全 文 ：5 种桉属植物的 miＲNA生物信息学预测
李崇奇1，2，3，周 鹏2，3* ，蔡望伟1* (1．海南医学院生物化学与分子生物学教研室，海南海口 571199;2．海南大学农学院，海南海口
570228;3．中国热带农业科学院热带生物技术研究所分析测试中心，海南海口 571101)
摘要 ［目的］识别桉树 miＲNA基因和寻找与桉树木质形成相关的 miＲNA，为进一步开展桉树遗传品质改良工作奠定理论基础。［方
法］将 mirBase数据库中所有植物的 3 228条 miＲNA序列提交到 psＲobot网站进行茎环结构预测，应用 blast － 2． 2． 27 +软件与 rfam数据
库和 pfam数据库比对后去除非 miＲNA序列，并应用 bioedit软件分析 miＲNA序列及前体序列的碱基组成特点。［结果］共计预测到 26
条 miＲNA前体序列和 19条不同的成熟 miＲNA序列，并发现桉树 miＲNA 序列在碱基偏倚现象，5’端第 1 碱基尿嘧啶出现的频率高达
52． 6%，而在第 19碱基胞嘧啶出现频率为 61． 1%。靶基因预测发现 3个与木质形成相关的 miＲNA。［结论］应用生物信息学方法首次
在桉树中预测到了 19条成熟 miＲNA序列，并识别到了 3个与木质形成相关的 miＲNA。
关键词 桉树; miＲNA; EST
中图分类号 S792． 39; Q74 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611( 2014) 15 －04587 －04
Bioinformatic Analysis of MicroＲNA in 5 Eucalyptus Species
LI Chong-qi，CAI Wang-wei et al ( Department of Biochemistry and Molecular Biology，Hainan Medical College，Haikou，Hainan
571199)
Abstract ［Objective］To identify Eucalyptus miＲNAs and search for those which are related to wood formation，to lay a theoretical founda-
tion for the further variety improvement in Eucalyptus． ［Methods］Prediction of stem loop structure of pre-miＲNAs was run on the web-based
software psＲobot using 3228 miＲNA sequences of all plant from mirBase database． Non-miＲNA sequences were removed by BLAST search
against rfam and pfam database． Characteristics of base composition were analyzed by BioEdit software in miＲNA sequences and their precur-
sors． ［Ｒesults］26 miＲNA precursor sequences and 19 unique mature miＲNAs were found． Nucleotide bias has been found in miＲNA se-
quences that uracil and cytosine are the dominant bases in the first position and the 19th position at the 5’end respectively． Furthermore，3
miＲNAs were considered to regulate gene about wood formation． ［Conclusion］19 unique mature miＲNAs were predicted using bioinformatic
analysis for the first time． It identified that 3 miＲNAs were related to wood formation．
Key words Eucalyptus; miＲNA; EST
