要的来源。因此，EST-SSR 分子标记
的方法可以作为一种既简便又高效的进行木瓜属植
物亲缘关系远近的判断和进行品种鉴定的工具。木
瓜属（Chaenomeles）为蔷薇科（Rosaceae）苹果亚
收稿日期 ：2015-10-27
基金项目 ：国家科技支撑计划（2011BAI06B06），山东省科技发展计划项目（2011GSF11904）
作者简介 ：张艳艳，女，硕士研究生，研究方向 ：中药质量控制与资源 ；E-mail ：yan13579.com@qq.com
通讯作者 ：郭庆梅，女，教授，博士生导师，研究方向 ：中药质量控制与资源 ；E-mail ：qmguo@sina.com
利用苹果 EST-SSR分析木瓜属种质遗传多样性
张艳艳1 齐红2 郭庆梅1 孙稚颖1 周凤琴1 李圣波3
（1. 山东中医药大学，济南 250355 ；2. 济南市食品药品检验检测中心，济南 250001 ；3. 山东亚特生态技术有限公司，临沂 266071）
摘 要： 利用苹果属的 EST-SSR标记对 33份木瓜种质资源进行遗传多样性研究，以分析引物在木瓜属中的通用性。筛选出
15对引物进行 PCR扩增，其中 9对引物显示多态性，共扩增出 71条带，其中多态性条带 59条，多态性条带比率 83.10％，并且
可成功区分不同种。PIC多态性信息含量平均值为 0.45，Nei’s 基因多样性（H）、Shannon指数（I）的平均值分别为 0.45、0.71。
根据 EST-SSR 数据的 UPGMA聚类分析将材料分为五大类，木瓜属的不同基原样本各聚为一支，能很好地将 5个种植物区分，显
示出单系性。研究结果表明，苹果属的 EST-SSR标记在木瓜属上具有高度的可转移性，可应用于木瓜属植物的资源评价及遗传关
系研究。
关键词： EST-SSR ；木瓜属；通用性
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.014
Analysis of Genetic Diversity in Chaenomeles Using Apple EST-SSRs
ZHANG Yan-yan1 QI Hong2 GUO Qing-mei1 SUN Zhi-ying1 ZHOU Feng-qin1 LI Sheng-bo3
（1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji’nan 250355；2. Jinan Food and Drug Control/Testing Center，Ji’nan 250001；
3. Shandong Yate Eco-tech Co.，Ltd.，Linyi 266071）
Abstract: EST-SSR markers of Malus pumila Mill. were selected to investigate the genetic diversity of germplasm resources in 33
cultivars of Chaenomeles，and hence to confirm the transferability of SSRs information from Malus to Chaenomeles. In this study，15 selected
primers were employed for PCR amplification and 9 primers presented polymorphic bands ；71 bands were generated by all EST-SSR，of which
59（83.10%）were polymorphic ；the different cultivars listed here were successfully distinguished. The average of polymorphic information
content（PIC）were 0.45. The average of Shannon index（I） and Nei’s genetic diversity index（H）were 0.71 and 0.45. UPGMA cluster
based on the EST-SSR data，the materials were divided into 5 groups. Different samples of Chaenomeles were gathered together and could be
distinguished by system tree. The results showed that EST-SSR markers developed from M. pumila showed high transferability to Chaenomeles，
and they may be used in germplasm evaluation and genetic relationship for Chaenomeles.
