全 文 ：　第 41 卷 2005年第 3期 　　　　　西　北　师　范　大　学　学　报 (自然科学版)
　Vo l. 41　2005　No. 3 　　　　　Journal of No rthwe st No rmal University (Natura l Science)　
收稿日期:2005-01-10;修改稿收到日期:2005-04-26
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30270091);甘肃省教育厅科研项目(041-18)
作者简介:张辉 (1973—), 男 , 甘肃天水人 , 讲师 , 在读硕士研究生. 主要研究方向为植物细胞与分子遗传学.
沙棘属植物 RAPD-PCR反应条件的优化
张　辉 , 张建清 , 苏　雪 , 张超强 , 杜　斌
(西北师范大学 生命科学学院 , 甘肃 兰州　730070)
摘　要:采用 L16(45)正交试验设计研究了沙棘属植物 RAPD-PC R反应中 DNA 模板浓度 、 引物浓度 、 dNTPs 浓度 、
Mg 2+浓度和 Taq 酶含量等 5 个因素对于 PCR扩增效果的影响 , 并对照温度梯度探讨了退火温度等热循环参数 , 确定
适合沙棘属植物的最佳扩增体系为:模板 DNA 1. 0 mg L - 1 , 引物 3. 0 μmo l L - 1 , dNTPs 0. 1 mmo l L - 1 , M g2+
2. 5 mmo l L - 1 , Taq 聚合酶 8. 33～ 16. 67 nkat;扩增程序中最适退火温度为 35～ 36 ℃.
关键词:沙棘;RAPD;体系优化
中图分类号:Q 946-33　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1001-988 Ⅹ(2005)03-0063-04
Optimization of RAPD-PCR reaction conditions of
the genus Hippophae
ZHANG Hui , ZHANG Jian-qing , SU Xue , ZHANG Chao-qiang , DU Bin
(Co llege o f Life Science , Nor thw est No rmal Univer sity , Lanzhou 730070 , Gansu , China)
Abstract:By applying L 16(45) o rthogonal experiment , five essential factors tha t might affect the result of
RAPD are compared and optimized. The comparison show s that the optimal condi tion of five factors in
RAPD-PCR reaction system is template DNA 1. 0 mg L - 1 , random primer 3. 0 μmo l L - 1 , dN TPs 0. 1
mmo l L - 1 , Mg 2+ 2. 5 mmo l L - 1 and Taq polymerase 8. 33 ～ 16. 67 nkat . 35 ～ 36 ℃ is regarded as the
optimal annealing temperature in amplification procedure s.
Key words:Hippophae;RAPD;system optimization
　　传统分类方法在沙棘属植物(Hippophae. L)
系统进化研究方面已经取得了一定的成果[ 1 , 2] , 但
由于沙棘属植物分布广泛 , 异株授粉兼营养繁殖 ,
种内变异丰富多样 , 种间性状交错复杂 , 在类群划
分和种间关系研究等方面仍存在许多疑问[ 3 ] . 随
机扩增多态性 DNA(RAPD)技术是 20世纪 90 年
代建立起来的一项经济快捷的 DNA 分子标记技
术 , 现广泛应用于植物居群遗传多样性分析和基因
定位研究等领域 , 而且在种间亲缘关系研究方面也
有极好的应用价值[ 4 ] . 但是 , RAPD技术的最大
缺点是 PCR扩增谱带对实验程序和条件的变化非
常敏感 , 稳定性和再现性差 , 一般认为建立最佳反
应体系并优化扩增程序是增强 RAPD 实验可重复
性和可比性的有效途径[ 5 ] . 为了应用 RAPD技术
深入研究沙棘属植物类群的遗传与进化关系 , 笔者
选取了模板浓度 、 引物浓度 、 Taq 聚合酶用量 、
dNTP s 浓度 、 Mg 2+浓度等 5 个重要因素 , 采用
L16(45)正交试验设计 , 建立了 RAPD-PCR的最佳
反应体系 , 并在此基础上进一步筛选了最适的扩增
退火温度.