基金项目 海南省研究生创新科研课题( Hyb2012-2) 。
作者简介 李崇奇( 1979 － ) ，男，山西临汾人，讲师，博士研究生，研究
方向:分子生物学。* 共同通讯作者，周鹏，研究员，从事作
物遗传育种和农业生物技术研究。* 共同通讯作者，蔡望
伟，教授，从事分子遗传学研究。
收稿日期 2014-05-04
桉属(Eucalyptus)植物统称桉树，分类学上属桃金娘科
(Myrtaceae)，原产于澳大利亚。由于其具有生长速度快、适
应性强、材质优良等特点，与松树和杨树并称为世界 3 大速
生树种之一。我国从 1890 年开始引种栽培桉树，目前栽培
面积已达 360万 hm2，占我国人工林面积的 5． 8%，占我国木
材产量的 20%［1］。目前桉树广泛用于房屋建筑、人造板、造
纸等领域，同时也是重要的潜在能源植物之一。近年来有研
究发现，桉树种植对矿山生态环境的恢复具有积极意义［2］。
桉树具有重要的经济价值，也是分子遗传育种改良的重要目
标植物之一。识别影响桉树生长速率和其他品质相关的基
因对桉树甚至其他林木树种的遗传品质改良具有重要的意
义。Lacombe等［3］首次克隆表达了冈尼桉(Eucalyptus gun-
nii)的木质素合成关键酶肉桂酰 CoA 还原酶(cinnamyl-CoA
reductase，CCＲ)。Paux 等［4］应用消减杂交技术在冈尼桉中
识别 224个与木质形成相关的基因，其中 1 /3 的基因与细胞
信号转导和细胞壁的合成相关。Ｒanik和 Myburg［5］克隆了 6
个巨桉(Eucalyptus grandis)全长的纤维素合酶基因，发现纤
维素合酶 1、2和 3主要参与植物次生壁的形成，而纤维素合
酶 4和 5则参与初生壁的合成。Ｒengel 等［6］发现冈尼桉中
与木质形成相关的基因主要是与植物初生壁和次生壁形成
相关基因及部分转录因子序列。近年来对桉树转录图谱的
研究［7 －8］更是为从全基因组水平识别和筛选木质相关基因
提供了理论基础。然而物种内部很多基因尤其是一些转录
因子都受到 miＲNA的调控，对人类的研究发现 30%的基因
都受到 miＲNA的调控［9］。miＲNA被认为参与了植物器官的
发育、代谢的调节和抗逆反应等一系列复杂生物学过程。笔
者拟应用 miＲtour 在线分析工具(http:/ /bio2server． bioinfo．
uni-plovdiv． bg /miＲTour /)［10］对冈尼桉(Eucalyptus gunnii)、
粗皮桉(Eucalyptus pellita)、蓝桉(Eucalyptus globulus)、垂尾
桉(Eucalyptus urophylla)和赤桉(Eucalyptus camaldulensis)的
表达序列标签(expressed sequence tag，EST)进行分析，然后
进行 miＲNA和靶基因预测，识别与桉树品质相关或疾病相
关的 miＲNA和其调控的靶基因，以期为未来桉树以及其它
林木分子遗传育种奠定理论基础。
1 材料与方法
1． 1 材料 从美国国家生物技术信息中心(National Center
for Biotechnology Information，NCBI)的网站(www． ncbi． nlm．
nih． gov)的 EST数据库中分别下载冈尼桉、粗皮桉、蓝桉、垂
尾桉和赤桉的 EST序列，分别为 19 841、8 871、28 949、7 440
条和 58 584 条。另外分别从 rfam(http:/ / rfam． sanger． ac．
uk /)网站和 pfam(http:/ /pfam． sanger． ac． uk /)网站下载非编
码 ＲNA数据库和蛋白质数据库。
1． 2 试验设计 分别将 5中桉属植物的 EST序列分批递交
到 miＲtour在线界面上传后参数设置如下，与已知 miＲNA序
列能够比对的最小数量(Minimum number of known miＲNAs
to be aligned)设置为 1，miＲNA序列与其互补序列的不配对
数(Maximum unpaired nt in miＲ /miＲ* )设置为 6，其他参数
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2014，42(15):4587 － 4590 责任编辑 石金友 责任校对 况玲玲
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2014.15.099