Key words: EST-SSR ；Chaenomeles；transferability
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.794
科（Maloideae）植物，本属全世界有 5 个种，分别
为木瓜（C. sinensis）、皱皮木瓜（C. speciosa）、毛叶
木瓜（C. cathayensis）、西藏木瓜（C. thibetica）及日
本木瓜（C. japonica）。木瓜是一种名贵的药食两用
药材，具有舒筋活络和胃化湿之功效［3］。木瓜属植
物亲缘关系复杂，同物异名和同名异物现象十分普
遍。因此，开发出一种快速有效的方法对木瓜品种
进行鉴定分类十分必要。
《中国药典》2010 年版规定药用木瓜为蔷薇科
植物贴梗海棠 Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai 的
干燥近成熟果实，味酸、性温，归肝、脾经，具舒
筋活络和胃化湿等功效。木瓜在部分省区以光皮木
瓜或榠楂入药 ；毛叶木瓜分布较广，产量高，据报
道为市场皱皮木瓜的主要来源 ；西藏木瓜多野生，
仅在西藏、云南等部分地区有分布和使用 ；而日本
木瓜曾在部分地区当作木瓜，现未见继续使用。木
瓜种质变异与分化严重，形成了很多的农家品种，
随之药材的产量和质量也发生明显的差异。目前需
要对种质样品间的遗传多样性进行分析，探索木瓜
不同种质样品间遗传多样性与形态学特征之间的对
应关系。由于目前木瓜属基因水平研究还处于起步
阶段，木瓜属的 EST 库尚未建立，从其近缘植物开
发引物是进行研究的有效途径。本研究从苹果属中
筛选出适合木瓜属遗传分析的 ESR-SSR 引物，进行
基因组 DNA 扩增，从分子水平上分析其遗传关系，
旨在探讨苹果属ESR-SSR引物用于木瓜属的可行性，
以期简便高效的对木瓜属植物进行品种鉴定，判断
亲缘关系远近。
1 材料与方法
1.1 材料
2014 年 4 月在山东亚特生物有限公司木瓜种
植基地采集 33 份木瓜属种质资源，其中西藏木瓜
样品编号 XZ01-05、毛叶木瓜 MY01-03、皱皮木瓜
ZP01-19、日本木瓜 RB01-03、光皮 GP01-03，采
摘各植株的幼嫩叶片，硅胶干燥保存。
1.2 方法
1.2.1 EST-SSR 引物查找 苹果属 EST 序列来源于
PlantGDB（http://www.plantgdb.org/）和 NCBI（http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST），检索到并且下载了
339 058 条，查询截止时间为 2014 年 11 月 2 日。
采 用 EST-trimmer（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/
misa/download/est_trimmer.pl）软件去除 5端或 3端
带有 polyA 或 polyT 尾巴的序列，并截去过短的低质
量序列片段。采用 CAP3 软件对 EST 序列进行聚类
和拼接处理，以获得无冗余和尽可能长的重叠序列
（contig）。通过Perl 语言的 MISA程序筛选SSR位点，
筛选标准［4］为 ：序列长度不小于 100 bp 且不大于
700 bp，单核苷酸重复的次数≥ 10 次，二核苷酸重
复的次数≥ 6 次，三到六核苷酸重复的次数≥ 5 次。
1.2.2 EST-SSR 引物设计 利用 Primer 5.0 软件对符
合条件的 EST-SSR 序列进行引物设计。参数设置为：
产物长度设为 100-350 bp，引物长度为 18-22 bp，
最佳为 20 bp，GC 含量 40%-60%，引物退火温度为
50-60℃ ；尽量避免 Dimer 和二聚体出现，从软件给
出 96 分以上的引物中选取 25 对合成引物，引物由
上海生工合成。
1.2.3 DNA 的提取和 PCR 扩增 实验材料均为硅
胶干燥叶片，取样约 20 mg，液氮充分研磨，利
用 DNA 提取试剂盒提取 DNA。PCR 反应体积为 20
μL，体系内含：2×Taq master mix 12.5 μL、ddH2O 9.5
μL、引物各 1 μL（2.5 μmol/L）、DNA 模板 1 μL（约
30 ng）。PCR 扩增程序为 ：94℃预变性 5 min ；94℃
变性 45 s，适宜退火温度 45 s，72℃延伸 1 min，35
次循环 ；72℃延伸 7 min，4℃保存。
1.2.4 PCR 产物的检测 扩增产物在 1% 琼脂糖凝