1　材料和方法
1. 1　材料
在沙棘属植物不同类群各自的分布地域 , 采集
63
西　北　师　范　大　学　学　报 (自然科学版) 　　 第 41 卷　
Journal of Nor thw est Normal Unive rsity (Natural Science) 　　 Vo l. 41　
植株茎尖幼叶 , 硅胶干燥 , 带回后放入冰箱中保
存. 实验材料见表 1.
表 1　实验材料及采集地
编号 类群名称 采集地
1 西 藏 沙 棘 Hippophae t ibetana
Schlecht .
四川理塘至甲洼途中
2 卧 龙 沙 棘 H. rh amnoides sp.
wolongensis 四川汶川县卧龙乡
3 肋 果 沙 棘 H. neurocarpa sp.
neurocarpa 青海祁连高大板鹿场
4 棱 果 沙 棘 H. goniocarpa sp.
goniocarpa
青海祁连县拱北湾
5 中 国 沙 棘 H. rh amnoides sp.
sinensis
青海祁连县小东草沟
6 中 亚 沙 棘 H. rh amnoides sp.
turkestanica
新疆吉木萨尔泉子镇
7 云 南 沙 棘 H. rh amnoides sp.
yunnanensis
四川康定县城郊
8 密 毛 肋 果 H. neurocarpa sp.
沙 棘　　　 stel lato pi losa 青海省玉树县结古镇
9 理 塘 沙 棘 H. goniocarpa sp.
li tan gensis 四川理塘甲洼乡
10 江 孜 沙 棘 H. gyan tsensi s 西藏八宿县城郊
　　Taq聚合酶 、 dNT Ps 及随机引物均购自上海
Sangon 公司 , BSA (牛血 清蛋 白)、 Fico ll 和
Tart razime 为 Sigma 公 司 产 品 , PCR 仪 为
Biometra T g rident 9600型.
1. 2　方法
1. 2. 1　基因组 DNA 提取及浓度测定　采用修改
的 CTAB法[ 6 ] 提取基因组总 DNA , 溶于 1×TE
缓冲液后低温储存. 总 DNA 样品在 0. 008 g
mL
- 1琼脂糖凝胶中电泳 , 以浓度梯度为 10 mg
L
- 1 , 50 mg L - 1和 100 mg L - 1的标准 λDNA
做对照 , 检测基因组 DNA 的浓度.
1. 2. 2　PCR反应体系中各组分浓度搭配的正交设
计　在参考同类工作[ 7 ～ 9] 并充分考虑缓冲体系 、扩
增程序等影响因素的基础上 , 选取了模板浓度 、引
物浓度 、 Taq聚合酶用量 、 dNTPs浓度和 Mg 2+浓
度 5个重要因素 , 从高到低确定各因素的 4个不同
水平(表 2). 根据 5因素 4水平查正交表L16(45)设
计试验方案(表 3).