默认。下载分析结果可以得到 miＲNA序列、前体序列、最小
自由能、最小自由能指数等相关参数。然后应用 blast-
2． 2． 27 +软件中的 blastn程序将预测到的 miＲNA 前体序列
与 rfam数据库进行比对，应用 blastx 程序与 pfam数据库进
行比对，将 evalue 参数设置为 1e-6，其他参数默认，去除非
miＲNA序列，即为预测到的miＲNA序列前体，相应的miＲNA
序列即为桉树 miＲNA 序列。将预测到的成熟桉树 miＲNA
序列以 fasta格式上传到 psrobot网站(http:/ /omicslab． genet-
ics． ac． cn /psＲobot / index． php)［11］，应用靶基因预测在线工具
进行预测，选择巨桉转录组作为对照，参数选择严格模式，同
时将分值(score)设置为 2． 5。
1． 3 数据分析 应用 bioedit 统计 miＲNA及其前体的序列
长度，然后统计 miＲNA序列每个位点的碱基组成，对其碱基
偏倚进行分析。
2 结果与分析
2． 1 miＲNA预测 5种桉属所有 EST序列经过 miＲtour分
析发现有 30条序列具有茎环结构，分别与 rfam和 pfam数据
库比对后发现 1条 rＲNA序列和 3条蛋白质序列。共预测到
26条 miＲNA前体序列和 19 条不同的成熟 miＲNA 序列(表
1)。表 1 中 eca-mir857 和 egu-mir857 相同，eca-mir164、egl-
mir164和 eur-mir164 相同，eca-mir167b 和 egl-mir167b 相同，
eca-mir167a和 egl-mir167a，但由于在不同物种中发现，所以
共命名为 24个 miＲNA。赤桉中发现 miＲNA序列最多，为 12
条;而粗皮桉和垂尾桉分别仅发现 1 条成熟 miＲNA 序。前
体序列最小自由能为 －19． 6 ～ －109． 6 kcal /mol，最小自由能
指数为 0． 71 ～0． 94，GC含量为 14． 0% ～67． 9%。
表 1 新预测的桉树 miＲNA及其前体序列相关参数
序号 miＲNA miＲNA序列 ML PL MFE MFEI GC∥%
1 eca-mir530 AAGCAUUUGCACCUGCAGCU 20 170 －66． 30 0． 71 54． 7
2 eca-mir477 ACUCUCCCUCAAGGUCUUCC 20 219 －97． 20 0． 88 50． 2
3 egl-mir169 CAGCCAAGGAUGACUUGCCGA 21 150 －55． 10 0． 92 40． 0
4 eca-mir857 CUCUGUAUGUUGAAGUUGUCU 21 153 －42． 90 0． 77 36． 6
5 egu-mir857 CUCUGUAUGUUGAAGUUGUCU 21 171 －46． 50 0． 75 36． 3
6 egu-mir857 CUCUGUAUGUUGAAGUUGUCU 21 171 －49． 00 0． 78 36． 8
7 egu-mir169b GAAGCCAAGGAUGAAUUGCCG 21 152 －62． 70 0． 91 45． 4
8 eca-mir164 GAAGGAGCCCUUCUUCUCCUU 21 91 －45． 50 0． 78 63． 7
9 egl-mir164 GAAGGAGCCCUUCUUCUCCUU 21 200 －106． 60 0． 71 67． 9
10 eur-mir164 GAAGGAGCCCUUCUUCUCCUU 21 221 －109． 60 0． 73 67． 9
11 eca-mir167a GAUCACGCUGGCAGCUUCAUCUGA 24 174 －64． 90 0． 72 51． 7
12 egl-mir167a GAUCACGCUGGCAGCUUCAUCUGA 24 174 －68． 10 0． 73 53． 5
13 eca-mir477 GAUCUCCCUCAAAGGCUUCU 20 170 －56． 01 0． 78 42． 4
14 eca-mir159 GUUUUGGUUGAAGGGAGCUCC 21 221 －80． 62 0． 74 49． 3
15 eca-mir159 GUUUUGGUUGAAGGGAGCUCC 21 221 －78． 92 0． 74 48． 4