胶电泳上检测，条带清晰并与预期片段大小相近的
SSR 产物表明扩增成功。具有清晰条带的扩增产物
通过 6% 聚丙烯酰胺凝胶分离，在 120 V 恒压下电
泳，电泳时间为 2 h，银染后观察并照相。
1.2.5 数据分析 用数字 1 和 0 分别表示电泳条
带的有或无，在 Excel 中建立 1 和 0 矩阵。利用
NTSYS-pcversion2.11 软件进行数据处理，品种间的
相似系数按 Jaccard 公式计算，以非加权类平均法
（unweighted pair-group method with arithmetic averages，
UPGMA） 进 行 聚 类 分 析 和 构 建 系 统 树。 利 用
Popgene32 软件进行数据分析，计算多态性条带所
占的比率（PPB%），观测等位基因数（Number of
putative alleles，na）、有效等位基因数（Number of
effectivealleles，ne）、Nei’s 遗传多样性指数（H）
2016,32(7) 95张艳艳等 ：利用苹果 EST-SSR 分析木瓜属种质遗传多样性
和Shannon.s指数（I），SSR 位点的多态性信息量（PIC）
按 Smith 等［5］的公式计算，即 PIC=1- ∑ fi2，其中
fi 为 i 位点的基因频率。以评价苹果属植物 EST-SSR
引物在木瓜属 SSR 标记的可行性。
2 结果
2.1 EST-SSR引物的信息分析
对来自苹果属 EST 库的 339 058 条单一基因序
列经拼接后，得到无冗余 contigs 25 727 条，采用
MISA 脚本共搜索到含 SSR 位点的 EST 序列 3 228
条，共搜索到 SSR 位点 3 885 个。在所有可用的
EST-SSR 序列中，以二核苷酸为重复单元的序列最
多，为 2 534 条，占 65.23%，二核苷酸重复类型中
以 AG/CT 最为丰富，其次为 AT/AT。
2.2 EST-SSR引物筛选结果
利用 Primer 5.0 软件设计 EST-SSR 引物，结合
自动与人工筛选，共得到 25 对备选引物。利用不同
引物对随机选取的部分品种基因组 DNA 样品初步扩
增筛选，筛选出条带清晰的 9 对引物（表 1），有效
扩增率为 30%。利用引物 M7 对不同品种扩增，结
果（图 1）表明利用苹果属 EST 序列应用于木瓜属
表 1 EST-SSR引物信息
引物编号 重复基元 产物大小 /bp 引物序列（5-3） Tm 值 /℃
M1 （TC）18 273 TGCCTGGTGCCTTGTTGT 54
AGCGGCTTCTCCACGACT
M2 （TCA）6 297 AGGGTTGGTTGTGATGAA 51
TACTTTGGTGGAGCAGGA
M3 （GAC）9 253 CCTGAGCGATTGAGTAGCC 53
ATCCTCGTTTCCATCTTCCT
M4 （TCG）5 320 GCTCCCAATCGCCGTAAC 55
ATGGCAGAAATCAGCAAAGA
M7 （GCT）11 302 GGCAATGCTTCACTCACT 54
AACTCCAACCACCTCTTTC
M10 （CA）10 313 TGGAGGGAAAGGAGAAGC 56
AAGTGGCAGGCAGCAGTA
M12 （TGG）5 275 AAGACCTCCGACGACAAC 54
ATCAAATCAATGGCTGCTC
M13 （GA）15 317 TCATAATCTCGCATTCTCC 53
TACCCACAAATCCCAGTC
M18 （GA）14（GGGA）6 290 AATCGCCTGCCTAAACCC 52
AAGCCACCATCACAACCC
SSR 标记是可行的，并能有效用于木瓜种质鉴定。
2.3 EST-SSR标记的多态性分析
用筛选的 9 对引物对 33 种木瓜属植物进行多
态性分析，共得到 71 条清晰可辨的条带，其中多态
性条带 59 条，多态性条带比率 83.10%（表 2）。观
测平均等位基因数为 2.55，有效等位基因数为 1.91，
Nei’s 遗传多样性为 0.45，Shannon 信息指数为
0.71。PIC 值是衡量等位信息含量的理想指标，9 对
引物扩增后计算结果 0.25
2.4 聚类分析
UPGMA 聚类树状图（图 2）显示，SSR 标记能
将 33 份木瓜属不同种质完全区分开，其相似性系数
的变化在 0.53-0.99 之间，种质间的遗传差异性较
大。以 0.795 相似系数为阈值，能将 33 份种质资源
聚为三大类，第一类包括光皮木瓜，第二类包括全