表 2　PCR反应体系的 5因素 4水平表
水平
因　　　　素
A B C D E
引物浓度 /(μmo l L - 1) 模板浓度 /(mg L - 1) MgCl2 浓度 /(mmol L - 1) dNTPs 浓度 /(mmol L -1) Taq酶用量 /nkat
1 1. 0 0. 1 1. 0 0. 1 4. 17
2 2. 0 0. 5 1. 5 0. 2 8. 34
3 3. 0 1. 0 2. 0 0. 3 12. 50
4 4. 0 1. 5 2. 5 0. 4 16. 67
表 3　各组分正交设计方案及结果赋值
试　验
组合号
引物浓度
/(μmo l L - 1)
模板浓度
/(mg L - 1)
MgCl2 浓度
/(mmol L - 1)
dNTPs 浓度
/(mmo l L - 1)
Taq 酶量
/ nkat
扩增效果
赋　值
1 1(1. 0) 1(0. 1) 1(1. 0) 1(0. 1) 1(4. 17) 1
2 1(1. 0) 2(0. 5) 2(1. 5) 2(0. 2) 2(8. 34) 1
3 1(1. 0) 3(1. 0) 3(2. 0) 3(0. 3) 3(12. 50) 1
4 1(1. 0) 4(1. 5) 4(2. 5) 4(0. 4) 4(16. 67) 2
5 2(2. 0) 1(0. 1) 2(1. 5) 3(0. 3) 4(16. 67) 1
6 2(2. 0) 2(0. 5) 1(1. 0) 4(0. 4) 3(12. 50) 0
7 2(2. 0) 3(1. 0) 4(2. 5) 1(0. 1) 2(8. 34) 2
8 2(2. 0) 4(1. 5) 3(2. 0) 2(0. 2) 1(4. 17) 2
9 3(3. 0) 1(0. 1) 3(2. 0) 4(0. 4) 2(8. 34) 1
10 3(3. 0) 2(0. 5) 4(2. 5) 3(0. 3) 1(4. 17) 2
11 3(3. 0) 3(1. 0) 1(1. 0) 2(0. 2) 4(16. 67) 3
12 3(3. 0) 4(1. 5) 2(1. 5) 1(0. 1) 3(12. 50) 1
13 4(4. 0) 1(0. 1) 4(2. 5) 2(0. 2) 3(12. 50) 1
14 4(4. 0) 2(0. 5) 3(2. 0) 1(0. 1) 4(16. 67) 1
15 4(4. 0) 3(1. 0) 2(1. 5) 4(0. 4) 1(4. 17) 0
16 4(4. 0) 4(1. 5) 1(1. 0) 3(0. 3) 2(8. 34) 0
　　注　表中括号外数字为水平标号.
1. 2. 3　PCR扩增及检测分析　以中国沙棘的S10-2
个体 基 因 组 DNA 为 模 板 , S45 (序 列 为
5′TGAGCGGACA3′)为引物 , PCR反应总体积为
10 μL , 按照表 3 的 16 个组合配制反应体系 , 在
64
　2005 年第 3 期 　　张　辉等:沙棘属植物 RAPD-PCR反应条件的优化
　2005　No. 3 　　　Optimization o f RAPD-PCR reaction conditions of the genus Hip pophae　
PCR仪中扩增. 扩增程序为:94 ℃ 1 min , 37 ℃
20 s , 2个循环;随后94 ℃2 s , 37 ℃10 s , 72 ℃
70 s , 40个循环;最后 72 ℃4 min , 4 ℃保存. 扩
增产物在 0. 015 g mL - 1琼脂糖凝胶上电泳 , 电泳
缓冲液为 0. 5×TBE , EB 染色 , 电压 4 ～ 5 V /cm ,
电泳 3 ～ 4 h后在 UVI 紫外凝胶图像分析系统上成
像拍照 , 观察分析.
根据扩增条带的有无 、数量的多少及清晰程度
把扩增结果分为 4 个等级 , 依次赋值为 3 , 2 , 1 , 0.
条带清晰 、 数目多 、 无堆积和弥散现象为最佳扩增
式样 , 赋值为 3;少而清晰与多而弥散做相同处
理 , 根据可读条带的多少分别赋值为 2和 1;无扩
增条带赋值为 0. 根据正交试验统计方法[ 10] 计算相
应的参数(K)和级差(R).
1. 2. 4　体系重复性试验　在引物和基因组 DNA
2个因素中保持其中之一不变 , 分别更换另 1个因
素 , 按照表3的16个组合重新配制反应体系 , 3次
重复正交设计试验 , 共计 48 个反应体系 , 在
Biome tra T g rident 9600 PCR 仪上一次性完成扩
增 , 检测 RAPD反应体系的可重复性和稳定性.
1. 2. 5　扩增程序优化　根据上述实验结果选取最
佳反应体系 , 在 10 ℃的范围内设置退火温度梯度 ,
继续进行 RAPD反应条件的优化. 12个梯度温度
依次为 35 , 35. 2 , 35. 9 , 37 , 38. 2 , 39. 4 , 40. 6 ,
41. 8 , 43 , 44. 1 , 44. 8 , 45 ℃.