16 egu-mir169a UAGCCAAGAAUGAAUUGCCAA 21 152 －55． 84 0． 81 45． 4
17 egu-mir902 UAUGAUGCAGAUGCUUUC 18 168 －58． 30 0． 72 48． 2
18 eca-mir168 UCGCUUGGUGCAGGUCGGGAC 21 221 －109． 60 0． 78 63． 8
19 epe-mir828 UCUUGCUCAAAUGAGUAUUCCA 22 172 －73． 90 0． 94 45． 9
20 eca-mir482 UCUUUCCUAUUCCUCCCAUUCC 22 92 －38． 20 0． 83 50． 0
21 eca-mir159 UCUUUGAGUGAAGGGAGCUGU 21 170 －50． 10 0． 73 40． 6
22 eca-mir167b UGAAGCUGCCAGCGUGAUCUC 21 171 －59． 30 0． 72 48． 0
23 egl-mir167b UGAAGCUGCCAGCGUGAUCUC 21 171 －60． 70 0． 73 48． 5
24 egl-mir399 UGCCAAAGGAGAGUUGCCCUU 21 171 －70． 40 0． 82 50． 3
25 egu-mir398 UGUGUUUUCAGGUCACCCCUU 21 171 －69． 26 0． 88 46． 2
26 eca-mir1514 UUAUAUUUUUAAAAUAGACAU 21 171 －19． 60 0． 82 14． 0
注:ML为 miＲNA长度;PL为前体长度;MFE为最小自由能;MFEI为最小自由能指数。
2． 2 miＲNA和前体的碱基组成特征 预测的 miＲNA长度
为 18 ～24 bp，其中长度为 21 个碱基的 miＲNA数量最多，达
12个。miＲNA序列中嘌呤与嘧啶的比值为 1∶ 1． 26，其碱基
组成 A∶ G∶ C∶ U为1∶ 1． 05∶ 1． 15∶ 1． 43，尿嘧啶比例明显偏高。
同时发现 A、G、C、U出现频率最高的位置分别为 5’端第 11
碱基、第 13 碱基、第 19 碱基、第 1 碱基，其频率分别为
52. 6%、42． 1%、61． 1%和 52． 6%。miＲNA 前体长度为 91 ～
221 bp，平均长度为 173 bp，嘌呤与嘧啶的比值为 1． 00∶ 1． 03，
碱基组成 A∶ G∶ C∶ U为1． 00∶ 1． 15∶ 0． 96∶ 1． 25，尿嘧啶的比例
最高。
2． 3 miＲNA靶基因预测 19 个 miＲNA 中有 11 个预测到
了靶基因，共发现 104条编码序列受到 miＲNA调控，去除不
能够被注释的序列后共发现 87条靶基因序列(表 2)。其中
32条序列为与疾病抗性相关基因，13 条序列为转录因子，16
条序列为酶。靶基因数目最多的是 mir482，发现 40 个靶基
因。靶基因中与木质形成相关的基因主要为调节 MYB转录
因子、NAC转录因子和过氧化酶，相应调控木质形成的 miＲ-
NA主要为 mir828、mir902 和 mir477。
8854 安徽农业科学 2014 年
表 2 桉树 miＲNA靶基因
miＲNA 靶基因 注释
eca-mir159 Egrandis_v1_0． 043070m 疾病抗性蛋白
eca-mir482 Egrandis_v1_0． 000224m、Egrandis_v1_0． 000510m、Egrandis_v1_0． 000527m、Egrandis_v1_0． 000591m、
Egrandis_v1_0． 001854m、Egrandis_v1_0． 002237m、Egrandis_v1_0． 002250m、Egrandis_v1_0． 002354m、
Egrandis_v1_0． 003327m、Egrandis_v1_0． 008208m、Egrandis_v1_0． 037926m、Egrandis_v1_0． 038137m、
Egrandis_v1_0． 038419m、Egrandis_v1_0． 040406m、Egrandis_v1_0． 040483m、Egrandis_v1_0． 042670m、
Egrandis_v1_0． 042720m、Egrandis_v1_0． 043418m、Egrandis_v1_0． 044434m、Egrandis_v1_0． 045218m、