部 19 份皱皮木瓜种质，第三类又分为 3 个亚类 ：第
一亚类包括 5 份西藏木瓜种质，第二亚类包括 3 份
毛叶木瓜，第三亚类包括 3 份日本木瓜。该聚类结
果与传统形态分类学结果大致相同，说明分子标记
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.796
的多态性与形态表现的多样性基本一致，而分子标
记能反映遗传上的差异，对物种鉴定的准确度更高。
3 讨论
由于 EST-SSR 多态位点多，信息含量高，可反
映丰富的遗传变异信息，常被用于药材及品种的鉴
定。大量研究表明，EST-SSR 引物的跨种扩增可应
用于多种植物的遗传多样性研究。杨维泽等［6］利用
百合等 3 种植物的 EST-SSR 标记对云南重楼（多叶
重楼的变种）进行扩增，成功扩增出预期条带，结
果表明在滇重楼中具有较高的通用性。陈永霞等［7］
选取小麦、玉米等禾谷作物的 EST-SSR 引物研究
扁穗牛鞭草的遗传变异和亲缘关系，结果表现出丰
富的遗传多样性。目前，在蔷薇科的属种间证实了
ESR-SSR 引物的通用性。例如，秦玥等［8］从蔷薇
科 EST 库中开发了 10 对华仁杏 SSR 引物，为华仁
杏资源的品种鉴定及分子标记辅助育种研究奠定基
础。Vendramin 等［9］从桃 EST 库中设计合成了 21
对 EST-SSR 引物，在李属的 6 个种植物中扩增，扩
增成功率高达 78.1%。而通过苹果属 SSR 引物探究
EST-SSR 标记在其他属种间的通用性研究更为广泛，
主要用于山楂［10］、梨［11］等，已有 14 个 SSR 引物
被定位到了梨的公共图谱［1］。
由于目前木瓜属基因组研究工作落后，难以在
较短的时间开发大量的 EST-SSR 标记，而木瓜和苹
果同属于蔷薇科苹果亚科，具有较高的同源性。本
研究采用苹果属植物上开发的 EST-SSR 标记，在木
瓜属植物上获得较高的可转移性，说明这些从苹果
基因组开发的 EST-SSR 的序列在木瓜属上保守性较
高，并且可以揭示一定的多态性水平。
由 EST-SSR 标记的引物筛选结果可以看出，25
对 EST-SSR 备选引物中，9 对扩增出清晰条带，有
效扩增率为 36.00%。33 份木瓜的相似系数在 0.53-
0.99 之间，种质资源间有较大的遗传变异，遗传多
样性较高。由聚类结果可知，木瓜属亲缘关系较近
的种聚在一起，其 4 个种的亲缘关系较近，仅有光
皮木瓜表现出显著的单系性，并未与其余 4 种聚为
一支，说明亲缘关系较远。这与其他分子标记，如
AFLP 标记［12］、SRAP 标记［13］、RAPD 标记［14］ 和
ISSR 标记［15］，对木瓜属遗传亲缘关系的研究结果
图 1 引物M7在 33份样品中的扩增结果
表 2 引物扩增结果
引物
编号
总条
带数 PPB/％ Na Ne H I PIC/％
M1 7 85.71 2.00 1.65 0.39 0.59 0.49
M2 4 50.00 3.00 2.04 0.51 0.75 0.39
M3 3 66.67 2.00 1.46 0.31 0.49 0.48
M4 9 66.67 2.00 1.95 0.49 0.68 0.49
M7 12 100.00 2.00 1.97 0.50 0.68 0.37
M10 8 75.00 4.00 2.99 0.66 1.22 0.50
M12 16 93.75 2.00 1.23 0.18 0.33 0.49
M13 4 50.00 2.00 1.97 0.49 0.68 0.36
M18 8 100.00 4.00 1.99 0.50 0.96 0.44
Mean - - 2.55 1.91 0.45 0.71 0.45
2016,32(7) 97张艳艳等 ：利用苹果 EST-SSR 分析木瓜属种质遗传多样性
一致。聚类图（图 2）显示西藏木瓜与毛叶木瓜聚
为一支，亲缘关系密切，本研究支持王明明等［15］
对木瓜属品种亲缘关系的 SRAP 分析的研究结果。
俞德俊等［16］也认为西藏木瓜与毛叶木瓜亲缘关系
十分紧密。
结合形态学特征分析皱皮木瓜 19 个样品的聚类
结果，发现单独聚为一类都具有比较典型的区别于
其他单株的形态学特征，尤其是花色、花型。其中
单独分支的 ZP06、ZP07、ZP19 在形态学特征也与其
他差异明显，表现为叶长圆状披针形，下表面有褐
柔毛，大果型，种子呈扁三角形。其他多为中小果
型，种子多呈长三角形，聚类结果与形态方面也有
对应一致的差异结果，如 ZP04、ZP05 花大红色，
ZP09、ZP11 花色为浅粉色，ZP12、ZP13 为粉白色，