2　结果与讨论
2. 1　正交试验的电泳结果及分析
中国沙棘 S10-2与 S45引物的正交试验扩增结
果见图 1.
图 1　S45 引物扩增 S10-2 号样品 DNA 的电泳条带
由图 1可见 , 从第 1号到第 4号组合条带数量
增多 , 清晰程度加强 , 显示了在引物浓度一定的情
况下 , 扩增效果随其他 4个组分浓度提高而增强的
变化趋势. 但由于引物浓度仅为 1水平 , 较低分子
量的2条带没有出现 , 表现为假阴性现象. 第 15
号和 16号组合在引物与模板足量的情况下没有出
现扩增条带 , 可能与酶量和 Mg2+的不足有关. 2
组合中后 2个因素都为 1 、 2水平 , 同时 , 第 6号
组合中 Taq 酶量为 3水平 , 但 Mg2+也为 1 水平 ,
加上 dNTPs为 4水平 , 可能由于大量的 dN TPs磷
酸基团与 Mg2+鳌合更加降低了 Mg2+的实际浓
度[ 11] , 所以也无扩增条带出现. 第 12 、 13 和 14
号组合在 dNTPs低浓度条件下均出现了弥散的地
毯样带 , 原因可能是引物浓度 、 Taq 酶浓度和
Mg 2+浓度都太高导致引物与模板之间的非特异性
配对增加 , 产生非特异性扩增使背景模糊[ 11] . 只
有第 11号组合谱带清晰 , 无弥散和拖尾现象 , 确
定为最佳扩增组合. 16个组合的电泳带谱根据读
带方法赋值 , 结果见表 3.
重复试验获得与图 1相似的结果(图略).
2. 2　正交试验的统计结果及分析
根据 3次重复试验的扩增条带结果和正交试验
统计方法[ 10] , 计算每次正交试验得到的 A ～ E 各因
素 (表 2) 列中相同水平所对应的指标 k 值 , 进而
统计得到均值 K 和级差 R 值 , 见表 4.
表 4　正交试验统计结果
参数 因　　　素
A B C D E
k1 4 5 5 4 5
k2 4 5 7 3 4
k3 6 7 4 5 3
k4 5 2 3 7 7
K 1 3. 33 2. 33 3. 67 5. 33 4. 00
K 2 3. 67 4. 33 3. 67 4. 67 2. 67
K 3 6. 67 6. 33 4. 33 3. 67 3. 67
K 4 3. 67 4. 33 5. 67 3. 67 7. 00
R 3. 34 4. 00 2. 00 1. 66 4. 33
　　表 4所列 k 值为 S45 引物扩增 S10-2 DNA 的
统计结果. R 值的大小反映了该因素对扩增结果的
影响程度. 从表 4中看出 , 在试验范围内 , 5个因
素中 T aq聚合酶用量和模板浓度影响最大 , 其次为
引物浓度 , 而 Mg2+浓度和 dN TPs 浓度影响最小 ,
故 Taq聚合酶用量 、模板浓度和引物浓度为主要因
素. 这与普晓兰等[ 7 ] 报道的情况基本一致 , 表明
模板浓度和引物浓度与 PCR扩增结果的极大相关
性 , 而作为小分子反应物 dNTPs的浓度对扩增影
响较小. 普晓兰等[ 8 ] 得出 Taq 聚合酶用量对 PCR
反应影响较小而 Mg2+浓度为主要因素的结论与本
65
西　北　师　范　大　学　学　报 (自然科学版) 　　 第 41 卷　
Journal of Nor thw est Normal Unive rsity (Natural Science) 　　 Vo l. 41　
试验有较大的出入 , 这可能与不同来源的 Taq聚合
酶品质不同有关 , 显示出 Taq聚合酶用量与 Mg2+
浓度之间相互依存的关系. 利用 K 值可以确定各
因素各水平的最适浓度 , 对于每一个因素均值 K
最大值依次出现在A-K 3 、 B-K 3 、 C-K 4 、 D-K 1 、 E-
K 4 , 可以初步确定反应体系中 5因素的最适条件
为:模 板 DNA 1. 0 mg L -1 , 引 物
3. 0 μmo l L - 1 , dN TPs 0. 1 mmo l L - 1 , Mg2+
2. 5 mmol L - 1 , Taq聚合酶 16. 67 nkat .