Egrandis_v1_0． 047202m、Egrandis_v1_0． 047627m、Egrandis_v1_0． 048002m、Egrandis_v1_0． 049456m、
Egrandis_v1_0． 050076m、Egrandis_v1_0． 050489m、Egrandis_v1_0． 051443m、Egrandis_v1_0． 053458m、
Egrandis_v1_0． 053701m 、Egrandis_v1_0． 054047m 、Egrandis_v1_0． 054599m
epe-mir828 Egrandis_v1_0． 055210m、Egrandis_v1_0． 027815m、Egrandis_v1_0． 027399m、Egrandis_v1_0． 027522m、
Egrandis_v1_0． 026690m 、Egrandis_v1_0． 029915m 、Egrandis_v1_0． 026021m
myb转录因子
eca-mir482 Egrandis_v1_0． 005144m、Egrandis_v1_0． 045098m、Egrandis_v1_0． 000471m、Egrandis_v1_0． 000620m、
Egrandis_v1_0． 040848m 、Egrandis_v1_0． 040593m
跨膜受体
egu-mir902 Egrandis_v1_0． 027953m 、Egrandis_v1_0． 024465m 、Egrandis_v1_0． 027529m 、Egrandis_v1_0． 023343m 延长因子
eca-mir477 Egrandis_v1_0． 042449m GＲAS转录因子
eca-mir477 Egrandis_v1_0． 040390m 、Egrandis_v1_0． 042449m
egu-mir902 Egrandis_v1_0． 052596m 、Egrandis_v1_0． 003903m 、Egrandis_v1_0． 054813m 富含亮氨酸蛋白激酶
eca-mir482 Egrandis_v1_0． 001434m 、Egrandis_v1_0． 000521m 、Egrandis_v1_0． 000468m 甘露糖结合凝集素
egu-mir902 Egrandis_v1_0． 009544m 、Egrandis_v1_0． 009572m 、 醛脱氢酶
eca-mir477 Egrandis_v1_0． 040155m 、Egrandis_v1_0． 047140m 过氧化物酶
egu-mir902 Egrandis_v1_0． 006395m 、Egrandis_v1_0． 006255m 、 核糖体结合蛋白
egu-mir902 Egrandis_v1_0． 008248m 、Egrandis_v1_0． 007134m ＲING/U-box 蛋白
eca-mir477 Egrandis_v1_0． 011333m 、Egrandis_v1_0． 040660m UDP糖基转移酶
eca-mir477 Egrandis_v1_0． 011970m bHLH DNA结合蛋白
eur-mir164 Egrandis_v1_0． 014515m 钙依赖的磷酸三酯酶
egu-mir902 Egrandis_v1_0． 005536m 钙调蛋白
eca-mir477 Egrandis_v1_0． 000597m 磷酸酶类蛋白
egu-mir169b Egrandis_v1_0． 028761m 根瘤素类蛋白
egu-mir902 Egrandis_v1_0． 052128m 双生病毒互作蛋白激酶
eca-mir159 Egrandis_v1_0． 022771m 羟乙基噻唑激酶
eur-mir164 Egrandis_v1_0． 022546m 茉莉酮酸酯 ZIM结构域蛋白
eca-mir530 Egrandis_v1_0． 023742m 富含羟脯氨酸糖蛋白家族
eca-mir477 Egrandis_v1_0． 006081m 线粒体转录终止因子
egu-mir902 Egrandis_v1_0． 011554m NAC转录因子
eca-mir159 Egrandis_v1_0． 019635m NAD(P)氧化还原酶
egu-mir169b Egrandis_v1_0． 018565m 核因子
egu-mir169b Egrandis_v1_0． 014559m 果胶裂解酶
egl-mir399 Egrandis_v1_0． 002083m PHO2蛋白