ZP08、ZP14、ZP15、ZP16 的气香浓郁。张亚利［17］
的研究也证实分子标记聚类结果和形态学聚类结果
有一定的一致性。
基于 EST 数据库开发的苹果 EST-SSR 引物是可
行的，并能用于木瓜属种质的鉴定，同时在指纹图
谱构建、种质资源分析、遗传作图等研究方面有广
阔的应用前景。因此，从近缘物种 EST-SSR 上开发
更多的木瓜属 SSR 引物是有效途径。
4 结论
利用苹果 EST 数据库开发了 9 对多态性丰富
的 EST-SSR 引物，并用其对 33 份木瓜属品种资源
的亲缘关系进行研究，共扩增出结合位点 71 个，总
的多态性比率为 83.10%，供试材料相似系数的变化
在 0.53-0.99，在相似性系数 0.795 处可将 33 份材料
分为 3 组。本研究结果表明筛选的 9 对苹果属 EST-
SSR 可用于木瓜属种质的鉴定。
致谢：山东省农业科学研究院生物信息中心王
兴军教授的课题组提供本研究分子实验平台，特此
感谢。
图 2 基于 EST-SSR 分析 33个种质的遗传相似性聚类图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.798
参 考 文 献
［1］Bouek A, Vision TJ. The molecular ecologists guide to expressed
sequence tags［J］. Molecular Ecology, 2007（16）：907-924.
［2］李明芳 , 郑学勤 . 开发 SSR 引物方法之研究动态［J］遗传 ,
2004, 26（5）：769-776.
［3］国家药典委员会 . 中华人民共和国药典（2010 版）［S］. 北京：
化学工业出版社 , 2010++2.
［4］Scott KD, Eggler P, Seaton G, et al. Analysis of SSR derived from
grape EST［J］. Theoretical and Applied Genetics, 2000（100）：
723-726.
［5］肖木辑 , 李明顺 , 李新海 , 等 . 东北地区主要玉米自交系的 SSR
遗传多样性分析［J］. 华北农学报 , 2006, 21（增刊）：23-27.
［6］杨维泽 , 许宗亮 , 杨绍兵 , 等 . 三种植物 EST-SSR 引物在滇
重楼上的通用性分析［J］. 西南农业学报 , 2014（4）：1686-
1690.
［7］陈永霞 , 张新全 , 谢文刚 , 等 . 利用 EST-SSR 标记分析西南扁
穗牛鞭草种质的遗传多样性［J］. 草业学报 , 2011（6）：245-
253.
［8］秦玥 . 华仁杏品种资源 SSR 指纹图谱构建研究［D］. 北京 ：
中国林业科学研究院 , 2013.
［9］Vendramin E, Derrori MT, Giovinazzi J, et al. A set of EST-SSRs
isolated from peach fruit transcriptome and their transportability
across Prunus species［J］. Mol Eco Not, 2007（7）：307-310.
［10］张叶 , 代红艳 , 张琪静 , 等 . 利用苹果 SSR 引物分析山楂属植
物遗传关系［J］. 果树学报 , 2008（4）：521-525.
［11］路娟 , 吴俊 , 张绍铃 , 等 . 基于苹果 EST-SSR 的梨种质资源遗
传多样性分析［J］. 西北植物学报 , 2010（4）：690-696.
［12］臧德奎 , 陈红 , 郑林 , 等 . 木瓜属优良品种亲缘关系的 AFLP
分析［J］. 林业科学 , 2009（8）：39-43.
［13］王明明 , 陈化榜 , 王建华 , 等 . 木瓜属品种亲缘关系的 SRAP
分析［J］. 中国农业科学 , 2010（3）：542-551.
［14］陈红 . 木瓜属种质资源的 RAPD、AFLP 亲缘关系鉴定及遗传
多样性分析［D］. 泰安 ：山东农业大学 , 2008.
［15］ 聂金娥 . ISSR 和 SRAP 对木瓜种质遗传多样性研究［D］.
济南 ：山东中医药大学 , 2013.
［16］ 俞德俊 , 关克俭 , 陆玲娣 , 等 . 中国植物志［M］. 第 36 卷 .
北京 ：科学出版社 , 1974 ：348-354.
［17］ 张亚利 . 形态学性状及 AFLP 标记在木瓜海棠新种质鉴别和
分类中的应用［J］. 江苏农科学 , 2010（4）：145-147.
（责任编辑 李楠）