2. 3　扩增程序的优化
退火温度是影响 RAPD 反应最重要的因素之
一 , 因此 , 筛选最适退火温度是优化 RAPD 扩增
程序的重要措施之一[ 7 ～ 9] . 在上述试验因素的最适
条件下 , 同样以中国沙棘 S10-2 号样品为模板
DNA , S45作为引物 , 对退火温度进行单因素梯度
试验 , 结果如图 2所示.
图 2　退火温度对 RAPD扩增的影响
可以看出 , 在 35 ～ 45 ℃的范围内 , 温度越低 ,
扩增带越多 、越强 , 扩增效率高;温度越高 , 扩增
带减少 、变弱 , 扩增效率降低. 在保证扩增效率的
同时 , 又 要达 到 增强 特 异性 的 目 的 , 选 择
35 ～ 36 ℃较为适宜. 一般来说 , 退火温度降低 ,
能保证引物与模板的稳定配对 , 同时允许适当的错
配 , 以扩大引物在基因组 DNA 中配对的随机
性[ 8 ] .
上述反应体系和扩增程序具有较强的可重复
性 , 可应用于沙棘属植物各类群间遗传关系的研
究.
参考文献:
[ 1 ] 　廉永善 , 陈学林. 沙棘属植物的系统分类[ J] . 沙
棘 , 1996 , 9(1):15.
[ 2 ] 　廉永善 , 卢顺光 , 薛顺康 , 等. 沙棘属植物生物学
和化学[ M] . 兰州:甘肃科学技术出版社 , 2000.
[ 3 ] 　SUN K , CH EN X L , MA R J , et al. Mo lecular
phy log ene tics o f Hip pophae L. (Elaeagnaceae) ba sed
on the inte rnal t ranscribed space( ITS) sequences o f
nrDNA [ J] . P lant S yst Evol , 2002 , 235:121—
134.
[ 4 ] 　邹喻苹 , 葛　颂 , 王晓东. 系统与进化植物学中的
分子标记[ M] . 北京:科学出版社 , 2001.
[ 5 ] 　袁勇芳 , 李思光 , 许　杨 , 等. RAPD 技术重复性
的影响因素 [ J] . 江西科学 , 2000 , 18(2):120—
124.
[ 6 ] 　Doy le J J , Doyle J L. A rapid iso la tion pr ocedure for
small quantities of fresh leaf tissue[ J] . Phy tochem
Bull , 1987 , 19:11.
[ 7 ] 　王金刚 , 车代弟 , 吕立涛. 唐菖蒲 RAPD分析体系
的优化研究[ J] . 齐齐哈尔大学学报(自然科学版),
2002 , 18(1):38—41.
[ 8 ] 　普晓兰 , 李　鹏 , 杜　凡. 巨龙竹基因组 DNA 提取
及 RAPD 反应条件的优化[ J] . 昆明理工大学学报
(理工版), 2003 , 28(1):127—131.
[ 9 ] 　陈万秋 , 李思光 , 罗玉萍 , 等. 猕猴桃模板 DNA 的
提取及 RAPD-PCR 最佳反应体系的建立[ J] . 生物
技术通报 , 2003 , (3):40—43.
[ 10] 　李春喜 , 王志和 , 王文林. 生物统计学[ M] . 第二
版. 北京:科学出版社 , 2000.
[ 11] 　[ 美]迪芬巴赫 C W , 德维克斯勒 G S. PCR技术实
验指南[ M] . 黄培堂 , 俞炜源 , 陈添弥 , 等 译. 北
京:科学出版社 , 1998.
(责任编辑　孙晓玲)
66