eca-mir477 Egrandis_v1_0． 026672m PLATZ转录因子
eca-mir477 Egrandis_v1_0． 023175m 非 ATP酶调节颗粒
egu-mir902 Egrandis_v1_0． 001305m 视网膜母细胞瘤相关蛋白
eca-mir530 Egrandis_v1_0． 000876m TPＲ3转录抑制蛋白
egl-mir167b Egrandis_v1_0． 046760m 锌载体蛋白
3 结论与讨论
EST序列是从一个随机选择的 cDNA 克隆进行 5’端和
3’端单一次测序获得的短的 cDNA部分序列，目前被广泛应
用于植物 miＲNA预测研究;尤其是对于缺少基因组信息的
物种来说，EST 序列是识别 miＲNA 前体序列的重要途径。
Zhang等先后应用 EST序列分别识别了 60 个物种的 338 条
miＲNA序列［12］和 71个物种的 481条 miＲNA序列［13］。试验
经过对桉属 5种植物的 123 685 条序列进行分析，识别了 19
条不同的 miＲNA序列，识别效率与多数应用 EST序列预测
miＲNA的研究一致。潘玉欣等对花生(Arachis hypogaea)的
研究发现 13条 miＲNA序列［14］;郭强等对马铃薯的研究发现
22条 miＲNA 序列［15］。然而目前在 mirbase 数据库(www．
mirbase． org)中超过 200 条成熟 microＲNA 序列的植物已经
有 13种，miＲNA序列最多的蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)
有 756条，因而应用 EST识别植物 miＲNA 的效率相对是较
低的。这主要可能是由于植物的 miＲNA序列的初级转录产
物很快在 DCL 等蛋白的作用下加工为为成熟的 miＲNA 序
列，从而导致前体序列存在时间较短有关。因而桉树的 miＲ-
NA还有待于进一步的生物信息学挖掘，或通过芯片技术、基
因克隆和小 ＲNA测序等相关实验技术进行识别。
拟南芥和水稻的研究发现其 miＲNA序列的 5’端第 1碱
基尿嘧啶比例最高［13］，而在大豆和亚麻的研究中也发现在
第 1碱基和第 19碱基分别出现频率最高的为尿嘧啶和胞嘧
啶［16 －17］。试验也发现桉树 miＲNA 序列的 5’端第 1 碱基尿
985442卷 15期 李崇奇等 5种桉属植物的 miＲNA生物信息学预测
嘧啶出现频率和第 19 碱基胞嘧啶出现频率都超过了 50%。
目前认为 miＲNA 5’端碱基对于其与选择不同 Argonaute 蛋
白结合形成 ＲISC复合物是至关重要的［18］。
桉树是我国木材产量的重要来源之一，筛选与桉树木质
形成相关的基因具有重要意义。目前认为影响植物木质形
成的转录因子主要包括 AＲF 家族、HD-ZIPIII 家族、KAN 家
族、MYB家族和 NAC 家族［19］;影响木质形成酶主要包括苯
丙氨酸裂解酶、4-香豆酸辅酶 A连接酶、肉桂醇脱氢酶、过氧
化物酶、漆酶和 dirigent 蛋白［20］。试验结果发现，桉树 miＲ-
NA靶基因中与木质形成相关的基因主要为调节 MYB 转录
因子、NAC转录因子和过氧化酶，相应参与调控木质形成的
miＲNA主要为 mir828、mir902和 mir477。Goicoechea等［21］发
现桉树 MYB2可以结合肉桂酰 CoA还原酶基因和肉桂醇脱
氢酶基因的启动子区从而调节其转录水平，并在 MYB2转基
因植物中发现次生细胞壁增厚现象。因而在桉树中 miＲNA
是否为通过影响转录因子的表达水平而影响木质的形成，还
是既调节转录因子又同时调节木质形成相关的酶，还需进一
步研究。
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引物与模板之间的非特异性结合，提高 PCＲ 反应的特异
性［13］。通过试验表明复性温度最好比引物 TM值略低 1 ～ 2
℃，这个温度复性效果比较好。
PCＲ循环数对扩增产物量有明显的影响，选择适宜的循
环次数将会获得良好的扩增图谱。从理论上说，循环次数
少，产物量少;循环次数越多，扩增产物产率越高。但实际
上，次数太多，达到反应平台后，循环不会使产物明显增加，
反而引起非特异性扩增［14］。
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0954 安徽农业科学 2014 年